J Korean Soc Food Sci Nutr 한국식품영양과학회지 46(4), 523~528(2017) https://doi.org/10.3746/jkfn.2017.46.4.523 연구노트 3T3-L1 세포분화중지방축적및활성산소종생성에대한국내산림자원 5 종추출물의효과 최선일 1 이종석 2 이사라 2 이혜진 2 여주홍 2 조봉연 1 이진하 1 김재민 1 정태동 1 최승현 1 김종예 1 강석남 3 이옥환 1 1 강원대학교식품생명공학과 2 국립생물자원관유용자원분석과 3 대구대학교동물자원학과 Effects of Extracts of Five Species of Korean Native Forest Plants on Lipid Accumulation and Reactive Oxygen Species Production during Differentiation of 3T3-L1 Preadipocytes Sun-Il Choi 1, Jong Seok Lee 2, Sarah Lee 2, Hye Jin Lee 2, Joohong Yeo 2, Bong-Yeon Cho 1, Jin-Ha Lee 1, Jae-Min Kim 1, Tae-Dong Jung 1, Seung-Hyun Choi 1, Jong-Yea Kim 1, Suk-Nam Kang 3, and Ok-Hwan Lee 1 1 Department of Food Science and Biotechnology, Kangwon National University 2 Biological and Genetic Resources Assessment Division, National Institute of Biological Resources 3 Department of Animal Resource, Daegu University ABSTRACT This study investigate the effects of extracts of five species of Korean native forest plants on lipid accumulation and reactive oxygen species (ROS) production during the differentiation of 3T3-L1 cells. Our results show that Korean native forest plants extracts significantly reduced lipid accumulation and ROS production during adipogenesis in 3T3-L1 cells. Especially, Rubus coreanus Miq. was most effective in the inhibition of lipid accumulation and ROS production at a concentration of 100 μg/ml. Moreover, Rubus coreanus Miq. extracts significantly inhibited adipocyte differentiation, which is dependent on down-regulation of peroxisome proliferator-activated receptor gamma, CCAAT/enhancer-binding protein alpha, and adipocyte-specific fatty acid binding protein, a key adipogenic transcription factor. Therefore, these results suggest that Rubus coreanus Miq. might be a valuable source of bioactive compounds with anti-adipogenic activity. Key words: 3T3-L1 cell, adipocyte differentiation, lipid accumulation, reactive oxygen species, Korean native forest plants 서 체내지방은모든생리적기관에서필요로하는필수영양소이며, 에너지항상성유지에중요한역할을수행한다. 하지만사회적 경제적발달로인한서구화된식습관과생활습관으로에너지섭취와소비의불균형을초래하여비만 (obesity) 을야기하며, 이러한비만은당뇨, 고혈압, 고지혈증, 동맥경화, 심장병, 뇌졸중등각종대사성질환, 심혈관계질환의직간접적인발병원인으로알려져있다 (1-3). 비만의원인인체내지방의축적은체내지방세포에서분비되 Received 12 January 2017; Accepted 9 February 2017 Corresponding author: Ok-Hwan Lee, Department of Food Science and Biotechnology, Kangwon National University, Chuncheon, Gangwon 24341, Korea E-mail: loh99@kangwon.ac.kr, Phone: +82-33-250-6454 론 는호르몬 (adipokine) 의생산과분비를통하여지방세포의분화가일어나비대 (hypertrophy) 와과형성 (hyperplasia) 으로지방축적이일어나며, 지방질생합성 (lipogenesis) 작용으로생성된지방구축적에의하여유도된다 (4,5). 또한, 지방세포과형성은전지방세포 (preadipocytes) 의증식과분화과정으로인하여유도되는데, 전지방세포에서 dexamethasone(dex), 3-isobutyl-1-methylxanthine(IBMX), insulin 등의자극으로 C/EBPβ, C/EBPγ 초기분화시활성화되며, 이들은상호작용으로 PPARγ 및 C/EBPα의발현을조절한다. 또한, PPARγ와 C/EBPα는분화초기에발현되어지방세포분화에관여하며, 이들은분화후기에는다양한 adipogenic 유전자들의발현을유도한다. 따라서 adipogenesis를억제하는것은항비만연구에있어서중요한타깃으로연구되고있다 (6-8). 최근연구에의하면지방세포내활성산소종 (ROS) 의과도한생성은세포내산화적스트
524 최선일 이종석 이사라 이혜진 여주홍 조봉연 이진하 김재민 정태동 최승현 김종예 강석남 이옥환 레스를유발하게하여생체내의세포막, 단백질, DNA 손상등을일으켜암, 노화등의각종질병을유발할뿐만아니라인슐린저항성을야기하여당뇨의원인으로도밝혀진바있다 (9-11). 나고야의정서로인한국내유전자원의보호를위해유전자원관련전통지식 (traditional knowledge associated with genetic resources) 을확보하려는노력이필요한시점에서국내산림자원중식품원재료 database에등재된원료에대한효능을평가하는것은매우시의적절한연구로생각한다. 본연구팀은전보 (12) 에서국내자생식물 45종을국립생물자원관으로부터제공받아항산화활성등을평가하였다. 현재까지국내산림지역자생식물을이용하여열매를제외한잎, 줄기및잔가지추출물의항비만활성에관한연구는많지않고이를식품가공원료로적용한연구도초기단계에불과하다. 따라서전보 (12) 에서국내산림지역자생식물중항산화활성이우수하였던밤나무 (Castanea crenata Siebold & Zucc.), 진달래 (Rhododendron mucronulatum Turcz.), 산수유 (Cornus officinalis Siebold & Zucc.), 복분자딸기 (Rubus coreanus Miq.), 갈참나무 (Quercus aliena blume) 를선별하여각각의산림자원의잎및잔가지부분을 70% 에탄올로추출하여지방세포분화억제및 ROS 생성억제효능을평가하였다. 재료및방법실험재료및시약본연구에서사용된산림자생식물은 2014년에수집한것으로국립생물자원관에서제공받아사용하였다. 전보 (12) 에서총 45종의추출물의항산화활성을평가한후효능이우수한 5종 ( 밤나무, 진달래, 산수유, 복분자딸기, 갈참나무 ) 을선별하여지방세포분화및 ROS 생성억제실험에사용하였다. 전지방세포 (3T3-L1) 배양및분화에사용된시약으로 penicillin-streptomycin(p/s), insulin, dexamethasone(dex), 3-isobutyl-1-methylxanthine(IBMX), nitroblue tetrazolium(nbt), Oil Red O(ORO), isopropyl alcohol, N-acetyl-L-cysteine(NAC) 은 Sigma-Aldrich Co.(St. Louis, MO, USA) 에서구입하여사용하였다. Dulbecco s modified Eagle s medium(dmem), fetal bovine serum(fbs), bovine serum(bs), phosphate-buffered saline(pbs) 및 trypsin-edta 등은 Gibco(Gaithersburg, MD, USA) 로부터구입하여사용하였다. 추출물제조선별된산림자생식물 ( 밤나무, 진달래, 산수유, 복분자딸기, 갈참나무 ) 의추출물제조는다음과같이각시료 100 g 에 70% 에탄올 1,000 ml를첨가하여침지시킨후실온에서 24시간동안추출하였다. 상기추출과정을 3회반복하고얻어진추출액은모두합하여 filter paper(no. 3, Whatman, Maidstone, UK) 로여과한후회전진공농축기 (N- 3000, EYELA, Tokyo, Japan) 를사용하여감압농축한다음, 동결건조 (Ilshinbiobase Co., Ltd., Yangju, Korea) 하여분말화하였다. 3T3-L1 세포배양및분화마우스유래 3T3-L1 세포는 American Type Culture Collection(ATCC, CL-173, Manassas, VA, USA) 으로부터분양받아사용하였다. 3T3-L1 전지방세포는실험목적에따라 100Φ, 24-well 및 96-well plate에각각 1 10 6 cells/well을 seeding 한후, BS(10%) 및 P/S(1%) 를함유한고농도포도당 DMEM(89%) 에서 100% confluence 될때까지배양하였다. 이로부터 2일후에지방세포분화유도물질 (1 μg/ml insulin, 1 μm DEX, 0.5 mm IBMX) 과 FBS (10%) 및 P/S(10%) 를함유한 DMEM으로전지방세포를지방세포로분화유도하였다. 지방세포분화 (day 0) 시 DMEM 에시료를각각 25, 50 및 100 μg/ml로처리하였고, 양성대조군에는항산화제인 NAC 5 mm을처리하여비교하였다. XTT assay 를이용한세포독성평가 3T3-L1에대한산림자생식물추출물의세포독성평가는 XTT[2,3-bis(2-methoxy-4-nitro-5-sulfophenyl)- 2H-tetrazolium-5-carboxanilide innersalt] assay kit을이용하여측정하였고, microplate reader(spectramax i3, Molecular Devices, Sunnyvale, CA, USA) 를이용하여 450 nm 흡광도값에서 690 nm의흡광도값을뺀결과값으로세포독성을계산하였다 (13). Oil Red O staining 을이용한지방축적량관찰분화과정에따른지방세포내지방축적량을측정하고자각각의시료를처리하여 8일동안분화된 3T3-L1 세포에 10% formalin 용액 500 μl를첨가하여 5분간실온에서방치한뒤제거하고, 동량의 formalin 용액으로분화된 3T3- L1 세포 1시간이상실온에서방치하여 plate에고정시켰다. 60% isopropanol 용액 500 μl로세척하여세포를완전히건조시킨후, 미리제조해둔 Oil Red O working solution(oro : DDW=6:4) 으로세포내축적된지방성분들을충분히염색하였다. 증류수를이용하여세포를 3~4회세척후, 세포내축적된지방성분과결합한 ORO는 100% isopropanol을이용하여모두용출시킨다음 microplate reader를이용하여 490 nm에서흡광도를측정하였다 (14). NBT assay 를이용한 ROS 함량측정분화과정에따른지방세포내 ROS 생성량을측정하고자각각의시료를처리하여 8일동안분화된 3T3-L1 세포에 PBS를이용하여 2회세척후, 0.2% NBT 용액 200 μl를첨가하여 CO 2 incubator에서 90분간반응시킨다음 DMSO 와 1 N KOH를 7:3 혼합용액으로 dark blue formazan을
국내산림자원 5 종의항비만및항산화활성 525 Table 1. Gene specific primer used for RT-PCR PPAR γ C/EBP α ap2 β-actin Sequence CCA GAG TCT GCT GAT CTG CG GCC ACC TCT TTG CTC TGA TC GCA GTG TGC ACG TCT ATG CT AGC CCA CTT CAT TTC ATT GG GAC CTG GAA ACT CGT CTC CA CAT GAC ACA TTC CAC CAC CA ATG GAT GAC GAT ATC GCT GC GCT GGA AGG TGG ACA GTG AG 용출시켰다. 용출물은 microplate reader를이용하여 490 nm에서흡광도를측정하였다 (15). 지방축적과연관된주요유전자발현조사지방세포분화의전사인자의유전자발현을조사하기위하여지방세포에존재하는 total RNA를추출한후, 역전사중합효소 (reverse transcriptase) 를사용하여 cdna(complementary DNA) 를합성하였다. 합성된 cdna와 prime을 PCR(polymerase chain reaction) 로증폭시켜유전자의발현정도를측정하였다. 실험에사용한 primer는 peroxisome proliferator-activated receptor gamma(pparγ), CCAAT/enhancer-binding protein alpha(c/ebpα), adipocyte-specific fatty acid binding protein(ap2), β-actin으로 Table 1과같다. PCR 산물은 2% agarose gel에서전기영동후 UV에서증폭된 DNA band를확인하였고 DNA band는 care stream MI SE(Carestream Health Inc., Rochester, NY, USA) 프로그램을이용하여 band intensity로수치화하여나타내었다. 통계분석모든실험결과는 SAS(ver 9.4, SAS Institute Inc., Cary, NC, USA) 를이용하여통계분석하였다. 유의성분석은 ANOVA 검정을실시하였으며 Duncan의다중범위검정법 (Duncan s multiple rage test) 으로유의성은 P<0.05 수준에서검정하였다. 결과및고찰국내산림자생식물추출물의세포독성지방전구세포에서국내산림자생식물 5종의세포독성평가는 XTT assay 방법을이용하여측정하였다. 국내산림자생식물 5종에탄올추출물은 25, 50 및 100 μg/ml의농도로지방전구세포에처리하였으며, 모든농도의추출물에서세포내독성을보이지않았고현미경상에서 morphology의변화도관찰되지않았다 (Fig. 1). 따라서본연구에서는국내산림자생식물 5종추출물을 25, 50 및 100 μg/ml의농도로지방전구세포에처리하여지방세포분화 Fig. 1. Effects of ethanol extracts of 5 species in Korean native forest plants on cell viability. Cell viability was measured by XTT assay. The exponentially growing cells were plated into 96-well plates at a density of 1 10 6 cells/well in DMEM/BS medium and incubated for 24 h prior to treatment at 37 C in 5% CO 2. Cells were divided into a control group and a treatment groups. Each value is the mean±sd. Bars with different letters indicate statistically significant differences among groups at P< 0.05 by one-way ANOVA. 억제및 ROS 생성저감효능평가를실시하였다. 3T3-L1 분화과정중국내산림자생식물추출물의분화억제효과 3T3-L1 세포분화억제효능을확인하기위하여중성지방만을붉은색으로염색하는 Oil Red O 염색법을통해 3T3-L1 지방세포내생성된중성지방의양을측정하였으며, 그결과는 Fig. 2와같다. 국내산림식물 5종을처리한 50 및 100 μg/ml 군에서모두대조군보다지방세포분화과정에서의지질축적이감소하는경향을나타내었다. 그중밤나무, 산수유, 복분자딸기추출물 (100 μg/ml) 을처리한지방세포에서대조군 (100% 기준 ) 보다각각 50, 57 및 7% 수준의지방만이축적되어양성대조군으로사용된 NAC (17) 와유사한수준의효능을보였다. 복분자딸기추출물의경우저농도 (50 μg/ml) 로처리한지방세포에서지방축적량 55% 수준으로나타나높은분화억제효능을나타내었다. 이러한결과는 Jung 등 (18) 의연구에서보고된바와같이복분자딸기를처리한지방세포는세포내지방축적을억제하였다는연구결과와유사한경향을보였다. 3T3-L1 분화과정중국내산림자생식물추출물의 ROS 생성억제효과 NBT assay는 NBT 용액이지방세포내에축적된 ROS와반응하여 dark blue formazan을생성하게되며, 이를용출하여세포내 ROS의생성량을알수있다. 3T3-L1 분화과
526 최선일 이종석 이사라 이혜진 여주홍 조봉연 이진하 김재민 정태동 최승현 김종예 강석남 이옥환 Fig. 2. Effect of the ethanol extracts of 5 species in Korean native forest on lipid accumulation in 3T3-L1 cells during the adipogenesis. CON, control cells which were differentiated with MDI; NAC, positive control cells which differentiated with MDI in the presence of NAC. All values are presented as the mean±sd. Bars with different letters indicate statistically significant differences among groups at P<0.05 by one-way ANOVA. 정 중 국내 산림자생 식물 추출물의 ROS 생성 억제 효과를 민 C와 E 같은 항산화성 비타민이 다량 함유되어 있으며, 확인하기 위하여 시료를 농도별(25, 50, 100 μg/ml)로 처 안토시아닌과 폴리페놀 등과 같은 ROS를 소거할 수 있는 리하면서 분화를 유도하였으며, 이때 생성되는 ROS를 NBT bioactive compound의 함량이 높아 지방세포 분화 시 생성 assay를 통해 평가하였다(Fig. 3). 국내 산림 식물 5종을 되는 ROS도 유의적으로 억제할 수 있을 것으로 판단된다. 처리(50 및 100 μg/ml)한 모든 지방세포에서 대조군보다 ROS 생성이 억제되는 경향을 보였다. 그중 밤나무, 산수유, 지방세포의 분화 관련 유전자 분석 복분자딸기 추출물을 처리한 지방세포에서 지방세포 분화 PPARγ 및 C/EBPα는 지방세포에서 나타나는 특이적인 억제 효능과 마찬가지로 ROS 생성 저감 효과도 우수한 것으 전사인자로서 전구지방세포에서 지방세포로 분화 시 ap2와 로 나타났다. Lee 등(19)의 연구에서 복분자딸기에는 비타 같은 adipogenic protein 발현을 유도한다(20). 국내 산림 Fig. 3. Effect of the ethanol extracts of 5 species in Korean native forest on reactive oxygen species (ROS) production in 3T3-L1 cells during the adipogenesis. CON, control cells which were differentiated with MDI; NAC, positive control cells which differentiated with MDI in the presence of NAC. All values are presented as the mean±sd. Bars with different letters indicate statistically significant differences among groups at P<0.05 by one-way ANOVA.
국내산림자원 5 종의항비만및항산화활성 527 Fig. 4. mrna expressions of adipogenic transcription factors in Rubus coreanus-treated 3T3-L1 adipocyte. Rubus coreanus were pretreated without or with different concentrations and 5mM NAC. Graphs represent mrna expression of PPAR-γ, C/EBP-α and ap2 were measured by RT-PCR and quantitative RT-PCR after normalization to β-actin mrna. All values are presented as the mean±sd. Bars with different letters indicate statistically significant differences among groups at P<0.05 by one-way ANOVA. 자생식물중가장효과가우수한복분자딸기추출물에대한 PPARγ, C/EBPα 및 ap2의유전자발현을분석한결과 Fig. 4와같다. 복분자딸기추출물을 3T3-L1 세포에농도별 (25, 50, 100 μg/ml) 로처리하여 PPARγ, C/EBPα 및 ap2의유전자발현억제효능을평가하였다. 3T3-L1 세포에아무것도처리하지않은대조군과비교한결과, 양성대조군으로처리한 NAC는 3T3-L1의분화과정중 PPARγ, C/EBPα 및 ap2의유전자발현억제하는것으로나타났다. 100 μg/ ml의농도로복분자딸기추출물을처리한지방세포에서는 PPARγ, C/EBPα 및 ap2 발현이대조군보다각각 0.3, 0.7 및 0.6 수준으로발현이억제되는경향을볼수있었다. 복분자딸기에함유된 cyanidin-3-glucoside는항산화활성, 항암, 항염증효능을나타낸다고알려져있다 (21). 또한, Wei 등 (22) 의연구에서 Cy-3-g를당뇨모델마우스에공급시중성지질대사개선및항비만효능을나타낸다고보고하였다. 이와같은이유로인하여본연구에사용된국내산림식물추출물 5종중복분자딸기추출물에서가장높은항비만활성을보인것으로생각한다. 요약 산수유, 복분자딸기, 갈참나무 ) 에대한지방세포분화억제및활성산소종 (ROS) 생성억제효능을평가하였다. 지방세포분화중세포내지방축적및 ROS 생성량을비교한결과, 국내산림식물 5종모두지방축적량및 ROS 생성량을농도유의적으로감소키는것으로나타났다. 특히복분자딸기추출물을처리한지방세포에서지방축적및 ROS 저감에가장크게나타났으며양성대조군으로사용된 N-acetyl-Lcysteine과유사한결과를나타내었다. 또한, 복분자딸기추출물을처리함으로써지방세포의분화를조절하는전사인자인 PPARγ, C/EBPα 및 ap2 발현이억제됨을확인하였다. 국내산림식물 5종추출물은천연물에서유래한항비만및항산화활성기능성식품소재로활용가능할것으로생각한다. 감사의글본연구는정부 ( 환경부 ) 의재원으로국립생물자원관 (NIBR 201528101) 및 2016년도강원대학교전임교원기본연구비지원사업 (520160437) 에서지원받아수행되어이에감사드립니다. 본연구는국내산림자생식물추출물 5 종 ( 밤나무, 진달래,
528 최선일 이종석 이사라 이혜진 여주홍 조봉연 이진하 김재민 정태동 최승현 김종예 강석남 이옥환 REFERENCES 1. Spiegelman BM, Flier JS. 2001. Obesity and the regulation of energy balance. Cell 104: 531-543. 2. Kwon OJ. 2016. Anti-adipogenic effect of Mori Follium extract in 3T3-L1 cells. Kor J Herbol 31: 47-53. 3. Marcelin G, Chua S Jr. 2010. Contributions of adipocyte lipid metabolism to body fat content and implications for the treatment of obesity. Curr Opin Pharmacol 10: 588-593. 4. Berry R, Jeffery E, Rodeheffer MS. 2014. Weighing in on adipocyte precursors. Cell Metab 19: 8-20. 5. Attie AD, Scherer PE. 2009. Adipocyte metabolism and obesity. J Lipid Res 50: S395-S399. 6. Liu F, Kim JK, Li Y, Liu XQ, Li J, Chen X. 2001. An extract of Lagerstroemia speciosa L. has insulin-like glucose uptake-stimulatory and adipocyte differentiation-inhibitory activities in 3T3-L1 cells. J Nutr 131: 2242-2247. 7. Rosen ED, Hsu CH, Wang X, Sakai S, Freeman MW, Gonzalez FJ, Spiegelman BM. 2002. C/EBPα induces adipogenesis through PPARγ: a unified pathway. Genes Dev 16: 22-26. 8. Kim KH. 2009. Perspective in regulation of adipogenesis by bioactive food components. Food Science and Industry 42(4): 51-57. 9. Lee OH, Kwon YI, Hong HD, Park CS, Lee BY, Kim YC. 2009. Production of reactive oxygen species and changes in antioxidant enzyme activities during differentiation of 3T3-L1 adipocyte. J Korean Soc Appl Biol Chem 52: 70-75. 10. Valko M, Leiibfritz D, Moncol J, Cronin MTD, Mazur M, Telser J. 2007. Free radicals and antioxidants in normal physiological functions and human disease. Int J Biochem Cell Biol 39: 44-84. 11. Gardner PR, Fridovich I. 1991. Superoxide sensitivity of the Escherichia coli aconitase. J Biol Chem 266: 19328-19333. 12. Cho ML, Lee JS, Lee S, Son YK, Bae CH, Yeo J, Lee HS, Ma JG, Lee OK, Kim JY. 2015. Antioxidant activity of 11 species in Korean native forest plants. Korean J Food Nutr 28: 1098-1106. 13. Furukawa S, Fujita T, Shimabukuro M, Iwaki M, Yamada Y, Nakajima Y, Nakayama O, Makishima M, Matsuda M, Shimomura I. 2004. Increased oxidative stress in obesity and its impact on metabolic syndrome. J Clin Invest 114: 1752-1761. 14. Lee OH, Seo MJ, Choi HS, Lee BY. 2012. Pycnogenol inhibits lipid accumulation in 3T3-L1 adipocytes with the modulation of reactive oxygen species (ROS) production associated with antioxidant enzyme responses. Phytother Res 26: 403-411. 15. Lee YJ, Yoon BR, Choi HS, Lee BY, Lee OH. 2012. Effect of Sargassum micracanthum extract on lipid accumulation and reactive oxygen species (ROS) production during differentiation of 3T3-L1 preadipocytes. Korean J Food Preserv 19: 455-461. 16. Oh JW, Lee JH, Lee OH, Kim KH, Kim HR, Lee HK. 2015. Effect of hot water and ethanol extracts from Nelumbo nucifera Gaertner flower on lipid accumulation and reactive oxygen species (ROS) production in adipogenesis of 3T3- L1 cells. Korean J Food Preserv 22: 744-750. 17. Calzadilla P, Sapochnik D, Cosentino S, Diz V, Dicelio L, Calvo JC, Guerra LN. 2011. N-Acetylcysteine reduces markers of differentiation in 3T3-L1 adipocytes. Int J Mol Sci 12: 6936-6951. 18. Jung MA, Cho SH, Lee SY, Kim JH, Oh K, Kim YS, Yoo GS, Lee DW, Kim S. 2014. Effects of unripe Rubus coreanus Miquel extract on improvement of lipid metabolism in C57BL/6 mice fed a high-cholesterol diet. J Korean Soc Food Sci Nutr 43: 650-655. 19. Lee SM, You Y, Kim K, Park J, Jeong C, Jhon DY, Jun W. 2012. Antioxidant activities of native Gwangyang Rubus coreanus Miq.. J Korean Soc Food Sci Nutr 41: 327-332. 20. Cowherd RM, Lyle RE, McGehee RE Jr. 1999. Molecular regulation of adipocyte differentiation. Semin Cell Dev Biol 10: 3-10. 21. Choung MG, Lim JD. 2012. Antioxidant, anticancer and immune activation of anthocyanin fraction from Rubus coreanus Miquel fruits (Bokbunja). Korean J Med Crop Sci 20: 259-269. 22. Wei X, Wang D, Yang Y, Xia M, Li D, Li G, Zhu Y, Xiao Y, Ling W. 2011. Cyanidin-3-O-β-glucoside improves obesity and triglyceride metabolism in KK-Ay mice by regulating lipoprotein lipase activity. J Sci Food Agric 91: 1006-1013.