Bimaterials Research (2005) 9(4) : 212217 Bimaterials Research 7 The Krean Sciety fr Bimaterials œw βjp αjm fs x w w š Hematlgical and Histlgical Examinatin f βchitin and αchitsan Scafflds fr Tissue Engineering Á * M Sang Chng and Yung M Lee* Š Š Š ŒŠ Š Schl f Chemical Engineering, Cllege f Engineering, Hanyang University, Seul 133791, Krea (Received August 3, 2005/Accepted Nvember 16, 2005) βchitin and αchitsan were cmpared fr scafflds fr tissue engineering. T investigate their bicmpatibility, β chitin and αchitsan spnges were implanted subcutaneusly n the abdmen f adult Wister rats. After implantatin fr 3, 7 and 15 days, hematlgical tests were cnducted measuring white bld cell (WBC) cunt, erythrcyte sedimentatin rate (ESR), the amunts f creactive prtein (CRP) and neutrphil in WBC. In additin, histchemical evaluatin was carried ut using H&E stain. The fibrblastic grwth, inflammatry infiltrates, and cllagen stain were evaluated. Hematlgical and histlgical study revealed that the results f the βchitin scaffld was better than thse f the αchitsan scaffld in terms f bicmpatibility fr tissue engineering. Key wrds: βchitin, αchitsan, Scaffld, Implantatin, Hematlgical studies, Histlgical studies tg (bimaterials) t f Œfd f tf f tš eš t f f g hf ff t d Œ, t til ht tf ff f f f ff~ f f f ŠŠ f g f d hf d l hf f. f Š t g j f g Š, f vih, s g f f f d d. ff Š g f, f thš f Š f l, ~, ~ f s f Š hš. il Šf fdš f g f f Š ff f f Œ hf thš f d Š il Šd g f f. 1,2) ~ f thš, Š, lœ sx f fš Š, h t, lœh f il g f tl f eš sx h f d ff, ~ f hš dš f Š eš ~ ŒŒ~f ~ f f fšd g f. ~ f e f e f f i ~ ƒ Œ~ ff, f f f i f dš f rf ~. g hf f d f f ef ˆ *sf hf: ymlee@hanyang.ac.kr Š lf if ~ lf, f Š t hš f. 3,4) Šx f ef vv ~ lf ~ ƒf f i l f f l f ~ l ƒ f f., f f ~ ~ l Š thš Š rf f ll, ƒ il Šd llt f ƒ f thš Š h Š Š f., β~ z hiš t f f ilšh, Œ Šh Œ rš f Š. ƒ, d Wistar ratf fdš in viv ~ f Š hi l t f thš rš f Œ Šhf ilšhf f Šf Š Š f Š. 5) Š, g lltd g f d f α~ z i f Š Œ Š f Š. d β~ f fh f Š x(squid pen) f, 6) h f f 3 10 5 f. α~ f x fš f, ~ Œ 85%f. f ~ f 2 j % ƒ d f e Š 0.1N NaOH xh z. x 212
조직공학용 지지체로서 β 키틴과 α 키토산 스케폴드의 혈액학 및 조직학적 고찰 침전된 석출물은 증류수로 씻어내고, 60 C 진공오븐에 말린 후 사용하였다. N,NDimethylacetamide (DMAc)와 LiCl은 덕산화 학 으로부터 구입하였다. 초순수는 역삼투압 시스템(삼보글로브, 안산)으로 처리한 후 MilliQ Plus system (Water, Millipre, Billerica, U.S.A.)으로 다시 한번 더 처리하여 사용하였다. 다른 화학물질들은 시약급을 사용하였으며, 더 이상의 정제없이 사 용하였다. β 키틴 스케폴드의 제조 β키틴 스케폴드는 이전에 발표한 방법으로 제조하였으며, 요약하면 다음과 같다. 키틴 파우더를 2중량%로 5중량% LiCl/ DMAc에 녹인다. 이물질을 제거하기 위하여 키틴 용액을 유리 필터로 걸러낸다. NaCl (입자 평균직경 = 300500 µm)입자를 키틴 용액에 넣고(NaCl 중량:Chitin 중량 = 1:300) 균일하게 교반한다. NaCl 입자를 함입한 키틴용액을 테플론판(깊이 =2 mm)에 넣고 1분동안 350 kgf/cm 으로 누른 후 90 C 진 공오븐에서 건조시킨다. 건조된 메트릭스를 초순수에 2일동안 담구어 둔다. 이때 메트릭스안의 NaCl, LiCl과 DMAc 잔류물 들이 빠져나가게 된다. 입자의 용해로인해 형성된 다공성 메트 릭스를 깨끗이 수세하고 75 C로 얼린 후 냉동 건조한다. β키틴 스케폴드는 ethylene xide (EO) gas멸균 처리하여 실험 에 사용하였다. α 키토산 스케폴드의 제조 α키토산 스케폴드는 냉동건조법을 이용하여 제조하였다. 2 중량% 아세트산 수용액에 키토산 1중량%를 넣고 하루 동안 교반한다. 용해된 키토산 용액을 페트리디쉬에 붓고(깊이 =2 mm) 75 C 냉장고에 얼린 후 냉동건조 한다. 키토산 아민기와 콤플렉스를 형성하고 있는 아세트산 잔기를 제거하 기 위하여 0.1N NaOH 수용액에 한시간정도 담그어 둔 후 초순수에 하루정도 정치시켜 놓는다. 키토산 메트릭스를 다 시 75 C 냉장고에 얼린 후 냉동건조 한다. α키토산 스 케폴드는 ethylene xide (EO) gas멸균 처리하여 실험에 사 용하였다. 동물실험 생체적합성 고분자 재료의 생체 적합성과 염증정도를 알아보 기 위하여 혈액학적인 방법과 조직학적인 방법을 이용하여 비 교, 분석함으로써 생체적합성 여부와 염증정도의 상관관계를 비 교하였다. 이에 혈액학적인 방법으로는 백혈구 수(white bld cell cunt : WBC cunt)검사, 백혈구 중 호중구의 백분율 (neutrphil %), C 반응성 단백질(creactive prtein : CRP)검 사, 적혈구 침강속도(erythrcyte sedimentatin rate : ESR)검사 를 하였으며, 조직학적인 방법으로는 H&E stain과 교원섬유를 선별적으로 염색하기 위한 Massn's trichrme stain과 van Giesn's stain을 이용하여 섬유아세포의 증식 여부와 염증에 따른 염증세포들을 관찰해 보았다. 알코올과 베타딘으로 소독 후 배 부분을 절개하고 재료를 넣 6) 2 213 지 않고 그냥 봉합만을 한 Wistar rat를 cntrl로 하여 각 재료를 넣고 실험한 Wistar rat의 혈액학적 데이타와 조직학적 데이타를 비교하였다. 대상 및 수술방법 생체고분자 재료들의 생체적합성 여부와 염증정도를 알아보 기 위하여 약 300 g의 웅성 Wistar rat(각 재료, 날짜 마다 n = 5)을 이용하였으며 실험동안에는 충분한 수분과 영양을 공급해 주었다. 생체고분자 재료들로는 β키틴과 α키토산 재 료(n = 2)를 이용하였으며 이들 각각 재료들을 sdium pentbarbital (Wistar rat 무게 1 g당 0.1 ml) 마취 하에 Wistar rat의 배 부분을 알코올과 베타딘으로 소독한 후 25 mm정도 절개한 뒤 표피층에 15 15 mm 크기의 재료를 왼쪽 부분에 동일하게 넣은 후에 vicryl 2번 봉합사를 이용하여 봉 합하였다 (Figure 1). 혈액채취 및 조직검사 표본제작 수술한 Wistar rat을 재료별로 각각 3일, 7일, 15일 후에 scalp vein set와 3 cc syringe를 이용하여 가슴부위에서 에테 르 마취 하에 heart puncture 하여 혈액을 2.5 cc 채취하였으 7,8) Figure 1. Animal test and bld cllectin. Vl. 9, N. 4
214 h Áf ratf wš il eš 10% h. swš Œ f Šf hf ethylene diamine tetra acetic acid(edta, Bectn Dickinsn and Cmpany U.S.A.) f ƒ mix 2 f Œ Š f 10% h Wistar ratf ff r Œ fš lf lš h f g x Š eš e f 34 mm h lf. f g f e 30 30 mm h Š 10% f f ƒ ilšhf Š. Œ wh (WBC Cunt) swš Œ f Šf h ŒŠŠ hœ(whle bld) Culter GenÁS(Beckman Instrument, Inc.) Œ f fdš f, f iš eš f Œ w hf ŠŠ. f Œ f turk slutin(acetic acid 3 ml 1% gentian vilet 1 ml D.W 100 ml sd d )f 1:20 Š g ŒŠŠ neubauer chamber hemcytmeter(cunting chamber) fdš Œ Š. f neubauer chamber Œ f f Œ Œ f f Œ 1µl f l 1mm 3 f whš. 9,10) Œ j Œj f e swš Œ f Šf h ŒŠŠ hœ h f wedge f fdš f i ~ f wright stain (400 ) Œj f ef vš. 11,12) Š f Œ fdš f Culter GenÁS TM g Œ j Œj (neutrphil)f % vš, Culter GenÁS TM g f whe V.C.S technlgy f fdš. f Œ f i Šhf ƒl (lymphcyte), Š (mncyte), Œj (neutrphil), Œ (esinphil) Œ (basphil) Š eš Š f ƒl j Šf } lf, Š lf e, f ~ f išhf Š f Š f Š ~ f. C f l(creactive Prtein : CRP) swš Œ Šf h f hœf 3400 rpm centrifuge z Œg(plasma)f Š, f Œg(plasma)f Š IMMAGE TM immunchemistry system(beckman Instrument, Inc.) fdš mg/dlf e ~. IMMAGE TM immunchemistry system rate nephelmetry methd(ifcc) e serum antiserumf ff Œ~ fdš vš f. 13) ESR (Erythrcyte Sedimentatin Rate) swš Œ f Šf h ŒŠŠ hœ Espette (Krmed Instrument)f fdš 100 mm f d 1, 2, 3 l ~. Šf h g ŒŠŠ 2ml f ff Š dw 100 mm l hœš sd l f e 1 f l f f f 2, 3 f l f f Š ( 1 f f f Š Wistar rat ESR x 2, 3 l ŒfŠ.). 14,15) HematxylinEsin Stain (H&E Stain) & Cllagen Stain H&E stainf f hf Š lf Š f Šf hematxylinf 1r ~, i f esinf lf Š f Šf t ˆ f lf Œ Œ f. Cllagen stainf e e hf Š f Massn's trichrme van Giesn's f fdš. f irn hematxylinf Šf Š, acid fuchsinf lf Š, aniline blue light greenf tilf t f ~. van Giesn's f cllagen fiber acid fuchsin ƒfhf ŠŠ ~ilf picric acid fš f. 16,17) š β~, α~, cntrlf 3f, 7f, 15f Œ f swš. l 5 f fdš f f f f ~ (Tables 1, 2). x w Œ Šhf u Œ, Œj e, hœ x, C f lf l Š cntrl Table 1, β~ α~ f Table 2 ~. ft lf l Šf jdš l l f Š lf Šf Š h ŒŠ thš l Š f Š. Wistar rat f Œ Šhf WBC cunt CRP f t r l lf f f } l Š f Table 1. Hematlgical results f cntrl wistar rat WBC cunt 1 ( 1000/µl) Neutrphil Creactive prtein 3 % 2 (mg/dl) 3 days 4 8.54±0.85 17±2 1.780±0.075 7 days 4 10.90±0.90 21±1 2.130±0.085 15 days 4 8.32±0.82 19±2 1.980±0.090 1,2 Culter GenÁS TM 3 IMMAGE TM Immunchemistry System 4 Wistar rat : n=5, Arithmetic mean Bimaterials Research 2005
il Šd llt β~ α~ z f Œ Š ilšh r 215 Table 2. Hematlgical results f chitin and chitsan scaffld in viv WBC cunt 1 ( 1000/µl) Neutrphil % 2 Creactive prtein 3 (mg/dl) chitin chitsan chitin chitsan chitin chitsan 3 days 4 18.61±0.98 19.98±0.88 22±2 23±2 1.880±0.070 2.010±0.085 7 days 4 11.04±0.84 14.77±0.95 27±1 22±3 2.210±0.640 2.430±0.100 15 days 4 19.89±0.90 10.09±1.00 20±1 20±2 1.900±0.084 1.997±0.055 1,2 Culter Gen S TM 3 IMMAGE TM Immunchemistry System 4 Wistar rat : n=5, Arithmetic mean f f Wistar rat f ESR f Œ f ~. f f Wistar ratf bld v f f f l. Š Wistar ratf Œ ft f Š f Œ ~ } f Š f ~ f Œ f e ft f h f Œ j Œj hf f e (4071%) igš Wistar rat g f e (8090%) igš f ~. Š l lf t f lf Œj f f l Š f ~. Table 2 β~ α~ f hf 3f 7 f l WBC CRP l Š v f ff, 15f lh Š v f f. 3ff β~ f d WBC, CRP f f f 7f WBCf d l Š CRP l Š ~., β~ Š α~ f d 3 ff β~ f f l f ff, 7f f WBC f Š l CRP f l f f. f f lf ff ~ 7f lf α~ f β~ Š d Š f ~. 15ff d l, l(subacute inflammatin)f r f β~ f WBC, CRP x 7ff Š f f f f. lf f sxe 15f lš l f f. Šl α~ f d 15ff WBC, CRP fl Š f f β~ Š sxe hf β~ f f f f. g f Š f matrix f WBC CRP h α~ g h Š f ~ f, β~ g f d lh f cntrlf d } rf fl. w β~ α~ f ilšh Figures 24 ~. β~ f d 3f freign bdy giant cellsf r, matrixf j f e f l fibrin materialsf xrf. 7f z f r Figure 2. Histlgical crsssectins f βchitin (a, c,and e) and α chitsan (b, d, and f) scafflds after 3 days. (ab) H&E stain ( 200), (cd) Massn's trichrme stain ( 200), and (ef) van Giesn's stain ( 200). Arrws indicate neutrphils in (a, b, and d). l ff j ~. 15f z f l r. 3f 15f l matrix l Œj r, j il i f hš f, f xe, Œ f l eœ t r. α~ f d 3f 15f l h matrix ff f Œj f xef β~ Š hf r. 3f matrix Vl. 9, N. 4
정무상 이영무 216 Histlgical crsssectins f βchitin (a, c, and e) and αchitsan (b, d, and f) scafflds after 7 days. (ab) H&E stain ( 200), (cd) Massn's trichrme stain ( 200), and (ef) van Giesn's stain ( 200). Arrws indacate freign bdy giant cell in (b) and cllagen (c). Histlgical crsssectins f βchitin (a, c, and e) and αchitsan (b, d, and f) scafflds after 15 days. (ab) H&E stain ( 200), (cd) Massn's trichrme stain ( 200), and (ef) van Giesn's stain ( 200). Arrws indicate cllagen in (c, d, and e). 주변조직에 부종과 림프구 침윤이 보였고, 7일에는 염증과 관 련된 대식세포와 freign bdy giant cell이 관찰되었으며 matrix 사이에는 섬유아세포의 증식과 fibrin의 소량 침착이 관 찰되었다. 15일의 경우 울혈된 혈관 및 모세혈관의 증식이 관 찰되었으며 간질 섬유화도 동반되는 등 염증치유와 관련된 모 든 부분에서 상대적으로 늦게 치유되는 경향을 보였다. 의 증식과 연결조직형성을 자극하는 생물학적 특성을 보여준 다. 또한 피부의 상처치료효과를 증진시키는 상처도포제 역할 을 하고 있다. 키틴과 키토산은 구조적으로 셀룰로오스와 유사 한 점이 많은 다당류로, 피라노오스환의 C 위치에 셀룰로오스 는 수산기, 키틴은 N아세틸기, 키토산은 아미노기로 서로 다 르고 나머지는 같다. 키틴의 결정구조는 채취되는 생물체의 종 류와 부위에 따라 3종이 발견되었다. α키틴은 게, 새우 등의 갑각류에서 흔히 발견되며, 키틴 분자쇄가 서로 역방향이 되어 분자 내와 분자 간 수소결합이 이루어지므로 결정 구조가 안 정하다. 반면 β키틴은 α키틴에 비해 그 존재량이 매우 적고 오징어 연골 등에서 발견되고 있는데, 인접하는 분자쇄끼리 서 로 평행한 상태를 유지하고 있다. γ키틴의 구조는 서로 확실 하게 밝혀져 있지 않다. 한치와 같은 공급원으로부터 추출되는 키틴질은 베타 쉬트의 분자 구조를 가지고 있어 일반 게껍질로부터의 키틴질과는 다 른 특성을 보인다. 그러나, 이와 같은 베타 키틴질에 대한 생 체적합성에 관한 고찰은 이루어지지 않았고, 특히 조직공학용 Figure 3. 결 론 최근 인공 신장과 혈관, 봉합사, 상처치유촉진제 및 치과와 안과용 재료 등의 생체적합성 재료와 의약품 소재로 각광을 받 고 있는 키틴과 키토산은 생체적합성, 멸균성, 기계적 물리적 성질 및 성형 가공성이 우수한 재료이다. 키틴은 분자 사슬이 알파 헬릭스 구조와 베타 쉬트 형태로 나뉠 수 있으며, 이렇게 구분된 분자 사슬의 구조에 따라 많은 용해도 및 물성의 차이 를 나타낸다. 키토산은 양이온성 공중합체로써 자연계의 키틴 을 탈아세틸화함으로써 얻어진다. 키토산과 그 유도체는 세포 Bimaterials Research 2005 Figure 4. 2 1821)
il Šd llt β~ α~ z f Œ Š ilšh r 217 llt f ƒ f thš Š h Š Š f. f β~ z hiš α~ z f thš Š Š. hiš β~ α~ lf Œ hš ilhš f whš h, ft Š f WBC cunt, CRP, Œ j Œj f e, ESR Wistar rat fš ff ~ f ŒfŠ. Š f Š f fdš f g t f Š l ff f l f matrix f WBC CRPf h α~ g h g Š f ~ f, β~ g f d lh f cntrlf d f } rf f l ff f. ilšhf f matrixf t ff hf rš t f Œj x ef f l ff f f hš l f i Š h ƒ α~ g hš. β~ g Œ Šhf α~ g d Š f, ilšhf lh sxe h d Š f ~. f β~ z e (culture)š z Œd f f. š x 1. J. J. Y and I. W. Lee (Eds.), Tissue Engineering : Cncepts and Applicatin, Krea Medical Bk Publisher, 1998, pp. 2136. 2. R. Lanza, R. Langer, and W. L. Chick (Eds.), Principles f Tissue Engineering, R. G. Landes Cmpany, Austin, 1997. 3. A. Tlaimate, J. Desbrieres, M. Rhazi, and A. Alagui, Cntributin t the preparatin f chitins and chitsans with cntrlled physicchemical prperties, Plymer, 44, 79397952 (2003). 4. G. I. Hwling, P. W. Dettmar, P. A. Gddard, F. C. Hampsn, M. Drnish, and E. J. Wd, The effect f chitin and chitsan n the prliferatin f human skin fibrblasts and keratincytes in vitr, Bimaterials, 22, 29592966 (2001). 5. S. R. Hng, M. S. Chng, Y. M. Lee, K. W. Sng, M. H. Park, and S. H. Hng, Bicmpatibility and bidegradatin f crsslinked gelatin/hyalurnic acid spnge in rat subcutaneus tissue, J. Bimater. Sci. Plymer, 15, 201214 (2004). 6. S. B. Lee, Y. H. Kim, M. S. Chng, and Y. M. Lee, Preparatin and characteristics f hybrid scafflds cmpsed f βchitin and cllagen, Bimaterials, 25, 23092317 (2004). 7. T. M. Macled, G. Williams, R. Sanders, and C. J. Green, Histlgical evaluatin f Permacl as a subcutaneus implant ver a 20week perid in the rat mdel, Br. J. Plast. Surg., 58, 518532 (2005). 8. D. H. Lew, S. M. Kim, S. J. Ahn, and B. Y. Park, Histmrphmetric Study f Tissue Reactin f GreTex Implant in the Rat mdel, J. Krean Sc. Plast. Recnstr. Surg., 27, 247252 (2000). 9. J. B. Henry, Clinical Diagnsis and Management by Labratry Methds, W. B. Saunders Cmpany, 1996. 10. ½«, «µ, žà, Ÿ, ², ½, ³,, Hematlgy, Krea Medical Bk Publisher, 2001, pp. 95 97. 11. V. Marks, T. Cantr, D. Mesk, R. Pullmann, and G. Nsalva (Eds.), Differential Diagnsis by Labratry Medicine, Springer, 1998, pp. 428429. 12. L. Heilmeyer and H. Begemann (Eds.), Atlas f Clinical Hematlgy, SpringerVerlag Berlin Heidelberg New Yrk, 1983. 13. M. L. Bishp, J. L. DubenEngelkirk, and E. P. Fdy (Eds.), Clinical Chemistry, Lippinctt, 1996. 14. ½«, «µ, žà, Ÿ, ², ½, ³,, Technical Hematlgy, Krea Medical Bk Publisher, 1992, pp. 8792. 15. «, ³,, ª ¼ ¹», 2000, pp. 147150. 16. M. H. Rss and E. J. Reith (Eds.), Histlgy, Harper & Rw Lippinctt, 1985. 17. T. S. Leesn, C. R. Leesn, and A. A. Papar, Histlgy, Seinders, 1998. 18. S. W. Lee, Y. T. Lim, S. D. Kng, J. W. Ryu, and U. Y. Lee, Bicmpatibility fr the rat f chitsan, Krean J. Bitechnl. Bieng., 16, 302306 (2001). 19. S. H. Park, E. C. Jang, C. H. Kim, and T. I. Sn, Preparatin and prperty f nnwven chitsan scaffld fr tissue regeneratin, Krean J. Chitin and Chitsan, 8, 1823 (2003). 20. G. Falini, S. Fermani, and A. Ripamnti, Crystallizatin f calcium carbnate salts int betachitin scaffld, J. Inrg. Bichem., 91, 475480 (2002). 21. G. Falini, S. Fermani, and A. Ripamnti, Oriented crystallizatin f ctacalcium phsphate int betachitin scaffld, J. Inrg. Bichem., 84, 255258 (2001). Vl. 9, N. 4