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1 Bimaterials Research (2005) 9(4) : 1997 Bimaterials Research 7 The Krean Sciety fr Bimaterials qk p j», k» e w Effect f Size, Crystallinity and Cntent f Carbnate Ins f Apatite Crystals n Ostecnductivity ½x 1 Á x 1 Á z 1,2 * Á 1 Á 1,2 Á yû Á Á s 2, Áw x 4 Hyung Sup Kim 1, Yn-Hyuk Jang 1, Sang-Hn Rhee 1,2 *, Yng-Keun Lee 1, Bum-Sn Lim 1,2, Yang-J Sel, Chng-Pyng Chung 2,, and Sang Hyuk Han 4 1 d Š xfš Še xfš x tg Š, 2 Š Šg, l Œ t Š d Š xfš Še xfš xj Š, 4  f 1 Dept. Dental Bimaterials Science and Dental Research Institute, Schl f Dentistry, Seul Natinal University, Seul , Krea 2 KOSEF, Intellectual Bi-Interface Engineering Center (IBEC), Seul , Krea Dept. Peridntlgy and Dental Research Institute, Schl f Dentistry, Seul Natinal University, Seul , Krea 4 NIBEC, Inc., Seul , Krea (Received May 25, 2005/Accepted Octber 17, 2005) The effect f crystal size, crystallinity and cntent f carbnate ins in apatite crystal n stecnductivity was studied. The apatite granules derived frm bvine trabecular bne were heat-treated at 600 C and 1000 C fr hurs, respectively. The cntent f carbnate ins in the apatite structure was assessed by FT-IR and its crystallinity was evaluated by X-ray diffractmetry. The micrstructure was assessed by field emissin electrn micrscpy. Apatite granules heattreated at 600 C and 1000 C were implanted int the calvaria f New Zealand White rabbits fr 4 weeks, respectively, and the undecalcified grund histlgic specimens stained with hematxylin and esin were bserved. The crystal size, crystallinity and the carbnate ins cntent f the apatite granules heat-treated at 600 C was much smaller, lwer and higher, respectively, cmparing t thse heat-treated at 1000 C. The apatite granules heat-treated at 600 C als shwed much better stecnductivity cmparing t that heat-treated at 1000 C. The results were explained by the crystal size, crystallinity and the cntent f carbnate ins in the apatite structure. Key wrds: Apatite, Xengraft, Crystal size, Crystallinity, Carbnate ins, Ostecnductivity ~fƒ igš l t h h f d Š f h f g x hœd f f ƒ vlg g Œ d f lf. f Š f lš f f h Š vlg e } f, i, fi, Š g lf f Š f i f g d Š h (stecnductivity)f f Š f g f h f f f h f. f f i igš Œ l(bne mrphgenetic prtein) Œf gff(grwth factr) f Šhf dff h x f hš f, f Š h f rf ~fƒ fff h ~ f fš f h ff, ~fƒf h f Š ~ f f f h *sf hf: rhee121@snu.ac.kr f f. 1-) f f i f d hš d, h f h f Š f Š f Š f j f l f. Šl Š ~fƒf d, fhš } Œ~ Š eš hf t Š f ~fƒ f h l ~fƒ i f ~ ŒŠ f Œ~ f Œ~ v s f r f h h f ~ ŠeŠ ~ fƒf Œ~ f d ŠŠ. f i f l f hš w Š f l f h, h ~ f hhf Š Š eš h f f fi f df. f hf l fi f d, d Œ~ l Š l j igš ~fƒ s Š h Š e i j dš ~ (demineralized bne matrix) j igš lf e Š e lf h Š ~fƒ t f 19

2 김형섭 장윤혁 이상훈 이용근 임범순 박호남 설양조 정종평 한상혁 194 용하게 되는 탈단백골(deprtenized bne mineral)이 있다. 탈회골의 경우 골 형성 단백질 등을 내포하고 있어 골 형성에 유리한 것으로 알려졌으나 이종 단백질에 의한 면역반응 문제 와 광우병과 같은 인수공통 전염병에 의한 감염문제 등이 최 근 심각하게 대두되고 있어 현재는 이의 사용이 많이 감소하 고 있다. 반면 탈단백골의 경우 탈회골에 비해 상대적으로 연구가 적 었고 실제 임상에 사용되는 탈단백골의 경우도 그 물성이 자 세히 알려진 경우는 드물다. 또한 아파타이트의 결정도 및 탄 산기의 양이 골 전도도에 큰 영향을 미치는 것으로 알려져 있 지만 아직까지 탈단백골을 이용하여 이를 체계적으로 평가한 경우는 없었다. 따라서 본 연구에서는 소의 해면골에서 채취한 이종골을 이용하여 탈단백골을 제조할 때, 열처리 온도에 따라 달리 얻어지는 아파타이트의 크기, 결정도 및 아파타이트 구조 내에 존재하는 탄산기의 양이 실제 골 전도도에 미치는 영향 을 알아보고자 하였다. 4) 실험방법 결과 및 고찰 Figure 1은 600 C와 1000 C에서 시간 동안 각각 열처리 후 주사전자현미경을 이용하여 저배율에서( 0) 관찰한 아파타 이트 과립으로서 두 시편 모두 약 200~400 µm의 크기 범위 를 가지고 있으며 서로 유사한 형상을 갖고 있음을 알 수 있다. Figure 2는 역시 600 C와 1000 C 에서 시간 동안 각각 열처리 한 시편을 주사전자현미경을 이용하여 고배율에서 관찰 한 결과로서 600 C에서 열처리한 경우 아파타이트 입자의 크 기는 약 20 nm 정도였고 1000도에서 열처리한 경우는 약 800 nm 정도의 크기로서 크기 차이는 약 40배 정도였다. 이 는 열처리 온도가 증가함에 따라 아파타이트 입자의 입성장이 빠르게 일어났기 때문인 것으로 생각된다. Figure 은 역시 600 C와 1000 C 에서 열처리된 두 시편 을 XRD를 사용하여 상 분석한 결과로서 두 경우 모두 순수한 실험에 사용된 소의 해면골은 나이벡에서 OCS-B 를 제 조 시 사용되는 원료를 제공받아 사용하였으며 탈지 및 탈단 백 과정을 거친 후 600 C와 1000 C의 온도에서 각각 시간 동안 열처리 하여 유기물이 제거된 아파타이트 과립을 제조하 였고 체질을 통한 최종 아파타이트 과립의 크기는 212~425 µm 범위였다. 두 온도에서 각각 열처리된 아파타이트 과립은 방사전계형 주사전자 현미경 (FE-SEM; S-4700, Hitachi)을 이용하여 미세 구조를 관찰하였다. 또한 열처리된 아파타이트의 결정도는 Xray diffractmetry (XRD; D8 Advance, Bruker)를 사용하여 peak의 bradening 정도로 판단하였고 탄산기의 상대적인 양 은 Furier transfrmed infrared spectrscpy (FT-IR; ThermNiclet, Nexus)을 이용하여 측정하였다. 골 전도도 실험은 4마리의 뉴질랜드산 백색 가토를 이용하 였으며 염산 자일리신(Rmpun, 한국바이엘)과 염산 케타민 (Ketalar, 유한양행)을 1:4로 혼합 후 주사하여 마취하고, 두부 의 정수리 부분의 털을 깎고 ptadine으로 소독한 후 2% 리 도카인으로 국소마취를 추가로 실시하였다. 소독된 두피의 정 중선을 따라서 cm정도 절개한 후, 골 막을 박리하여 두개 골을 노출시켰다. 내경 8 mm의 trephine bur (i implant innvatin)를 이용하여 좌우의 측두골에 대칭으로 2개의 원형 골 결손부를 형성하였다. 이때 두개골의 열손상을 방지하기 위 하여 충분한 식염수로 관주 하였으며, 두개골 하방의 뇌막에 손 상을 주지 않도록 주의하였다. 이렇게 형성된 원형의 골 결손 부에 두 가지 온도에서 열처리 된 아파타이트 과립을 각각 넣 은 후에 골 막과 두피를 흡수성 봉합사와 수술용 실크를 이용 하여 봉합하고, 항생제(Kanamycin, 삼양약화학)를 주사하였다. 수술 4주 후에 가토를 CO chamber에 넣어서 희생시키고, 아파타이트 과립이 이식된 두개부의 조직과 근육 조직을 수거 하였다. 그 후 이를 포르말린용액에 넣어 고정시킨 후 통법에 따라 비탈회 표본을 제작하였다. 포매는 super lw-viscsity embedding media (Plyscience Inc.)를 사용하였으며 Exakt cutting 및 grinding system (Exakt-Appreateb)으로 절단, 연마 하여 두께가 약 0 µm이 되는 조직표본을 제작하였다. 그 후 이를 multiple staining 용액으로 염색을 시행한 후 광학현미경 (BH-2 light micrscpe, Olympus Optical C.)하에서 조직 학적 관찰을 실시하였다. 2 Bimaterials Research 2005 SEM micrgraphs f the apatite granules heat-treated at (a) 600 C and (b) 1,000 C fr hurs, respectively ( 0). Figure 1.

3 아파타이트의 크기 결정도 및 탄산기의 양이 골 전도도에 미치는 영향, 195 크기가 약 20 nm 정도로 매우 작은데 반해 1000 C에서 열처 리된 시편의 경우는 Figure 2(b)에서 보는 바와 같이 아파타이 트 입자가 매우 크게 성장하여 잘 발달한 것을 알 수 있다. Figure 4는 역시 두 온도에서 열처리 한 시편의 FT-IR 분석 결과로서 600 C에서 열처리된 아파타이트 과립의 경우 601 cm, 962 cm 및 1024와 1095 cm 에서 각각 phsphate기 의 ν, ν 그리고 ν peak이 관찰되었다. 또한 870, 1410, 1500 cm 부근에서 탄산기가 관찰되어 이는 phsphate기 자 리에 탄산기가 치환된 B-type 아파타이트인 것을 확인할 수 있었다. 반면 1000 C에서 열처리된 아파타이트 과립의 경우 탄산기는 전혀 관찰되지 않는 것으로 보아 고온 열처리 시 산 화되어 탄산가스 형태로 시편을 빠져 나간 것을 알 수 있고, 600 cm 와 572 cm 에서 수산화기(OH) peak이 관찰되어 완 전한 수산화 아파타이트로 변환한 것을 알 수 있다. Figure 5는 600 C와 1000 C에서 각각 열처리된 아파타이트 과립을 백색가토의 두개골에 약 8 mm 크기의 원형결손을 만 들고 매식한 뒤 4주 후의 조직 사진이다. 600 C에서 열처리 한 아파타이트 과립을 매식한 경우의 조직 사진을 보면 진한 자주색의 신생골이 아파타이트 과립의 주변부에 섬유성 결합조 직의 생성 없이 직접 결합하며 성장한 것이 관찰되었다(흰색 화살표). 반면 1000 C에서 열처리한 아파타이트 과립의 경우 는 신생골이 하방부에서 일부 생성된 것이 관찰되나 (흰색 화 살표) 대부분이 섬유성 결합조직으로 둘러 쌓여 있는 것이 관 찰된다(흰색 별표). 한편, 열처리 온도가 낮았을 때는 조직 사 진에서 아파타이트 과립의 색이 밝게 보이고 열처리 온도가 높 았을 때는 어둡게 보였는데 그 차이의 원인에 대해서는 현재 로서는 정확히 알 수 없다. 이상의 결과와 같이 저온과 고온에서 각각 열처리된 아파타 4 1 5) 5,6) SEM micrgraphs f the apatite granules heat-treated at (a) 600 C and (b) 1,000 C fr hurs, respectively ( 10,000). Figure 2. 아파타이트 상 만이 관찰되었으나 peak의 bradening 정도에 서 보듯이 600 C에서 열처리한 아파타이트 과립의 경우는 peak이 매우 brad하여 저 결정성이거나 입자의 크기가 작다 는 것을 알 수 있다. 반면 1000 C에서 열처리 된 아파타이 트 과립의 경우는 peak이 매우 sharp하여 아파타이트의 결정 성이 매우 잘 발달했다는 것을 알 수 있다. 이는 주사전자현미 경의 관찰 결과와도 잘 일치하는 것으로서 Figure 2의 (a)에서 보는 바와 같이 600 C에서 열처리된 시편의 경우는 입자의 XRD patterns f the apatite granules heat-treated at 600 C and 1,000 C fr hurs, respectively. Figure. FT-IR spectrum f the apatite granules heat-treated at 600 C and 1,000 C fr hurs, respectively. Figure 4. Vl. 9, N. 4

4 김형섭 장윤혁 이상훈 이용근 임범순 박호남 설양조 정종평 한상혁 196 발견될 때 600 cm 및 57 cm 부근에서는 OH기가 거의 발견되지 않는데 반해서, 1000 C에서 열처리 된 경우는 탄산 기가 발견되지 않을 때 600 cm 및 57 cm 부근에서 큰 크기의 수산화기가 발견되는 것으로부터 600 C에서 열처리 된 아파타이트 과립의 경우 탄산기가 phsphate기 자리에 치환되 었다는 것을 재확인할 수 있다. 이러한 수산화기의 상대적인 양은 탄산기의 양과 함께 아파 타이트 입자의 크기와도 매우 큰 상관관계를 갖는 것으로 알 려져 있는데 아파타이트 입자의 크기가 작아질수록 큰 비표면 적에 의해서 아파타이트 구조 내에 많은 양의 왜곡된 결합 (distrted bnd)을 야기시키고 이는 아파타이트 결정의 결정도 를 저하시키는 결과를 야기한다. 또한 이렇게 왜곡된 구조를 갖는 아파타이트 입자는 아파타이트 구조 중 6개의 Ca 이온에 의해 형성되는 anin channel의 형태를 역시 왜곡시키게 되고 따라서 이 자리에 일반적으로 위치하게 되는 F-, Cl-, OH- 이 온 중 구 형태를 이루지 않는 수산화기가 위치하기는 어렵게 된다. 실제로 주사전자현미경 사진에서 관찰되는 바와 같이 600 C에서 열처리된 아파타이트 과립에서 발견되는 아파타이 트 입자의 크기는 약 20 nm인데 반해 1000 C에서 열처리된 시편의 경우는 약 800 nm로서 약 40배 이상이 더 큰 것을 알 수 있고 이는 다시 Figure 4에서 보는 것과 같이 600 cm 및 57 cm 부근에서 발견되는 수산화기의 상대적인 양에서도 확인할 수 있다. 또한 XRD 결과 중(Figure ) peak 의 bradening 정도에 의해서도 600 C에서 열처리된 아파타 이트 과립의 경우는 1000 C에서 열처리된 경우에 비해 결정 도가 낮은 것을 확인할 수 있다. 실제 사람의 뼈에서 발견되는 아파타이트 입자는 치아에서 발견되는 아파타이트 입자와 비교 시 그 크기 면에서 10~ 100배 정도 작고 탄산기의 치환양은 크며 결정도는 낮은 것으 로 알려져 있다. 따라서 사람 뼈 중에 존재하는 아파타이트는 이러한 물리적 특징으로 인하여 체내에서 쉽게 용해가 가능하 고 넓은 비표면적에 의해 주위의 유기물과 쉽게 결합이 가능 하기 때문에 remdeling이 끊임없이 발생하여야 하는 체 내 환경에 더 적합한 것으로 알려져 있다. 이상의 결과에서와 같이 600 C에서 열처리한 아파타이트 과 립이 1000 C에서 열처리한 아파타이트 과립에 비해 골 전도 성이 우수한 이유는 600 C에서 열처리한 아파타이트 과립의 경우 아파타이트 입자의 크기가 작고 탄산기의 잔존량이 높으 며 결정도가 낮아서 뼈에 존재하는 아파타이트와 물리 화학 적 성질이 유사, 생체적합성이 우수하기 때문이라고 생각된다. 골 충진재로 사용되기 위하여는 골 전도성 뿐만 아니라 임플 란트 후 일정 기간이 경과한 뒤 remdeling이 이루어 지면서 분해되는 것이 중요한데 이의 확인을 위하여 장기간에 걸친 임 플란트 실험이 현재 진행 중이다. ) 2) Histlgic view f white rabbit calvarial defect filled with the apatite granules heat-treated at (a) 600 C and (b) 1,000 C fr hurs (Multiple staining, riginal magnificatin, 40). The white arrws in the phtgraphs indicate the frmatin f new bne and steid while the white stars indicate the frmatin f fibrus cnnective tissue. Figure 5. 이트 과립은 골 전도성에 있어서 큰 차이를 보였는데 이는 사 람의 뼈 중에 존재하는 아파타이트의 물성에 근거하여 볼 때 아파타이트 입자의 결정도, 탄산기의 양, 그 크기로 설명할 수 있을 것으로 생각된다. 즉, 사람의 뼈 중에 존재하는 아파타이트는 다음 식 (1)과 같이 표현되는 탄산 아파타이트로서 phsphate기가 존재하는 site에 탄산기가 치환된 형태를 이루고 있다고 알려져 있다. Ca [(PO ) (CO ) ](OH) 10-x 4 6-x x (1) 2-x 따라서 실제 이 경우의 Ca/P rati는 화학양론적인 (stichimetric) 아파타이트가 보이는 것과 같이 1.67이 아니고 1.67 이상이 되는데 이는 탄산기의 치환양에 따라 달라지게 된 다. 이러한 탄산기 양의 치환 정도는 FT-IR 상에서 보여지는 탄산기 band의 상대적인 양에 의해서도 확인될 수 있지만 식 (1)에서 보는 바와 같이 수산화기의 상대적인 양으로도 판단할 수 있다. 즉, 식 (1)에서 탄산기의 치환양 (x)이 1이었다고 가 정한다면 식 (1)은 Ca [(PO ) (CO )](OH)이 될 것이고 탄산기 의 치환양이 2라고 가정한다면 식 (1)은 Ca [(PO ) (CO ) ] (empty) 상태가 될 것이다. 본 실험에서 600 C에서 열처리 된 시편의 경우, 870, 1410, 1500 cm 부근에서 탄산기가 ) Bimaterials Research ) 결 론 아파타이트 입자의 크기, 결정도, 및 탄산기의 양이 골 전

5 ~fƒf }, h ~ f f h x 197 x f. e l f Š f dš f f h s Š hf lf Š., s f ~fƒ fff } f h ~fƒ i giš ~ f f. h s ~fƒ fff } ff, h f, ~ f f f h f Œf f ~f ƒ h᜚h lf e Š f f. Š Šg l Œ t Š (IBEC)f le fš f f. š x 1. K. A. Grss and C. C. Berndt, Bimedical applicatins f apatites, in Phsphates: Gechemical, Gebillgical and Material Imprtance, Reviews in Mineralgy and Gechemistry, M. J. Khn, J. Rakvan, and J. M. Huges (Eds.), Mineralgical sciety f America, Washingtn, DC, 2002, Vl. 48, pp J. C. Ellit, Calcium phsphate biminerals, in Phsphates: Gechemical, Gebillgical and Material Imprtance, Reviews in Mineralgy and Gechemistry, M. J. Khn, J. Rakvan, and J. M. Huges (Eds.), Mineralgical sciety f America, Washingtn, DC, 2002, Vl. 48, pp B. Wpenka and J. D. Pasteris, A mineralgical perspective n the apatite in bne, Mater. Sci. Eng. C, 25, 114 (2005). 4.P. Brwn, M. A. Preece, and R. G. Will, Friendly fire in medicine: hrmnes, hmgrafts, and Creutzfeldt-Jakb disease in the UK, Lancet, 40, (1992). 5. J. C. Ellit, Hydrxyapatite and nnstichimetric apatites, in Structure and Chemistry f the Apatites and Other Calcium Orthphsphates, Studies in Inrganic Chemistry 18, Elsevier, Amsterdam, 1994, pp S.-H. Rhee, Synthesis f hydrxyapatite via mechanchemical treatment, Bimaterials, 2, (2002). Vl. 9, N. 4

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