Original Article http://dx.doi.org/10.3947/ic.2012.44.1.5 Infect Chemother 2012;44(1):5-10 pissn 2093-2340 eissn 2092-6448 Infection & Chemotherapy Infrequent-Restriction-Site 중합효소연쇄반응 (ISR-PCR) 을사용한지역사회발생 Extended Spectrum Beta-Lactamase (ESBL) 생성대장균 (Escherichia coli) 의분자역학적분석및 Pulsedfield gel electrophoresis (PFGE) 와의비교 변지현 1 유진홍 2 * 박철민 3 이동건 2 박선희 2 최수미 2 최정현 2 김시현 2 권재철 2 가톨릭대학교의과대학일반대학원생명의과학과 1, 내과학교실 2, 가톨릭대학교의과학연구원 3 Molecular Epidemiologic Analysis of Community- Onset Extended Spectrum Beta-Lactamase (ESBL) Producing Escherichia coli Using Infrequent-Restriction-Site Polymerase Chain Reaction (IRS-PCR) with Comparison by Pulsed-Field Gel Electrophoresis (PFGE) Background: We evaluated the ability of infrequent restriction site-polymerase chain reaction (IRS-PCR) to perform molecular epidemiologic analysis of Community- Onset Extended Spectrum Beta-Lactamase (ESBL) producing Escherichia coli, and also assessed the use of PFGE as an alternative method. Materials and Methods: IRS-PCR assay was performed using combinations of adaptors for XbaI and HhaI restriction sites on clinical isolates of E. coli (n=51). We compared the discriminatory power, quality and efficiency of IRS-PCR to PFGE. Results: In E. coli, PFGE discriminated 39 (76.4%) and IRS-PCR discerned 41 (80.3%) of the total 51 strains. It took much less time to complete IRS-PCR (one day) than PFGE (at least 4 days). Conclusions: IRS-PCR is a more sensitive and rapid alternative to PFGE for molecular epidemiologic analysis of E. coli. Ji-Hyun Byun 1, Jin-Hong Yoo 2 *, Chulmin Park 3, Dong- Gun Lee 2, Sun-Hee Park 2, Su-Mi Choi 2, Jung-Hyun Choi 2, Si-Hyun Kim 2, and Jae-Cheol Kwon 2 Department of Biomedical Science, The Catholic University of Korea, Graduate School 1, Department of Internal Medicine 2, College of Medicine, and Catholic Research Institutes of Medical Science 3, The Catholic University of Korea, Seoul, Korea Copyright 2012 by The Korean Society of Infectious Diseases Korean Society for Chemotherapy Key Words: ESBL-producing E. coli, Pulsed-field gel electrophoresis (PFGE), Infrequent restriction site-polymerase chain reaction (IRS-PCR), Genotyping 서론 최근전세계적으로 Escherichia coli 에서 ESBL 을생산하는균주가매년증가하며, 특징적으로 CTX-M type ESBL 을생성하는 E. coli 가지역사회에서매우증가된다고보고되었다 [1-4]. 또한, ESBL 생성 E. coli 균혈증중약 19% 는지역사회에서획득된것으로보고된바있으며, E. coli 에서대부분 CTX-M type ESBL 을가지고있고다제내 Submitted: July 7, 2011 Revised: December 14, 2011 Accepted: January 11, 2012 Correspondence to Jin-Hong Yoo Division of Infectious Disease, Department of Internal Medicine, Bucheon St. Mary s Hospital, 2 Sosa-dong, Wonmi-gu, Bucheon 420-717, Korea Tel: +82-1577-0675, Fax: +82-32-340-2669 E-mail: jhyoo@catholic.ac.kr www.icjournal.org
6 JH Byun, et al. IRS-PCR on E. coli www.icjournal.org 성을나타낸다. CTX-M ESBL 유전자는 mobile genetic element 와연관되어지역사회에서 ESBL 이쉽게전파할수있다 [5, 6]. 병원균의역학적분석을하기위한방법으로는항생제감수성양상, phage 형별등의표현형별방법과 DNA 혹은 RNA 수준에서분석하는분자역학적형별 (genotyping) 방법을사용하는데, 정확도나재현성, 변별력등의면에서후자가더널리사용되고있다. 이들중 pulsedfield gel electrophoresis (PFGE) 법은분자역학분석법에서표준법으로사용되고있다. 그러나 PFGE 는재현성과, 정확도면에서장점을갖고있지만시간적및경제적부담이많아실제적으로사용이어려운실정이다 [7]. 이와비교하여, 시간과노력이덜소요되면서도분자역학적형별을할수있도록 DNA 나 RNA 를증폭하는중합효소연쇄반응을이용한방법들이많이개발되어왔다. 이러한기법들중에서 Infrequent-Restriction-Site Polymerase Chain Reaction (IRS-PCR) 법은 Mazurek[8] 에의하여개발된유전자 typing 방법중하나로, 재현성과변별력이높아서새로운대안의가능성을시사하고있다. 기존의 PCR typing 과다른점으로는 infrequent 및 frequent cutter 두가지의제한효소를함께사용하며, 각효소에해당하는 adaptor 와 linker 를 primer 와함께사용하여필요한부위만을선택적으로증폭하는것이다 [9]. 현재 IRS-PCR 분석은 Vibrio vulnificus, Candida tropicalis, Legionella pneumophila 등의일부역학적연구에시도된바있으며 [10-13], 국내에서는주로우리연구진에서연구해왔다 [14, 15]. 이에본연구자는 ESBL 의유전자형분석을포함한분자역학적연구를시행하였으며, 병원균형별에 PFGE 와 IRS-PCR 방법의적용을최적화하였다. 또한기존 IRS-PCR 방법대로시행한경우보다더높은재현성과검출률을얻기위하여 adaptor, primer 등을갱신하였고성적면에서개선을할수있음을병원감염에중요한 E. coli 를대상으로하여검증하였다. 재료및방법 1. 대상균주 2009 년 3월부터 6개월간대전성모병원에서 E. coli 에의한혈류감염환자들을대상으로분리동정된 ESBL 생성 E. coli 를전향적으로수집하였고, 2008 년 9월부터 2009 년 2월까지동일병원에서분리수집된 ESBL 생성 E. coli 균주를포함하여연구하였다. 2. Pulsed field gel electrophoresis (PFGE) 균주를 LB에접종하여 37 로 24시간배양하였고. OD값을 (absorbance; 610/0.3) 측정하였다. microcentrifuge tube 에 1 ml씩취하여, 14,000 rpm에서 5분원심분리를하였다. 그뒤 TE buffer (TE; 10 mm Tris, 1 mm EDTA [ph8.0]) 로 2번정도 washing 을한후, CSB (Cell Suspension Buffer; 100 mm Tris, 100 mm EDTA [ph8.0]) 50 ul를취하고, proteinase 5 μl 와 pipeeting 을한뒤, 37 에 10 분간두었다. 세균부유액 50 μl 와 50 에보존한 1% agarose 를 4 에서 10 분간굳혔다. Agarose plug 를 CLB (Cell Lysis Buffer; 50 mm Tris, 50 mm EDTA [ph8.0]) 500 μl 에넣고 54 에서 24시간에서반응시켰다. DNA Plug 은 XbaI (Biolad; Ro145S) 으로 37 에서 2-4 시간처리하였고, CHEF-DR III system (BioRad Lab., Hercules, CA, USA) 을이용하여 swithching time 을시작 1초, 끝 3초로하고 6 V/cm 의조건으로 24시간전기영동하였다. 전기영동이끝난후 0.5 μg/ml ethidium bromide 로 30분간염색한뒤 20분간탈색하고자외선조영하에서 Gel Doc 로촬영하였다. 분석은 Fingerprinting II informatix 3.0 software (BioRad Lab, Hercules, CA, USA) 를이용하여 UPGMA (unweighted pair-group method using arithmetic averages) 법으로군집분석하여유전적연관성을결정하였다. 3. IRS-PCR (Infrequent-Restriction-Site) PCR DNA 분리는 QIAamp DNA Kit (QIAGEN, USA) 를사용하였다. adaptor 는 HhaI adaptor (AH1 & AH2 또는 AH1 & AH2_new) 와 XbaI adaptor 인 (AX1 & AX2 또는 AX1 & AX2_new) 를사용하였다 (Table 1). adaptor 는각 oligonucleotide 조합을균등하여 AH 와 AX 각 각을 10 μl 씩같은 molar 농도로혼합하여 80 에서 4 로냉각시켜만 든후, -20 로보관하였다. 기존논문에사용된 adaptor 의 Tm 값과이번연구에새로변형한 adaptor 의 Tm 값을 Fast PCR 을이용하여비교하였다. 이번연구에서는 새로변형한 adaptor 의안정성을높이고, PCR 과정의선택성을높이기위하여 oligonucleotide 는 GC % 가 50-60% 이상으로하여 Tm값이상향조정된 oligonucleotide 를새로설계하였고, Fast PCR 을이용하여 PCR quality 를높였다. 추출된 DNA 5 μl 를 HhaI (Boehringer Mannheim, Germany) 10 unites 및 XbaI (Boehringer Mannheim, Germany) 12 units 의용량으로 37 에서 16 시간동안처리하였다. 그후잘라진 DNA 5 μl, HhaI adaptor (AH1 & AH2 또는 AH1 & AH2_new) 20 pmol, XbaI adaptor (AX1 & AX2 또는 AX1 & AX2_new) 20 pmol, DNA 희석 buffer (5X) 2 μl 를혼합하여 ligation Kit (Rapid DNA ligation Kit, Boehringer Mannheim) 를사용하여 ligation 하였다. 이렇게준비된혼합물을중합효소연쇄반응으로증폭하였다. 혼합물은 template DNA 2 μl, 10X PCR buffer 10 μl, dntp mixture (2.5 mm each) 2 μl, PX primer 50 pmol, AH1 primer 50 pmol, Table 1. Adaptors and Primers used in the Infrequent-Restriction-Site Polymerase Chain Reaction Designation Sequence AH1... 5'-AGA ACT GAC CTC GAC TCG CAC G-3' AH2... 5 -TGC GAG T-3 AH2_new a... 5'-CTG GAG CTG AGC GT-3' This study AX1.. 5 - PO4-CTA GTA CTG GCA GAC TCT-3' AX2.. 5 -GCC AGT A-3 AX2_new a... 5'-AT GAC CGT CTG-3 This study PX... 5 -AGA GTC TGC CAG TAC TAG A-3 PX-G... 5 -AGA GTC TGC CAG TAC TAG AG-3 a Newly designed for this study.
www.icjournal.org http://dx.doi.org/10.3947/ic.2012.44.1.5 Infect Chemother 2012;44(1):5-10 7 Taq DNA polymerase diluent 5 μl 로구성하여 PCR 반응액을만들었다. 증폭반응은초기 denaturation 단계는 95 에서 15 분간시행하고, denaturation 94 1분, annealing 58 1분, extension 72 2분으로, 25회시행한후마지막 extension 은 72 10 분으로하였다. PCR 산물은 6.5% polyacrylamide gel 에서 170 V로 1시간동안실시하고, 전기영동이끝난 gel 은 ethidium bromide 로염색하여 UV광조영으로사진을촬영하였고, 결과는군집분석을통해 dendrogram 을작성하여비교하였다. 을하였다. 그래서 adaptor 의안정성을좀더높이기위하여 oligonucleotides 의 GC% 를 50-60% 이상으로하고, Tm값을각각 51.4 와 37.4 로상향되도록새로설계하였고, 이들을 AH2_new, AX2_new 라고명명하였다. Tm값을높여새롭게설계한 adaptor 로 IRS-PCR 을실시한결과, PCR 의증폭산물이안정적으로증폭되었다 (Fig. 2D). 또한 adaptor 상의문제뿐만아니라, ligation 온도의차이를검토하였는데, 다른반응온도조건으로 IRS-PCR 을실시하였다. 실온의조건에서는반응이잘이루어지지않았으나 (Fig. 3A), 16 에서 ligation 을실시하였을때더욱 PCR 결과가안정되었다 (Fig. 3B). 결과 1. 항생제감수성결과총 51 개균주감수성결과 aztreonam 는 88.2% (45/51), ceftazidime 는 62.7% (32/51), amikacin 는 26.6% (4/51) 의내성이있는것으로분석되었다. 나머지 ampicillin-sulbactam, cefepime, cefotaxime, ceftriaxone, ciprofloxacin, gentamicin, imipenem, levofloxacin, meropenem, piperacillin-tazobactam, ticarcillin-clavulanate, tobramycin, trimethoprim-sulfamethoxazole 에서는내성이보이지않았다. 또한각항생제내성패턴들을 PFGE 및 IRS-PCR 그룹들과비교하였으나, 연관성을찾기어려웠다. A B C 1 2 3 4 5 1 2 3 4 5 1 2 3 4 5 2. IRS-PCR 방법의개선 Mazurek 등과 Handley 등이사용한 adaptor 의 Tm값을확인해본결과 AH2의경우 20.6, AX2의경우 14.3 로측정되었다 [8, 16]. Tm 의값이낮으면 adaptor 의결합이불안정하여 PCR 결과의재현성이매우불안정하였다 (Fig. 2A, 2B, 2C). 실험의재현성이확보하기위해 Tm값을높여가며, 여러번반복 D 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 Figure 1. Representative Pulsed-Field Gel Electrophoresis (PFGE) images of ESBL Escherichia coli isolates. Lanes 3 to 6 and 8 to 11 were BL430, BL435, BL440, BL441, BL442, BL443, BL446, BL447, BL448, BL450, and BL451, respectively. Markers were in lanes 1, 7 and 14 (50-1,000kb ladders). Figure 2. Electrophoretic results of IRS-PCR amplification of restricted-ligated XbaI-HhaI fragments from ESBL strains. (A) Lane 1 was 100-bp ladder. Lanes 2 through 5 were isolates of BL99, BL101, BL102 and BL105, respectively. Clinically isolated strains used adaptors (AH1 and AX2) and primer PX-G. Tm; 20.6, 14.3. (B) Lane 1 was 100-bp ladder. Lanes 2 through 5 were isolates of BL99, BL101, BL102 and BL105, respectively. Clinically isolated strains used adaptors (AH1 and AH2) and primer PX-G. Tm; 32.6, 27.3. (C) Lane 1 was 100-bp ladder. Lanes 2 through 5 were isolates of BL99, BL101, BL102, and BL105, respectively. Clinically isolated strains used adaptors (AH1_new and AH2_new) and primer PX-G. Tm; 51.4, 37.4. (D) Representative IRS-PCR electrophoresis patterns of eight ESBL E. coli isolates. Lanes 2 through 9 were BL99, BL101, BL102, BL105, BL107, BL114, BL116 and BL117, respectively. Lanes 1 and 10 were 100bp ladders. The IRS-PCR annealing temperature was 58, and the primers were PX-G, AH2_new and AX2_new.
8 JH Byun, et al. IRS-PCR on E. coli www.icjournal.org 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 A B Figure 3. IRS-PCR electrophoretic patterns of ESBL E.coli produced by amplification of restrictedligated XbaI-HhaI fragments. (A) Lane 1 and 10 were 100bp ladders. Lanes 2 through 9 were isolates BL99, BL101, BL102, BL105, BL107, BL114, BL116 and BL117, respectively. Clinically isolated strains used adaptors (AH2_new and AX2_new) and primer PX-G. Room temperature ligation performed at 20-25. (B) Lane 1 and 10 were 100bp ladders. Lanes 2 through 9 were isolates BL99, BL101, BL102, BL105, BL107, BL114, BL116 and BL117, respectively. Clinically isolated strains used adaptors (AH2_new and AX2_new) and primer PX-G. Room temperature ligation performed at -16. 3. PFGE IRS-PCR 결과와의비교 E. coli 의 PFGE 와 IRS-PCR 의결과는 Fig. 1, 2(D) 에도시되었으며, dendrogram 을통한군집분석결과는 Fig. 4과같았다. 전반적으로 PFGE 와 IRS-PCR 에의한형별은변별력면에서거의일치하였다. Table 2에서도시된바와같이, PFGE 에서 27 형으로분류된 strain BL131, BL139 은 IRS-PCR 에서는각각 27, 28 형으로다른형별로분류되었다. 이들은 band 수 2개의차이를보이고있었다. PFGE 는형별상 31 형로분류된 BL107 과 BL142 는 IRS-PCR 에서 32, 33 형으로다른것으로나왔던반면, strain BL114 처럼 PFGE 에서 32 형로분류된균주는 IRS-PCR 에서는 32로, PFGE 형별 31 인 strain BL107 과동일한것으로나와, 양방법의결과에차이를보였다. strain BL149, BL156, BL105 도 PFGE 와 IRS-PCR 결과에유사한차이를보였다. 최종적으로, PFGE 에서는 51 균주중 39가지형별이구별되어 76.4% 의변별력을보인반면, IRS-PCR 은 80.3% (41/51) 로유의한차이는없었다 (Z=0.481, P=0.3151). 고찰 Figure 4. Dendrogram resulting from cluster analysis of E. coli using IRS-PCR and PFGE. IRS-PCR 분석법이기존 PCR typing 과다른점으로는 infrequent 및 frequent cutter 두가지의제한효소를함께사용하고, 각효소에해당하는 adaptor 와 linker 를 primer 와함께사용하여필요한부위만을선택적으로증폭할수있다는점이다. 이때 adaptor 는 HhaI adaptor (AH) 와 XbaI adaptor (AX) 가있고, 각각의구성은 AH1, AH2, AX1, AX2이다. primer PX는 AX1에상보적으로 3 -end 에하나의염기가붙어 PX-A, PX-T, PX-C, PX-G 를만들게되고, 이는 primer 의결합을낮추게하여, primer 가특정부위만을증폭하여짧은시간안에필요한부
www.icjournal.org http://dx.doi.org/10.3947/ic.2012.44.1.5 Infect Chemother 2012;44(1):5-10 9 Table 2. Results of PFGE and IRS-PCR Performed on 51 Clinical Isolates of E. coli Strain Specimen PFGE IRS_PCR BL 057 sputum 1 1 BL 454 wound 2 2 BL 060 urine 3 3 BL 164 urine 4 4 BL 440 sputum 5 5 BL 451 urine 6 6 BL 443 close pus 7 7 BL 409 bile 8 8 BL 417 urine 8 8 BL 448 bile urine 9 9 BL 359 urine 10 10 BL 446 blood 11 11 BL 430 urine 12 12 BL 404 urine 13 13 BL 406 urine 14 14 BL 410 urine 15 15 BL 402 blood 16 16 BL 442 urine 16 16 BL 441 urine 17 17 BL 143 sore 18 18 BL 447 blood 19 19 BL 450 blood 20 20 BL 285 sputum 20.1 20.1 BL 099 sputum 21 21 BL 338 urine 22 22 BL 361 DM foot wound 23 23 BL 117 sore 24 24 BL 382 urine 25 25 BL 435 urine 26 26 BL 131 sputum 27 27 BL 139 urine 27 28 BL 153 urine 27.1 27 BL 349 urine 28 29 BL 352 sputum 28 29 BL 347 sputum 28 29 BL 355 sputum 29 30 BL 376 urine 30 31 BL 107 urine 31 32 BL 142 sputum 31 33 BL 114 sore 32 32 BL 149 sputum 31 33 BL 156 sputum 31 33 BL 105 bile 32 34 BL 101 sputum 33 35 BL 157 sputum 34 36 BL 102 sputum 35 37 BL 145 sputum 35 37 BL 116 blood 36 38 BL 348 urine 37 39 BL 401 urine 38 40 위를효과적으로증폭할수있다. PFGE 분석법과비교하였을때, IRS-PCR 의큰장점은우선, 일반적인 PCR 을수행할수있는검사실이라면기술적인어려움없이신속하게사용할수있다는것이다. 실험소요시간이 2-3 일이었던 PFGE 분석법과는달리 DNA 의유무에따라실험시간이 1일정도단축된다. 또한실험자의도에따라실험을계획하고변화시킬수있으며, 분석할 DNA 염기서열에대한정보가없다고하여도사용된 adaptor 의 DNA 염기서열에따라 primer 를제작하여분석할수있다 [9, 16]. 이런이유로, 본연구자는보다능률적인대안일것이라기대하에분자수준의역학적형별 (molecular epidemiologic typing) 을시행하는데있어서분자생물학적기법중 PFGE 분석법과 IRS-PCR 을비교분석하였다. 그러나과거의방법을바탕으로실험을해본결과몇가지문제점을발견할수있었다. 기존실험방법에사용된 adaptor 의 Tm값이낮아 adaptor 의결합이불안정하여 PCR 결과재현성이매우불안정하였다. 재현성을확보하기위해 Fast PCR 을이용하여 Tm값을높여가며, 여러번반복하여실험을하였다. Tm값을높여새롭게설계한 adaptor 로 IRS-PCR 을실시한결과, PCR 의증폭산물이안정적으로증폭되었다. 또한 adaptor 상문제를제외한나머지부분에서검토를한결과, ligation 의온도차이에서문제점이있었다. 이를보완하기위하여다른반응온도조건으로 IRS- PCR 을실시하였다. 실온의조건으로 ligation 을해보았지만, 반응이잘이루어지지않았으며, 16 에서 ligation 을실시하였을때더욱 PCR 결과가안정되었다. 방법론적으로새로 IRS-PCR 개선한방법이기존방법론보다재현성면에서는더나았다. E. coli 를이용하여분석한결과, 각실험에소요된시간을살펴보면 PFGE 는 2-3 일이걸렸으며, IRS-PCR 은 1일이면가능하였다. 실험결과 51 개의균주를이용하여병원균인 E. coli 의형별분석을위해 PFGE 분석법과 IRS-PCR 분석법으로적용하였다. E. coli 는 PFGE 분석결과에서는 51 개균주중 39 형의형별구별이가능하여 76.4% 의변별력을보였고, IRS-PCR 분석법은 41 형으로 80.3% 의변별력을보였다. 이중에서 PFGE 분석결과보다는 IRS-PCR 분석결과에서형별구별을 2가지더할수있었지만, 유의한차이는아니었다. PFGE 에서같은형별로분석된 BL139, BL107, BL105 균주는 IRS-PCR 분석법에서는다른형별로추정되는데, 이는 infrequent cutter 로작용하는제한효소가특정부위를잘라서 adaptor 와 linker 를 primer 와함께필요한부위를선택적으로증폭시키기때문에 PFGE 보다좀더특이적일가능성이있다. PFGE 분석결과 BL131, BL139 균주에서확인된 27 형의경우, PFGE 분석과는달리 IRS-PCR 분석결과에서는 BL139 균주에서 28 형을확인하였으며, BL107, BL142, BL149 및 BL156 균주의 PFGE 분석결과에서확인된 31 형과는달리 IRS 분석결과에서는 4가지균주중 BL107 균주에서만 32 형을확인하였고, 나머지균주에서는 33 형을확인하였다. 또한, BL114 와 BL105 균주에서확인하였던 32 형이 PFGE 분석과는다르게 IRS 분석결과 BL105 균주에서 34 형이상이하게나타났다 (Table 2). 또한항생제감수성결과총 51 균주에내성패턴형은 6개의형으로구분되며, 11.8% 의변별력을나타내었다. 각항생제내성패턴들
10 JH Byun, et al. IRS-PCR on E. coli www.icjournal.org 을 PFGE 및 IRS-PCR 그룹들과비교하였으나, 연관성을찾기어려웠다 (Table 2). 본연구자의실험에서 dendrogram 분석결과 IRS-PCR 분석결과는변별력면에서 PFGE 보다대상균주의역학적특성과검체수의차이에의한우연한변이라고판단된다. 위두가지분석법은동일한제한효소를이용한다는점에서일치하는부분이있다. PFGE 분석법은 DNA 를전기영동하였을때, 각균주의 DNA 를 gel pore size 에따라 DNA size 별로나열된다는것이다. 반면 IRS-PCR 분석법의경우 DNA 의특정부위를제한효소를통해절단하고그부위를선택적으로 primer 를사용하여필요한부위만을증폭하기때문에 PFGE 분석법과는다르게좀더다양한 size 의 DNA 를검출할수있다는데분석력의의의를두고있다. 본연구자의실험에서유전형분석시에 Mazurek et al. 과 Handley et al. 의보고와동일하게 PX-G 만으로도 E. coli 의유전형분석을하여충분한결과를얻을수있었기에 A, T, C로세분화되어실험을연장하지않았다 [9, 16]. IRS-PCR 은재현성뿐만아니라변별력이 PFGE 에필적할만큼높아, 분자역학적형별분석검사에있어, 좋은대안으로서연구를시행할수있을것으로기대된다. 또한, adaptor 와 primer 를미리만들어냉동보관해두면, 검체검사과정이하루내에이루어질수있는신속성과편리성이있어, 다른분자적역학방법에비해이점이있다고생각한다. 그러나 IRS-PCR 실험진행에있어서 adaptor 와 primer 를제작하는과정중실험조건과실험실내의일정한온도유지가가장중요하리라생각한다. 이와같이본연구진은 IRS-PCR 의방법과틀을새로설계하고개선하여시행함으로써재현성과검출률을보다향상시키는성과를얻었으며, 또한 ESBL 생성 E. coli 의병원내전파및지역사회로부터의유입차단을위한적절한감염관리방안을위하여분자역학이필요하다고사료된다. References 1. Kim YK, Pai H, Lee HJ, Park SE, Choi EH, Kim J, Kim JH, Kim EC. Bloodstream infections by extended-spectrum beta-lactamase-producing Escherichia coli and Klebsiella pneumoniae in children: epidemiology and clinical outcome. Antimicrob Agents Chemother 2002;46:1481-91. 2. Lee SH, Kim JY, Shin SH, An YJ, Choi YW, Jung YC, Jung HI, Sohn ES, Jeong SH, Lee KJ. Dissemination of SHV-12 and characterization of new AmpC-type beta-lactamase genes among clinical isolates of enterobacter species in Korea. J Clin Microbiol 2003;41:2477-82. 3. Pai H, Lee HJ, Choi EH, Kim J, Jacoby GA. Evolution of TEMrelated extended-spectrum beta-lactamases in Korea. Antimicrob Agents Chemother 2001;45:3651-3. 4. Pai H, Lyu S, Lee JH, Kim J, Kwon Y, Kim JW, Choe KW. Survey of extended-spectrum beta-lactamases in clinical isolates of Escherichia coli and Klebsiella pneumoniae: prevalence of TEM-52 in Korea. J Clin Microbiol 1999;37:1758-63. 5. Livermore DM, Canton R, Gniadkowski M, Nordmann P, Rossolini GM, Arlet G, Ayala J, Coque TM, Kern-Zdanowicz I, Luzzaro F, Poirel L, Woodford N. CTX-M: changing the face of ESBLs in Europe. J Antimicrob Chemother 2007;59:165-74. 6. Rossolini GM, D'Andrea MM, Mugnaioli C. The spread of CTX- M-type extended-spectrum beta-lactamases. Clin Microbiol Infect 2008;14 (Suppl 1):33-41. 7. Shin WS. Molecular epidemiologic typing Boonja yeokhakjeok hyungbyul. Korean J Infect Dis 1995;27:585-94. 8. Mazurek GH, Hartman S, Zhang Y, Brown BA, Hector JS, Murphy D, Wallace RJ Jr. Large DNA restriction fragment polymorphism in the Mycobacterium avium-m. intracellulare com plex: a potential epidemiologic tool. J Clin Microbiol 1993; 31:390-4. 9. Mazurek GH, Reddy V, Marston BJ, Haas WH, Crawford JT. DNA fingerprinting by infrequent-restriction-site amplification. J Clin Microbiol 1996;34:2386-90. 10. Yoo JH. Appbcation of molecular epidemiologic typing to the control of nosocomial infection. Korean J Nosocomial Infect Control 1997;2:61-71. 11. Bisharat N, Agmon V, Finkelstein R, Raz R, Ben-Dror G, Lerner L, Soboh S, Colodner R, Cameron DN, Wykstra DL, Swerdlow DL, Farmer JJ 3rd. Clinical, epidemiological, and micro biological features of Vibrio vulnificus biogroup 3 causing outbreaks of wound infection and bacteraemia in Israel. Israel Vibrio Study Group. Lancet 1999;354:1421-4. 12. Abi-Said D, Anaissie E, Uzun O, Raad I, Pinzcowski H, Vartivarian S. The epidemiology of hematogenous candidiasis caused by different Candida species. Clin Infect Dis 1997;24: 1122-8. 13. Zhang J, Hollis RJ, Pfaller MA. Variations in DNA subtype and antifungal susceptibility among clinical isolates of Candida tropicalis. Diagn Microbiol Infect Dis 1997;27:63-7. 14. Kim SI, Yoo JH, Cho YK, Lee DG, Wie SH, Choi JH, Kim YR, Shin WS, Kang MW. Comparison of pulsed-field gel electrophoresis, amplified fragment length polymorphism, and infrequent restriction site-polymerase chain reaction for molecular typing of Escherichia coil and Staphylococcus aureus strains. Korean J Infect Dis 1999;31:474-80. 15. Yoo JH, Choi JH, Shin WS, Huh DH, Cho YK, Kim KM, Kim MY, Kang MW. Application of infrequent-restriction-site PCR to clinical isolates of Acinetobacter baumannii and Serratia marcescens. J Clin Microbiol 1999;37:3108-12. 16. Williams JG, Kubelik AR, Livak KJ, Rafalski JA, Tingey SV. DNA polymorphisms amplified by arbitrary primers are useful as genetic markers. Nucleic Acids Res 1990;18:6531-5.