fm

大韓獸醫學會誌 (2015) 第 55 卷第 2 號 Korean J Vet Res(2015) 55(2) : 81~88 http://dx.doi.org/10.14405/kjvr.2015.55.2.81 < 원례보저 > 개생균제사용에적합한유산균주의선발및면역활성평가 박수민 박호은 이완규 * 충북대학교수의과대학 ( 접수 : 2015 년 4 월 8 일, 수정 : 2015 년 4 월 29 일, 게재승인 : 2015 년 5 월 7 일 ) Selection and immunomodulatory evaluation of lactic acid bacteria suitable for use as canine probiotics Su-Min Park, Ho-Eun Park, Wan-Kyu Lee* College of Veterinary Medicine, Chungbuk National University, Cheongju 362-763, Korea (Received: April 8, 2015; Revised: April 29, 2015; Accepted: May 7, 2015) Abstract : This study was conducted to isolate lactic acid bacteria (LAB) from dog intestine and identify potential probiotic strains for canine use. One hundred and one LAB were isolated from feces of 20 healthy dogs. Acid, bile, and heat resistance along with adherence to Caco-2 cells and antimicrobial activity against pathogens were examined. To analyze immunomodulative effects, the production of nitric oxide (NO), TNF-α, and IL-1β was measured using RAW 264.7 macrophages. Additionally, RAW BLUE cells were used to evaluate nuclear factor-κb (NF-κB) generation. Ultimately, three strains were selected as canine probiotics and identified as Lactobacillus reuteri L10, Enterococcus faecium S33, and Bifidobacterium longum B3 by 16S rrna sequence analysis. The L10 and S33 strains showed tolerance to ph 2.5 for 2 h, 1.0% Oxgall for 2 h, and 60 o C for 5 min. These strains also had strong antimicrobial activity against Escherichia coli KCTC 1682, Salmonella Enteritidis KCCM 12021, Staphylococcus aureus KCTC 1621, and Listeria monocytogenes KCTC 3569. All three strains exerted better immunomodulatory effects than Lactobacillus rhamnosus GG (LGG), a well-known commercial immunomodulatory strain, based on NO, NF-κB, IL-1β, and TNF-α production. These results suggested that the three selected strains could serve as canine probiotics. Keywords : Bifidobacterium longum, canine probiotics, Enterococcus faecium, immunomodulation, Lactobacillus reuteri 서 생균제 (probiotics) 는일반적으로숙주에유익한작용을하는미생물제제또는미생물의성분으로정의된다 [13]. 일반적으로생균제용미생물로는유산균 (lactic acid bacteria) 을많이사용하고있는데, 그중에서 Lactobacillus, Enterococcus, Bifidobacterium 등이대표적인균주로알려졌다. 유산균은동물의장내세균총 (intestinal microflora) 생태계균형유지와병원성세균의억제에중요한역할을하는유익한균으로알려졌는데, 일반적으로소장에는 Lactobacillus, Enterococcus 등의통성혐기성 (facultative anaerobic) 유산균이, 대장에는 Bifidobacterium 과같은편성혐기성 (strict anaerobic) 유산균이우점종으로분포하고있다 [20]. 론 생균제의체내유용효과는크게 4 개의기전으로, 1) 항균성물질의생산을통한길항작용 [33], 2) 병원체의부착부위나영양성분의경쟁 [3], 3) 숙주의조절작용 [34], 4) 세균의독소생성및활성의억제작용이다 [4, 31]. 이외에도생균제는비타민 E, 유기산, 아미노산등의소화및흡수개선, 비타민 B 군의합성, 장내면역반응증가, 혈중 IgG 수준조절, 대식세포 (macrophage) 의활성과면역기능향상등다양한작용이보고되고있다 [30]. 우수한생균제가갖추어야하는특성으로는위산에대한내산성, 담즙산에대한내담즙성, 제품제조과정의열처리에대한내열성, 장상피세포에대한부착성, 병원성세균에대한항균물질생성능, 숙주에대한면역활성능력등다양한특성이요구되고있다 [24]. 활성화된대식세포는암세포나 *Corresponding author Tel: +82-43-261-2960, Fax: +82-43-267-2595 E-mail: wklee@cbu.ac.kr 81

82 박수민 박호은 이완규 세균에철유실과철-황효소와관련된산화적손상을유발시키며, nitric oxide(no) 와같은세포독성물질을분비한다. 또한 tumor necrosis factor-α(tnf-α), interleukin- 1β(IL-1β), interferon-α/β, interleukin-6(il-6), interleukin-12 (IL-12), interleukin-18(il-18) 과같은 cytokine을분비하여면역계세포가수용체에반응하도록함으로써면역반응을조절한다 [9, 21, 23]. 현재세계적으로개생균제용유산균주개발에대한연구는다른산업동물에비해부족한상태이지만, 안전하고항생제를대체할수있다는장점과친환경적소재를선호하는최근의경향에맞추어점차그사용빈도가증가하고있다 [31]. 국내에서도아직개생균제개발에대한연구는초기단계이지만, 생균제에대한관심은더욱높아질것으로예상한다. 개의장내세균총은품종, 사육환경, 사료등다양한요인에따라변화하며, 종특이성을포함하기때문에, 개생균제용유산균주는개유래의균주를사용하는것이가장이상적임에도불구하고, 국내에서는출처가불분명한다양한외부유래의생균제용균주도사용되고있다. 따라서본연구에서는국내의소형견장관으로부터생균제용유산균인 Lactobacillus, Enterococcus, Bifidobacterium 속균주를분리하고, 생균제가갖추어야할특성조사와함께, 면역활성검증을통해개생균제로사용하기에가장적합한유산균을선발, 평가하는것을연구의목적으로하였다. 재료및방법 공시동물충북청주시근교가정집과애견센터에서사육하는건강한포유자견 (2~4 주령 ) 7 마리, 이유자견 (2~3 개월령 ) 7 마리, 성견 (1~6 세 ) 6 마리의합계 20 마리를유산균분리용공시동물로사용하였다. 품종은 Pomeranian, Maltese, Shih Tzu, 잡종견등을사용하였다. 유산균주분리강아지의신선한분변은배변유도또는 rectal swab 을통해채취한후, 즉시 O 2 -free CO 2 로치환시킨혐기성수송배지인 BBL brain heart infusion(bhi) broth(becton, Dickinson and Company, USA) 에넣어실험실까지냉장운반하였다. Lactobacillus 선택배지인 LBS 와 MRS, Enterococcus 선택배지인 TATAC, Bifidobacterium 선택배지인 BS 와비선택배지인 BL 배지에멸균된 diluent A(KH 2 PO 4 4.5 g, Na 2 HPO 4 6.0 g, L-cystein HCl H 2 O 0.5 g, Tween 80 0.5 g, Agar 1.0 g/1,000 ml DW) 를사용하여각각 10 배단계희석하여도말하였다. 도말된배지는 O 2 -free CO 2 로치환된 steel wool jar 에서 37 o C, 48 시간배양하였다 [18, 20, 25]. 선택및비선택배지에서유산균의전형적인집락을선발하여 BL medium 에계대한후, 37 o C, 48 시간배양하였다. 배양된집락은 Mitsuoka 방법에의해 Lactobacillus, Enterococcus, Bifidobacterium 으로분리, 동정하였다. 분리된유산 균은혐기상태에서 BL medium 에계대하여 37 o C 에보관하며, 다음실험에사용하였다 [18, 20, 25]. 생균제용균주의분리내산성및내담즙성실험내산성유산균을선발하기위하여분리된 Lactobacillus, Enterococcus 및 Bifidobacterium 을 L-cysteine(Junsei Chemical, Japan) 이 0.05% 첨가된 BHI broth(ph 7.0) 에접종하여 37 o C 에서 24 시간배양하였다. Lactobacillus, Enterococcus, Bifidobacterium 은 ph 2.5 와 ph 3.5 의 BHI broth 에 1% 접종하고, 37 o C 에서 2 시간동안배양하였다. 이후균주의생존여부를확인하기위하여배양균주를 BL medium 에도말하여배양한후, 생존한균주를내산성균주로판정하였다 [25]. 내산성균주로판정된유산균을대상으로 0.3%, 0.5%, 1.0% Oxgall(pH 7.0; Difco, USA) 이첨가된 BHI broth 에유산균배양액을 1% 씩접종하고 2 시간동안배양한후, BL medium 에도말하고배양하여생존한균주를내담즙성균주로판정하였다 [25, 27]. 내열성실험내산성과내담즙성균주중에서선발한유산균을 L- cysteine(junsei Chemical) 이 0.05% 첨가된 BHI broth(ph 7.0) 에접종, 배양후, 배양액을 50 o C, 60 o C, 70 o C 에각각 5 분간노출시킨후, BL medium 에도말하여 37 o C 에서 48 시간배양후집락이형성된균주는내열성균주로판정하였다 [5, 25]. 병원균억제능검사병원균억제능을검사하기위하여 Flemming 등 [12] 에의해언급된 agar spot assay를변형하여사용하였다. Agar spot assay의병원균으로는 Escherichia coli KCTC 1682, Salmonella Enteritidis KCCM 12021, Staphylococcus aureus KCTC 1621, Listeria monocytogenes KCTC 3569균주의 4종류를사용하였다. 각병원균과유산균은 BBL BHI broth (Becton, Dickinson and Company) 에서 37 o C, 24시간배양하여접종액으로사용하였다. 배양된유산균은먼저 BHI agar에 2µL 접종하여 spot이형성되도록 30 o C, 24시간배양하였다. 그후유산균이배양된 BHI agar에, 7 ml의 BHI agar(0.7%) 와혼합된병원균을 pouring하여 30 o C에서 24시간배양하였다. Spot 주위로형성된병원균의억제환의길이가 3mm 이상일경우병원균억제능력이있는것으로평가하였다 [8, 12]. 장관부착능검사유산균은 L-cysteine 을 0.05%(w/v) 로첨가한 MRS broth (Difco) 5 ml 에접종하여혐기적으로 37 o C, 24 시간배양하였다. Caco-2 cell( 한국세포주은행, 대한민국 ) 은 20% inactivated fecal calf serum(gibco-brl, USA) 과 0.2% penicillin/streptomycin(10,000 U/mL, Gibco-BRL) 을첨가한 DMEM(Gibco-

Lactic acid bacteria suitable for use as canine probiotics 83 BRL) 에서 CO 2 incubator(95% air, 5% CO 2 ) 를사용하여 37 o C 에서배양하였다. Caco-2 cell monolayer 가형성된 4- well chamber slide 에유산균 (0.5mL; 1.0 10 9 CFU/mL in PBS) 을접종하고, 5 개의 Caco-2 cell 당부착한유산균수의평균값을계산하였다. Lactococcus lactis NIAI 527 (Meiji, Japan) 과 Lactobacillus acidophilus KCTC 3111 을각각양성및음성대조군균주로사용하여, 부착능음성및양성으로판정하였다 [17, 25]. 최종분리균주의면역활성조사세포배양 한국세포주은행으로부터분양받은 murine macrophage 세포인 RAW 264.7 cell 을 10% fetal bovine serum 과, 100 unit/ml 의 streptomycin 과 penicillin 이첨가된 DMEM 배지를사용하여 37 o C, 5% CO 2 조건에서배양하고 NO 및 cytokine 생성에미치는영향을알아보기위하여사용하였다. InvivoGen(USA) 의 RAW BLUE cell 은 nuclear factor-κb (NF-κB) 를측정하기위한세포로위의 RAW 264.7 cell 과동일한조건에서배양하였고, 4~5 회계대후 Zeocin (InvivoGen) 항생제를처리후사용하였다. Negative control well 에는 PBS 를첨가하고, positive control well 에는 PBS 와 LPS(Sigma, USA) 를 100 또는 500 ng/ml 를첨가하였다 [1, 8]. NO 측정 NO 의농도는 Griess reagent system(promega, USA) 을사용하여측정하였다. 96-well plate 에배양액 50 µl 를넣고 Griess reagent I(NED solution) 과 Griess reagent II (Sulfanilamide solution) 를동량으로혼합한후, 암실에서 10 분간반응하고 30 분이내에 microplate reader(tecan, Austria) 를이용하여 540 nm 에서측정하였다. NO 의농도는아질산나트륨의표준곡선 (0~100 μm) 을이용하여계산하였다 [8]. IL-1β 와 TNF-α 측정 RAW 264.7 cell 을 5.0 10 5 cell/ml 로접종한후세포가안정되면 1.0 10 7 CFU/mL 농도로맞춘유산균을혼합하여 48 시간반응시킨후에배양액을회수하였다. IL-1β 와 TNFα 생산량은 ELISA kit(ebioscience, USA) 를이용하여측정하였다. Sandwich ELISA 방법을사용하였으며, 측정방법은제조사의지침에따라진행하였다. 측정시료는 microplate reader(tecan) 를이용하여 450 nm 파장에서 3 회반복측정하였다 [1, 8]. NF-κB 측정 유산균주가 NF-κB pathway 를활성화시키는지확인하기위하여 secreted alkaline phosphatase reporter gene 이안정적으로 transfection 된 RAW BLUE cells(invivogen) 을사용하였다. NF-κB 생성에미치는영향을알아보기위하여 RAW BLUE cells 을 96 well plate 의각 well 당 5.0 10 5 cell/ml 가되도록분주하여 2 시간안정화한후, 새로운 DMEM 배 지로교체하였다. 1.0 10 8 CFU/mL 농도로맞춘유산균 100 µl 를첨가하여, 최종 1.0 10 7 CFU/mL 농도로배양하였다. 48 시간배양후, 배양액 20 µl 와 QUANTI-Blue (InvivoGen) 200 µl 를 37 o C 에서 15 분간암실에서반응시켰다. 모든시료는 3 회반복으로 620 nm 파장에서측정하였다 [1]. 최종선발균의동정최종선발균주는 16s rrna sequencing 분석 (SolGent, Korea) 을통해동정하였다. 통계처리결과의통계분석은 SPSS for Windows(ver. 12.0; SPSS, USA) 을사용하였다. 일원배치분산분석 (ANOVA) 으로평균과표준편차를분석하였으며, 사후검정을위해 Duncan test (p < 0.05) 를실시하였다. 결 유산균의분리총 20 마리개의분변에서분리된유산균은총 101 개균주였으며, 그중에서 Enterococcus 속균주가 47 개균주 (46.5%) 로가장많이분리되었으며, Lactobacillus 속균주도 45 개균주 (44.6%) 가분리되었다. 그러나편성혐기성유산균인 Bifidobacterium 속균주는 9 개균주 (8.9%) 로제일낮게분리되었다 (Table 1). 분리균주의특성내산성개의분변으로부터분리된총 101 개균주를대상으로내산성시험을실시한결과 Table 1 에서와같이 Enterococcus 47 개균주중 32 개균주 (68.1%) 가 ph 2.5, 2 시간에서내산성을나타내었다. 그러나 Lactobacillus 속 45 개균주중 8 개균주 (17.8%), Bifidobacterium 속 9 개균주중 1 개균주 (11.1%) 만이 ph 2.5 에서내산성을나타내었다. ph 3.5, 2 시간에서는 Lactobacillus, Enterococcus, Bifidobacterium 속세균중각각 12/45(26.7%), 44/47(93.6), 3/9(33.3%) 에서내산성결과를나타내었다. 내담즙성분리된총 101 개균주의내담즙성을확인한결과, Bifidobacterium 속 1 개균주만이 1% Oxgall 에서사멸하였고, 나머지모든균주는 0.3%, 0.5%, 1.0% Oxgall 에서내담즙성을나타내었다 (Table 1). 내열성내산성과내담즙성균주중에서선발된유산균을대상으로 70 o C 에서 5 분간내열성을확인한결과 Table 1 에서와같이, Lactobacillus, Enterococcus, Bifidobacterium 균주는각각 4/8(50%), 19/32(59.4%), 2/4(50%) 의내열성을나타내었 과

84 박수민 박호은 이완규 Table 1. The probiotic characteristics of selected lactic acid bacteria from the feces of dogs Characteristics Lactobacillus Enterococcus Bifidobacterium Number of isolates (%) 45/101 (44.6) 47/101 (46.5) 9/101 (8.9) Acid tolerance ph 2.5, 2 h 8/45 (17.8) 32/47 (68.1) 1/9 (11.1) ph 3.5, 2 h 12/45 (26.7) 44/47 (93.6) 3/9 (33.3) Bile resistance 0.3%, 2 h 45/45 (100.0) 47/47 (100.0) 9/9 (100.0) 0.5%, 2 h 45/45 (100.0) 47/47 (100.0) 9/9 (100.0) 1.0%, 2 h 45/45 (100.0) 47/47 (100.0) 8/9 (88.9) Heat resistance 50 o C, 5 min 6/8 (75.0) 31/32 (96.9) 3/4 (75.0) 60 o C, 5 min 5/8 (62.5) 28/32 (87.5) 2/4 (50.0) 70 o C, 5 min 4/8 (50.0) 19/32 (59.4) 2/4 (50.0) Antimicrobial activity Escherichia coli KCTC 1682 7/8 (87.5) 11/12 (91.7) 2/4 (50.0) Salmonella Enteritidis KCCM 12021 8/8 (100.0) 12/12 (100.0) 2/4 (50.0) Staphylococcus aureus KCTC 1621 6/8 (75.0) 12/12 (100.0) 1/4 (25.0) Listeria monocytogenes KCTC 3569 6/8 (75.0) 11/12 (91.7) 1/4 (25.0) Adherence to Caco-2 cell Negative 5/8 (62.5) 4/12 (33.3) 2/4 (50.0) Positive 3/8 (37.5) 8/12 (66.7) 2/4 (50.0) 다. 그러나 60 o C, 5 분의낮은열처리조건에서는각각 5/ 8(62.5%), 28/32(87.5%), 2/4(50%) 가생존하는내열성을나타내었다. 병원성억제능내산성, 내담즙성, 내열성이우수한유산균주를대상으로 4 종류병원성세균에대한병원성억제능을평가한결과, Lactobacillus 속 8 개균주는 Salmonella Enteritidis KCCM 12021 균주에대해 100% 항균활성을나타내었으며, 나머지병원균 3 종류에대해서도 75%~87.5% 의높은항균활성을나타내었다. Enterococcus 12 개균주는 Salmonella Enteritidis KCCM 12021, Staphylococcus aureus KCTC 1916 균주에대해 100% 항균활성을나타내었고나머지 2 종류병원균에대해서도 91.7% 의매우높은항균활성을나타내었다. 그러나 Bifidobacterium 속 4 개균주는 4 종류병원균에대해 25.0%~ 50.0% 의비교적낮은항균활성만을나타내었다 (Table 1). 장관부착능검사 Caco-2 cell 을사용한유산균주의부착능검사를시행한결과 Table 1 에서와같이 Enterococcus 12 개균주중 8 개균주 (66.7%) 가부착능을보여가장높은결과를나타내었다. Bifidobacterium 속 4 개균주는 50%, Lactobacillus 속 8 개균주는 3 개균주만이부착능결과를나타내었다. 면역활성능분리된 Lactobacillus, Enterococcus, Bifidobacterium 속균주중에서내산성, 내담즙성, 내열성, 병원성억제능, 장관부착능등이가장우수한상위균주를각각 4 개씩선발하여합계 12 개균주를대상으로면역활성능을측정하였다. NO 생성량의경우 Enterococcus S33 균주 (6.3 μm/ml), Lactobacillus L10 균주 (11.6 μm/ml), L31 균주 (82.8 μm/ml), Bifidobacterium B3 균주 (5.9 μm/ml) 의 NO 생성량이면역증진효과가입증된상업용균주인 Lactobacillus rhamnosus GG(LGG) 의 2.5 μm/ml 보다유의적인증가결과를나타내었다 (Fig. 1). IL-1β 측정결과는 Enterococcus 균주중에서 S33, S17 균주의생성량이많았지만, LGG 균에유의적인증가는나타내지않았다. 그러나 Lactobacillus L10 균주 (7.0 pg/ml) 와 Bifidobacterium B3 균주 (5.9 pg/ml) 는 LGG 의 2.4 pg/ml 보다유의적인증가결과를나타내었다. TNF-α 측정결과 Enterococcus S33, S17, S45, S36 4 개균주모두 LGG 의 24.6 pg/ml 보다유의적으로증가하였다. Lactobacillus 도 4 개균주모두유의적인증가세를보였으며, 그중에서 L10 균주가 101 pg/ml 의가장높은결과를보였다. 그러나 Bifidobacterium 균주는 B3 와 B6 균주만이 LGG 에비해유의적인증가를나타내었으며, B3 가 100.2 pg/ml 의생성량을나타내었다. NF-κB 흡광도측정결과, 면역활성을측정한 12 개균주중

Lactic acid bacteria suitable for use as canine probiotics 85 Fig. 1. Nitric oxide (A), IL-1β (B), TNF-α (C) and nuclear factor-κb (D) production by RAW 264.7 and RAW BLUE cells induced by selected lactic acid bacteria. RAW 264.7 and RAW BLUE cells (5 10 5 cells/ml) were stimulated with probiotic strains or PBS for 48 h. L100 means LPS at 100 ng/ml. Data are mean ± SD values of triplicates. NC; negative control, PBS+L100; positive control, LGG; Lactobacillus rhamnosus GG, S17-S45; Enterococcus sp., L8-L44; Lactobacillus sp., B1-B9; Bifidobacterium sp. Different superscript letters (a, b, c, d, e, f, and g) indicate statistical differences as determined by ANOVA (p < 0.05). Table 2. Characteristics and Identification of finally selected lactic acid bacteria to use as probiotics for dogs Characteristics Lactobacillus L10 Enterococcus S33 Bifidobacterium B3 Cell morphology Rod Cocci Y-shape ph resistant Bile tolerance Heat resistance ph 2.5, 2 h + + + ph 3.5, 2 h + + + 0.3%, 2 h + + + 0.5%, 2 h + + + 1.0%, 2 h + + + 50 o C, 5 min + + + 60 o C, 5 min + + 70 o C, 5 min + Escherichia coli KCTC 1682 + + + Antimicrobial activity Salmonella Enteritidis KCCM 12021 + + Staphylococcus aureus KCTC 1621 + + + Listeria monocytogenes KCTC 3569 + + Adherence to Caco-2 cell + + Identification by 16s RNA Lactobacillus reuteri Enterococcus faecium Bifidobacterium longum 에서 S36, B1, B9 의 3 개균주를제외한모든균주가 LGG 균주에비해유의적인증가결과를나타내었다. 따라서면역활성을측정한 12 개균주중에서가장우수한 결과를보인 Lactobacillus L10, Enterococcus S33, Bifidobacterium B3 의 3 개균주가생균제로서의특성과면역활성을모두갖춘최적의개생균제용유산균주로판단되었다.

86 박수민 박호은 이완규 최종선발균의동정최종선발균주인 Lactobacillus L10, Enterococcus S33, Bifidobacterium B3균주는 16s rrna sequence 분석결과 Lactobacillus reuteri L10(99%), Enterococcus faecium S33 (99%), Bifidobacterium longum B3(99%) 로각각최종동정되었으며, 그생균제적특성은 Table 2에나타내었다. 고 찰 본연구에서는총 20 마리개의분변에서유산균 101 개균주를분리하였는데, Enterococcus 가 47 개균주 (46.5%), Lactobacillus 가 45 개균주 (44.6%) 로대부분을차지하였으며 Bifidobacterium 속은 9 개균주로 8.9% 에불과하였다. 이와같은결과는 16S rrna gene pyrosequencing 방법을사용하여건강한개의장내세균총을분석하였을때 Bifidobacterium 속세균은우점종으로항상검출되지않는다는 Handl 등 [14] 의연구결과와일치하고있다. 또핀란드대학의연구에의하면 21 마리의개를대상으로장내세균총을분석한결과, 13 종류의유산균이검출되었으며대부분 Lactobacillus, Weissella, Pediococcus 속세균이우점종을형성하고있음을보고하고있다 [2]. 사람은물론동물에서도장내세균총은연령, 사료, 스트레스, 질병등다양한요인에의해민감하게변화하기때문에면역활성과질병억제효능이밝혀진유산균을우점종으로유지할수있는생균제의급여가전세계적으로각광을받게되었다. 생균제를급여하면우선위와소장을거쳐대장까지도달하게되는데, 제일먼저위의낮은산성과십이지장의높은알칼리성인담즙에노출된다. 따라서우수한특성을가진유산균주를생균제용균주로사용하기위해서는먼저내산성과내담즙성의특성을갖추어야한다 [22]. 본실험결과 Enterococcus 47 개균주는 ph 2.5 에서 32 개균주 (68.1%) 가강한내산성을보였지만, Lactobacillus 45 개균주는 17.8%, Bifidobacterium 은 11.1% 만이내산성을나타내어비교적낮은내산성균주임을알수있었다. Strompfová 등 [31] 의연구에의하면개에서분리한 Enterococcus 속세균의 76~87% 가 ph 3.0 에서 3 시간내산성을나타내었으며, 그중에서 Enterococcus faecium EF01 균주는높은내산성, 내담즙성, 장관내부착성등을보여개의생균제용균주로최적임을보고하고있다. 유산균의경우 2% 의담즙산에대한내담즙성도보고되고있지만 [26], 본연구의경우분리된 Enterococcus 속, Lactobacillus 속모두 1% 의담즙산에대해내담즙성을나타내었다. 생균제의대량생산과정중가열과정이필요한경우도있으므로생균제용균주는균수유지를위해내열성의특성이요구되고있다. 유제품에서분리된 Lactobacillus 의내열성연구결과, 60 o C 에서 2 시간, 65 o C 에서 25 분간생존결과가보고되었으며 [16]. Bifidobacterium 속세균은 60 o C, 5 분간반응시킨결과 31 개의균주중 8 개의균주만이내열성을보인것으로확인되기도하였다 [28]. 본실험에서 Enterococcus는 60 o C, 5분에서 87.5%, 70 o C, 5분에서 59.4% 가내열성을보였으며, Lactobacillus와 Bifidobacterium는시험균주의 50% 가 70 o C, 5분에서내열성을보였다. 유산균의병원성억제능에관한많은연구에서 Lactobacillus, Enterococcus, Bifidobacterium 등의유산균은 Salmonella Typhimurium, Staphylococcus aureus, Escherichia coli, Listeria monocytogenes 등에대한억제능이보고되었다 [32, 35]. 본실험에서시행한병원성억제능결과, Enterococcus 의경우 12개균주중 10개균주가, Lactobacillus는 8개균주중 3개의균주가 4가지병원균모두에대해억제능을나타내었지만, Bifidobacterium은 4가지병원균모두에억제능이있는균이존재하지않았다. 이와같은결과는 Enterococcus, Lactobacillus의산생성능력이 Bifidobacterium 에비해뛰어난것으로추측된다. NO는 L-arginine의 NO synthetase 효소로부터생성되는물질로단시간동안존재하는반응중간산물이며, 암세포나미생물의성장을저해하는것으로알려졌다 [19, 29]. IL-1β 는감염이나염증에대해면역반응을유발하는초기급성반응의중요한매개물질로숙주세포의증식, 분화, 소멸등과같은다양한세포반응을유도한다. 또한다른 cytokine과 chemokine의분비를유도해면역연쇄반응을촉발하기도한다 [11, 15]. TNF-α는세균감염과악성종양발생시염증과정을조절하거나 intracellular pathogen을억제하여숙주의면역체계내에서광범위한영향을미친다 [10]. 이러한 cytokine은외부침입에대해숙주의면역방어기전에기여하고, 종종암환자나바이러스감염환자들은 cytokine에의해치료되기도한다 [7]. NF-κB는 DNA 전사조절에관여하는단백질복합체이다. 또한 NF-κB는염증성 cytokine 유전자의발현에관여하고감염을방어하기위한 cytokine 생산으로면역반응을조절하는중요한역할을한다 [6]. 본실험에서는개에서분리된 Lactobacillus, Enterococcus, Bifidobacterium 속균주중에서내산성, 내담즙성, 내열성, 병원성억제능등생균제로서의특성이가장우수한상위 4개균주씩, 합계 12개균주를대상으로 NO, TNF-α, IL-1β, NFκB와같은면역활성지표를측정하고, 면역활성이뛰어난것으로잘알려진상업용균주인 LGG균주와비교하였다. 그결과 Lactobacillus L10, Enterococcus S33, Bifidobacterium B3의 3개균주가생균제로서의특성은물론이고면역활성까지모두갖춘최적의개생균제용유산균주로판단되었다. 현재국내외적으로개생균제용유산균주에관한많은연구보고는이루어지지않았지만, Strompfová 등 [31] 이보고한 Enterococcus faecalis EE4균주와 Enterococcus faecium EF01균주는본실험에서최종선발된 Enterococcus faecium S33균주에비해, 박테리오신생성능, 항생제감수성등을추가로보고하고있다. 그러나내산성 (ph 3.0, 3 h), 내담즙성 (1% bile), 장관부착성, 항균활성등의기본특성은선발균주와비슷한결과를나타내었고, 반대로선발균주는내열성, 면역활성등의우수한특성이있었다. 또한개유래의생균제로우수성을보고한 Lactobacillus fermentum AD1균

Lactic acid bacteria suitable for use as canine probiotics 87 주 [30] 와최종선발균주인 Lactobacillus reuteri L10 균주의특성을비교해보면, 내산성, 내담즙성, 장관부착성에서는비슷한특성결과를나타내었지만, 본실험의선발균주는 Lactobacillus fermentum AD1 균주에서없는매우우수한면역활성능력을나타내었다는특징을갖고있었다. 그러나본실험에서는최종선발균주를사용한동물임상효능실험을아직시행하지않았기때문에추후개를대상으로한효능실험이진행되어야할것으로판단되었다. 앞으로최종선발균주를대상으로실제동물실험을진행하고, 임상효능검증연구가뒷받침된다면, 다른산업동물에비해많은연구가진행되지않은개생균제용유산균주개발에활용가치가매우높을것으로생각된다. 감사의글 이논문은 2012 년도충북대학교학술연구지원사업의연구비지원에의하여연구되었습니다. References 1. Ahn SB, Park HE, Lee SM, Kim SY, Shon MY, Lee WK. Characteristics and immuno-modulatory effects of Weissella cibaria JW15 isolated from Kimchi, Korea traditional fermented food, for probiotic use. J Biomed Res 2013, 14, 206-211. 2. Beasley SS, Manninen TJK, Saris PEJ. Lactic acid bacteria isolated from canine faeces. J Appl Microbiol 2006, 101, 131-138. 3. Bernet MF, Brassart D, Neeser JR, Servin AL. Lactobacillus acidophilus LA 1 binds to cultured human intestinal cell lines and inhibits cell attachment and cell invasion by enterovirulent bacteria. Gut 1994, 35, 483-489. 4. Brandão RL, Castro IM, Bambirra EA, Amaral SC, Fietto LG, Tropia MJM, Neves MJ, Dos Santos RG, Gomes NCM, Nicoli JR. Intracellular signal triggered by cholera toxin in Saccharomyces boulardii and Saccharomyces cerevisiae. Appl Environ Microbiol 1998, 64, 564-8. 5. Byun JW, Kim GT, Bae HS, Baek YJ, Lee WK. In vitro selection of lactic acid bacteria for probiotic use in pigs. Korean J Vet Res 2000, 40, 701-706. 6. Cato AC, Wade E. Molecular mechanisms of antiinflammatory action of glucocorticoids. Bioassays 1996, 18, 371-378. 7. Capuron L, Hauser P, Hinze-Selch D, Miller AH, Neveu PJ. Treatment of cytokine-induced depression. Brain Behav Immun 2002, 16, 575-580. 8. Choi HJ, Kim JY, Shin MS, Lee SM, Lee WK. Immunomodulatory effects of bacteriocin-producing Pediococcus pentosaceus JWS 939 in Mice. Korean J Food Sci Anim Resour 2011, 31, 719-729. 9. Collington GK, Parker DS, Armstrong DG. The influence of inclusion of either an antibiotic or a probiotic in the diet on the development of digestive enzyme activity in the pig. Br J Nutr 1990, 64, 59-70. 10. Derouich-Guergour D, Brenier-Pinchart MP, Ambroise- Thomas P, Pelloux H. Tumour necrosis factor α receptors: role in the physiopathology of protozoan parasite infections. Int J Parasitol 2001, 31, 763-769. 11. Dinarello CA. Biologic basis for interleukin-1 in disease. Blood 1996, 87, 2095-2147. 12. Fleming HP, Etchells JL, Costilow RN. Microbial inhibition by an isolate of Pediococcus from cucumber brines. Appl Microbiol 1975, 30, 1040-1042. 13. Fuller R. Probiotics in man and animals. J Appl Bacteriol 1989, 66, 365-378. 14. Handl S, Dowd SE, Garcia-Mazcorro JF, Steiner JM, Suchodolski JS. Massive parallel 16S rrna gene pyrosequencing reveals highly diverse fecal bacterial and fungal communities in healthy dogs and cats. FEMS Microbiol Ecol 2011, 76, 301-310. 15. Introna M, Breviario F, d Aniello EM, Golay J, Dejana E, Mantovani A. IL-1 inducible genes in human umbilical vein endothelial cells. Eur Heart J 1993, 14 (Suppl K), 78-81. 16. Jordan KN, Cogan TM. Heat resistance of Lactobacillus spp. isolated from Cheddar cheese. Lett Appl Microbiol 1999, 29, 136-140. 17. Kimoto H, Kurisaki J, Tsuji NM, Ohmomo S, Okamoto T. Lactococci as probiotic strains: adhesion to human enterocytelike Caco-2 cells and tolerance to low ph and bile. Lett Appl Microbiol 1999, 29, 313-316. 18. Lim HJ, Kim SY, Lee WK. Isolation of cholesterol-lowering lactic acid bacteria from human intestine for probiotic use. J Vet Sci 2004, 5, 391-395. 19. Marletta MA. Nitric oxide synthase structure and mechanism. J Biol Chem 1993, 268, 12231-12234. 20. Mitsuoka T. A Color Atlas of Anaerobic Bacteria. 1st ed. pp. 45-54, Sobunsha, Tokyo, 1980. 21. Nathan C. Nitric oxide as a secretory product of mammalian cells. FASEB J 1992, 6, 3051-3064. 22. Pato U. Bile and acid tolerance of lactic acid bacteria isolated from dadih and their antimutagenicity against mutagenic heated tauco. Asian-Australas J Anim Sci 2003, 16, 1680-1685. 23. Perdigón G, de Macias ME, Alvarez S, Oliver G, de Ruiz Holgado AP. Systemic augmentation of the immune response in mice by feeding fermented milks with Lactobacillus casei and Lactobacillus acidophilus. Immunology 1988, 63, 17-23. 24. Perelmuter KM, Fraga M, Zunino P. In vitro activity of potential probiotic Lactobacillus murinus isolated from the dog. J Appl Microbiol 2008, 104, 1718-1725. 25. Ryu JS, Han SK, Shin MS, Lee WK. In vitro selection of lactic acid bacteria for probiotic use in pig. Korean J Vet Serv 2009, 32, 33-41. 26. Sahadeva RPK, Leong SF, Chua KH, Tan CH, Chan HY, Tong EV, Wong SYW, Chan HK. Survival of commercial probiotic strains to ph and bile. Int Food Res J 2011, 18, 1515-1522. 27. Shin MS, Han SK, Ji AR, Ham MR, Kim KS, Lee WK. Isolation and characteristics of bacteriocin-producing bacteria from the intestine of duck for probiotics. J Anim Sci Technol 2007, 49, 621-632. 28. Simpson PJ, Stanton C, Fitzgerald GF, Ross RP. Intrinsic tolerance of Bifidobacterium species to heat and oxygen and survival following spray drying and storage. J Appl Microbiol 2005, 99, 493-501. 29. Snyder SH, Bredt DS. Biological roles of nitric oxide. Sci

88 박수민 박호은 이완규 Am 1992, 266, 68-77. 30. Strompfová V, Marcináková M, Simonová M, Bogovic - Matijaši cí B, Lauková A. Application of potential probiotic Lactobacillus fermentum AD1 strain in healthy dogs. Anaerobe 2006, 12, 75-79. 31. Strompfová V, Lauková A, Ouwehand AC. Selection of enterococci for potential canine probiotic additives. Vet Microbiol 2004, 100, 107-114. 32. Tadesse G, Ephraim E, Ashenafi M. Assessment of the antimicrobial activity of lactic acid bacteria isolated from Borde and Shamita, traditional Ethiopian fermented beverages, ê ê on some food borne pathogens and effect of growth medium on the inhibitory activity. Internet J Food Saf 2005, 5, 13-20. 33. Vandenbergh PA. Lactic acid bacteria, their metabolic products and interference with microbial growth. FEMS Microbiol Rev 1993, 12, 221-237. 34. Wold AE. Immune effects of probiotics. Scand J Nutr 2001, 45, 76-85. 35. Zinedine A, Faid M. Isolation and characterization of strains of Bifidobacteria with probiotic proprieties in vitro. World J Dairy Food Sci 2007, 2, 28-34.