- DNA 정제후클로닝을위한효소적절단과연결필요 -> restriction enzyme, ligase 가중요 1. DNA 조작효소범위 - 촉매반응에따라 5 분류 1. Nuclease : 핵산분자의절단, 단편화 2. Ligase : 핵산분자의연결 3. Polymerase : DNA 사슬합성 4. Modifying enzyme : 화학기능기의첨가, 제거 5. Topoisomerase : closed circle DNA에 supercoiling 도입, 제거 1) Nuclease - phosphodiester 결합가수분해 - exonuclease : DNA 분자의말단에서 nucleotide 하나씩제거 - endonuclease : DNA 분자내부에서절단
nucleases - exonuclease vs endonuclease
exonucleases - Bal31 : - 이중가닥의양가닥분해 - Alteromonas espejiana - 생성물 : 짧아진 DNA 단편 - exonuclerase III : - 이중가닥의한가닥만절단 - E. coli - 생성물 : 한가닥 DNA
endonucleases -S1 endonuclease - 한가닥만을절단 - Aspergillus oryzae - 생성물 : 짧아진 DNA 단편 -DNaseI: - 한가닥, 이중가닥분자모두절단 - 암소췌장에서분리 - DNA 내부의어떠한 phophsdiester 결합도공격 - mononucleotide, 아주짧은 oligonucleotide의혼합물생성 - 제한효소 - 제한된숫자의특별한인식부위만절단
2) Ligase - 불연속의한가닥 DNA 파손을복구
3) Polymerase - primer가있을때만작용 - 네가지종류의 polymerase (1) DNA pol-i -E. coli - 짧은한가닥지역 ( 혹은 nick) 에서새로운가닥합성 - polymerase 와 nuclease의이중역할 - 각활성은효소분자의다른부분에의해통제 (2) Klenow fragment - DNA pol-i의첫 323 아미노산제거 - nuclease 활성없음 - nick 의채움만가능 (3) Taq polymerase - Thermus aquaticus(thermophilic bacteria) -PCR에이용 (4) Reverse transcriptase - RNA를 template로이용상보적 DNA 합성 -> cdna
4) DNA 변형효소 - 특별한화학기를첨거하거나제거함으로 DNA 분자를변형 (1) alkaline phosphatase : DNA 분자의 5 말단에존재하는인산기제거 (2) polynucleotide kinase : alkaline phosphatase 의반대역할 (3) terminal deoxynucleotidyl transferase : DNA 분자의 3 말단에하나그이상의 deoxynucleotide 첨가
2. DNA 절단효소들 : restriction enzyme - 유전자클로닝을위해 DNA 분자의정확하고재현성있는절단이필요 - 각벡터분자는새로운 DNA 삽입을위해하나의위치에서절단되어야함 - 각벡터분자는정확하게같은위치에서절단되어야함 - 클로되는 DNA분자는대형 DNA 분자로부터최소한의크기로절단되어야함
1) 제한효소의발견 - bacteriophage에면역성을갖는 bacteria 발견 - phage DNA 복제완료전 bacteria 가 phage DNA 파괴 - 자신의 DNA에는절단효소의활동을막는부가적 methylation 존재 - 대부분의 bacteria에의해효소생성-> 1200종이상발견 - type I, I, III -> type II : 유전자클로닝에가장중요
2) Type II 제한효소 - 각효소는 DNA 분자절단에필요한특별한 recognition sequence (restriction site, RS) 필요 - 대부분제한효소는 hexanucleotide RS를인식 -> 4, 5, 8 개로이루어진것도존재 - a family of related sites의어느하나의 DNA를절단하는경우도있음 -> HinfI, GANTC
3) Blunt end vs Sticky end - RS의이중가닥절단 -> blunt end 형성 - RS 내둘혹은네개의 nucleotide를엇갈리게절단 -> sticky end 형성 - 서로다른 RS를가진제한효소가동일한 sticky end를만들수있음 -> 서로다른 DNA 단편이연결가능
4) DNA 분자에서인식염기배열의빈도수 - RS는 DNA 분자를따라균등한간격으로나열돼있지않음 - 실험적인방법으로숫자를파악
5) 실험실에서제한효소에의한절단 ex) Bgl II로 λ phage DNA 절단 - 효소활성에필요한조건충족필요 -ph 7.4 - 이온강도 (NaCl 농도 ) -Mg +2 : 모든형태의 type II 효소활성에필수 - 효소안정제 : DTT 등 - 효소에맞는 buffer용액사용필수 - 효소농도 : 처리하려는 DNA 농도에따라결정 - 1unit -> 1시간당 1µg DNA 절단에필요한양 - 항온온도 : 일반적으로 37 -반응완료후enzyme killing -70 가온 - 페놀추출 -EDTA 처리 : Mg +2 이온 chelation
6) 제한효소절단결과의분석 (1) gel electrophoresis에의한부자들의분리 - DNA 상의음전하를이용 gel 상에서전기영동으로이동 - agarose, polyacryl amide (2) 젤상에서 DNA 분자확인 - EtBr 염색후자외선조사 -> 25ng 이상의농도에적당 - 32 P 동위원소이용 film에노출
방사성표지법 - nick translation : DNA Pol I 이용 - 대부분의정제된 DNA에절단분자약간포함 - end-filling 법 : sticky end를가진 DNA에표지 - Klenow fragment 이용
7) DNA 분자크기측정 - 이동거리를분자량과연결 D = a b(logm), D: 이동거리, M: 분자량 - 표준제한절단단편이용 ex) λphage 의 Hind III 절단 -> 8 단편으로절단
8) DNA 분자의다른제한부위위치확인 - 제한지도를이용하여어떤제한효소가각유전자를포함하는 DNA 단편을얻을수있는가를확인
3. Ligation DNA 분자의결합 - ligation : 벡터분자와클론DNA의결합 - 인접하는두 nucleotide 사이의 phosphodiester 형성 - ligase의활성기작 - 단가닥불연속의복원 - 두개의 DNA 분자결합 - 같은분자의양끝을결합 - sticky end는 ligation 효율을높힘 -> 두말단의 contact chance가높아짐 -> blunt end의경우고농도 DNA를사용해야함
Blunt end 분자의결합 - 벡터분자 : enzyme에의한 sticky end 보유용이 - cloned DNA의경우일반적으로 blunt end를가짐 - blunt end에 sticky end 도입을위한방법 3가지 1) Linker 이용 -linker: 알려진sequence를갖는짧은dsDNA 단편 - linker 내에 restriction site 포함 - ligase를이용 blunt end에부착 - cloned DNA 내에동일 RS를가질때는?
2) Adaptor 이용 - adaptor : sticky end 를갖는짧은 ds DNA 단편 - adaptor 분자사이의 dimer 형성 -> blunt end 형성 - adaptor 분자의 5 end 를 OH 로변형 -> ligase 에의한연결불가 -> DNA 분자에 adaptor 연결후 polynucleotide kinase 처리 -> 5 -P 로변형
3) Homopolymer tailing 이용 - terminal transferase : blunt end에 poly(dn) tail 붙임 - 벡터와 DNA에상보적 tailing 부착 - 두 tailing의사이즈가다를수있음 - Klenow polymerase -> ligase 처리로연결 - tail size 20개이상일경우안정한염기쌍형성 -> 숙주내효소에의한연결도가능