대한임상검사학회지 : 41권제2호, 47-51, 2009 ISSN 1738-3544 소변검체에서분리된 Cysteine 요구성 Escherichia coli 1 예 서울대학교병원진단검사의학과 1, 서울대학교의과대학검사의학교실 2 강지상 1 주세익 1 김의종 1,2 A Case of Cysteine-Requiring Escherichia coli Isolated from Urine Specimen Ji-Sang Kang 1, Sae-Ick Joo 1, and Eui-Chong Kim 1,2 Department of Laboratory Medicine, Seoul National University Hospital, Seoul 110-744, Korea 1 Department of Laboratory Medicine, Seoul National University, College of Medicine, Seoul 110-744, Korea 2 A case of recurrent urinary tract infection by cysteine-requiring Escherichia coli in a 5-years-old child with congenital vesicoureteral reflux is described. This bacterium was not grown on MacConkey agar plate for overnight culture, and after 48hrs, tiny colonies were observed. These colonies were not identified by VITEK2 and Walkaway 96i without cysteine supplementation. The isolate was susceptible for cefotetan, ciprofloxacin and imipenem, and resistant for piperacillin/tazobactam, cephalothin, cefotaxime, ceftazidime, amikacin, gentamicin, and tobramycin. Received 4 May 2009/Returned for modification 3 June 2009/Accepted 25 June 2009 Key words : Cysteine-requiring Escherichia coli, Recurrent urinary tract infection I. 서론 균이성장하는데 cysteine 이요구되는 Escherichia coli 가 1952년 Gillespie에의해처음보고된이후장내세균군의일부종에서는여러가지영양소에의존적으로성장하는영양요구성혹은영양의존성세균이임상검체로부터드물지않게분리되고있으며 (Mclver와 Tapsall, 1990), 지속성요로이상을가진노인환자에서는 cysteine 요구성 E. coli가, 장기간 trimethoprim/sulfamethoxazole을투여받은환자의소변에서는 thymine 요구성 E. coli가보다빈번하게분리된다고하였다 (Taspall 등, 1974). 요로 교신저자 : 강지상, ( 우 )110-744, 서울시종로구대학로 101 번지, 서울대학교병원진단검사의학과 TEL : 02-2072-2795, 017-751-4336 E-Mail : integra800@naver.com 감염의 E. coli와 Klebsiella spp. 중 1.5% 가 cysteine 요구성이라는보고도있다 (Tapsall와 Mclver, 1986; Mclver와 Tapsall, 1990). 드물기는하지만이들영양요구성 E. coli 에의한패혈증이보고되기도하였다 (Tapsall와 McIver, 1986; Yuen 등, 1990). 이들은소위 미세집락 (dwarf colony, 직경 0.5 mm 이하 ) 을형성하거나잘성장하지않는다 (Mclver와 Tapsall, 1990). 이들은 cysteine 합성과정에서황산염동화작용이결핍되거나, 아미노산의최종산화산물인 cystine이결핍됨으로써, 환경으로부터직접 cysteine을흡수하지않고는단백질합성을하지못하는돌연변이종으로알려져있다 (Mclver와 Tapsall, 1987; Mclver와 Tapsall, 1993). 국내에서도여러검사실에서미세집락 E. coli에대한경험이있을것으로생각되지만, 이러한영양요구성장내세균에대한문헌보고는없었다. 저자들은소변검체로부 47
대한임상검사학회지 41(2):47-51, 2009 터 cysteine 요구성 E. coli를경험하였기에균의분리, 동정및항생제감수성시험과정에대하여보고한다. II. 증례 1. 대상환자환자는만 5세여아로태어날때부터선천성방광요로역류증을갖고태어나소아비뇨기과로내원하였으며, 18 개월부터지금까지비뇨기과수술적교정치료를수차례진행하였음에도불구하고재발성요관감염으로판단되었다. 2. 검사소견요검사에서백혈구수가 100/HPF 이상, 세균이 2+ 이었고, 말초혈액검사는백혈구수는 6.9 10⁹/L이었으며, 혈색소와적혈구용적은 9.8 g/dl와 29.8%, 혈소판은 344 10 ⁹/L이었다. 혈중전해질은 sodium이 139 mmol/l, potassium 이 4.4 mmol/l, chloride 107 mmol/l, TCO₂24 mmol/l이었다. Ca과 P는 10.0 mg/dl과 4.5 mg/dl이었으며, BUN 과 creatinine은 9 mg/dl과 0.4 mg/dl이었다. 3. 임상경과 26개월째외측방광절단및요관방광문합술을실시한후입원중엔 ceftazole 및 amikacin을투여했으며퇴원시엔 cefixime과 trimethoprim/sulfamethoxazole을집에서복용하였다 32개월째요관류봉합술, 39개월째요관방광문합술과요관개복술후에도요관감염은계속진행되었으며, 40개월째소변배양에서균이자라지않아 ceftazole 및 amikacin은중지하고 cefixime만지속적으로투여하고있으며, 외래방문시수술부위, 소변량핍뇨, 단 백뇨여부및소변배양검사를하고있었다. 4. 세균의분리및동정소변검체 10μL를표준백금이로접종하고 5% CO 2, 35 상태에서 24시간배양하였다. 5% 면양혈액한천배지 (5% sheep blood agar plate, BAP) 에서는미세집락으로자랐으나, MacConkey 배지에서는성장하지않았으며, 48시간배양후에는 MacConkey 배지에서도무색의미세집락이관찰되었다 (Fig. 1). Mclver와 Tapsall(1990) 의방법에따라, 직경 6 mm의디스크흡습지 (BD Company, USA) 에 6.3 mm L-cysteine HCl을 10 μl 첨가후상기균을도말한 MacConkey 배지에붙인후 5% CO 2, 35 상태에서 24시간배양하였더니 cysteine 디스크주변에서왕성한분홍색균집락이자란것을볼수있었다 (Fig. 2). 세균의동정은 MicroScan WalkAway 96SI(Dade Behring Inc, USA) 과 VITEK2(BioMerieux Inc, Duham, USA) 자동화장비, 그리고 API 20E(BioMerieux Inc, Duham, USA) 를사용하였다. Inoculum water(dade Behring Inc, USA) 와멸균 half saline, 그리고멸균증류수에각각 L-cysteine HCl 을최종 6.3 mm이되도록첨가한후 cysteine 디스크주변에서자란균집락을이용하여각키트의사용법대로균액을맞추어사용하였다. MicroScan WalkAway 96SI에는 Neg Combo Type 44를, VITEK2에는 GN 카드를사용하였다. 3 가지동정결과는 Table 1과같다. Triple sugar iron 사면배지에접종한결과는배지심부는산성, 사면이알칼리로변화되었으며, 요소분해효소시험과, oxidase 시험은음성이었다 (Fig. 3). 확진동정을위하여 16S rdna 부위의염기서열분석을실시하였더니 E. coli와 100% 일치하였다. Table 1. Identification results of the "dwarf colonis" by WalkAway96SI, VITEK2, and API afyer adding L-cysteine in inoculum media Methods Kit, used Inoculum media Results WalkAway 96SI NC44 Inoculum Water with L-cysteine 94.37% Escherichia coli VITEK2 GN 0.45% saline with L-cysteine 99.0% Pseudomonas oryzihabitans API 20E 20E Distilled water with L-cysteine 57.7% Yersinia kristensenii 34.0% Escherichia coli 48
Korean J. Clin. Lab. Sci. 41(2):47-51, 2009 Fig. 1. Dwarf colonies of on blood agar plate and MacConkey agar after 48 hours incubation from primary culture of this case specimens. Fig. 2. Pink colonies on MaConkey agar impregnated with L-cysteine hydrochloride (6.3 mm) after 24 hours culture in 5% CO 2, 35. Any colonies were not presented on regions so far from the cysteine disk. Fig. 3. Growth of API 20E, TSI and urease test after 24 hours of incubation at 35-37 5. 항생제감수성검사 Mclver와 Tapsall(1990) 의방법에따라 Muller-Hinton broth에 L-cysteine HCl을 6.3 mm이되도록첨가한후 cysteine 디스크주변에서자란균집락을이용하여 0.5 McFaland 탁도를맞추어디스크확산법을이용하여항생제감 수성검사를실시하였다. Piperacillin/tazobactam, cephalothin, cefotaxime, ceftazidime, amikacin, gentamicin, tobramycin에는내성이었으며, ciprofloxacin, imipenem, cefotetan에는감수성이었다. ESBL 시험에서는음성이었다. 49
대한임상검사학회지 41(2):47-51, 2009 III. 고찰 최상의성장을위해특별한영양성분을요구하는세균은임상적검체에서드물지않게분리된다. 영양요구성장내세균은필요한영양성분이부족한배지에서는전형적으로작고반투명한집락을형성하고 small-colony forms 또는 deficient dwarf colony" 라고불린다. 보고된대부분의영양부족은황의대사과정의결손으로인해일어나고 cysteine 요구성균주라고명명되었다 (Mclver 와 Tapsall, 1990). 장내세균과중에 small colony forms 이증가하는많은대사결손이보고되었다. 이들결손의일반적인성격은 cysteine에포화된디스크흡습지를이용한간단한영양요구성시험에의해측정될수있다. 임상실험실에서 cysteine 요구성 small colony forms E. coli는 cysteine이포함된세균학적배지를사용하면잘분리된다고하였다 (Mclver와 Tapsall, 1990). 그러나 Synyal(1987) 은일상적인소변배양에서 cysteine supplemented media의사용필요성에대한평가를보고하였는데, 특별한환자군이아니라면특별한장점이없다고평가하였다. Mclver와 Tapsall(1990) 은 cysteine 요구성 E. coli가 trimethoprim/sulfamethoxazole을오랜기간동안치료하였거나요관에이상을가진나이든환자에게빈번하게나타난다고보고하였는데, 국내에서이런조건에있는환자군이빈번하다면 cysteine이보강된배지의일반적인사용이권장된다. 영양요구성장내세균의분리는요로감염에서주로발견된다고보고되었으나 McIver와 Tapsall(1986), Yuen 등 (1990) 은 cysteine 요구성 E. coli에의한패혈증증례를보고하기도하였다. 특히혈액배양에서이러한영양요구성균주의분리는종종실패하기도하기때문에주의가필요하다고판단된다. 국내의영양요구성세균의분리는드물게보고되고있으며, Shin 등 (2008) 이 nutritionally deficient streptococci 인 Granulicatella adiacens 패혈증을분리보고하였으며일반적인배양배지에서분리하기어렵기때문에혈액배양에서 S. aureus 획선을추가적으로실시하는것을제안하기도하였다. 본증례에서는소변배양배지로부터균성장이되지 않았으나검체의그람염색슬라이드에서분명한그람음성간균의염색상을관찰하여, chocolate agar, Brucella blood agar를추가접종배양하였다. 모든배지에서비슷한정도의느리거나관찰하기어려운균집락의성장을보여영양요구성시험을실시하게되었다. 소변배양은 16~18시간배양한배지로부터집락판독을거쳐균의분리유무를결정하는것이일반적이기때문에본증례와같이검체의그람염색에서균이관찰되지않았다면분리하기어려웠을것으로판단된다. 자동미생물분석기들을이용한 cysteine 요구성장내세균의동정은균성장이안되거나매우느린이유로동정이되지않거나잘못된결과를도출하게된다. MicroScan WalkAway 96SI으로 cysteine 첨가없이는, 세균동정이나항생제감수성검사가반응을일으키지않았으며, VITEK2도충분치못한균성장을보고하였다. Mclver와 Tapsall(1990) 의보고에서도 VITEC, API, Microbact 등의키트에서일부 cysteine 요구성 E. coli와 Klebsiella spp. 에서잘못동정되거나동정이되지않은경우가약 25% 정도였다. Cysteine 요구성 E. coli의항생제감수성에대한기존의연구는영양요구성특성이항생제감수성특성에영향을미치는것은아닌것으로보고하였다 (Tapsall와 Mclver, 1986; Mclver와 Tapsall, 1991). 이들연구의총 47균종에서 aminoglycosides 항생제에감수성을보인반면에본증례의균종은내성을보인것이특징이었다. 이결과는국내에서분리되는 cysteine 요구성 E. coli의항생제특성조사에대한필요성을제시한다. 결론적으로그람염색에서확실한세균의염색상이관찰되나여러가지배지및배양환경에서집락형성이더디거나자라지않는경우에는영양요구성세균의여부를확인해보아야할것으로사료된다. 결핍된영양소는실제적으로다양할수있으나황대사과정의결핍이대부분이라알려져있음으로 cysteine 디스크의위성현상으로선별할수있을것으로판단된다. 참고문헌 1. Gillespie WA. Biochemical mutants of coliform bacilli in infections of the urinary tract. J Pathol 50
Korean J. Clin. Lab. Sci. 41(2):47-51, 2009 Bacteriol 64(3):551-557, 1952. 2. Mciver CJ, Tapsall JW. Cysteine requirements of naturally occurring cysteine auxotrophs of Escherichia coli. J Pathol 4:361-363, 1987. 3. McIver CJ, Tapsall JW. Assessment of conventional and commercial methods for identification of clinical isolates of cysteine-requiring strains of Escherichia coli and Klebsiella species. J Clin Microbiol 28(9):1947-1951, 1990. 4. McIver CJ, Tapsall JW. In vitro susceptibilities of clinical isolates of cysteine-requiring Escherichia coli to 12 antimicrobial agents. Antimicrob Agents Chemother 35(5):995-997, 1991. 5. Mciver CJ, Tapsall JW. Further studies of clinical isolates of cysteine-requring strains of Escherichia coli and Klebsiella and possible mechanisms for their selection in vivo. J Microbiol 5:382-387, 1993. 6. Shin KS, Son BR, Jeong HW. A Case of Granulicatella adiacens septicemia identified by 16S rrna sequencing analysis. Korean J Clin Microbiol 11(1); 63-65, 2008. 7. Synyal D. Incidence of cysteine dependent Escherichia coli in a general practice population. J Clin Pathol 40:930, 1987. 8. Tapsall JW, McIver CJ. Septicaemia caused by cysteine-requiring isolates of Escherichia coli. J Med Microbiol 22(4):379-382, 1986. 9. Tapsall JW, Wilson E, Harper J. Thymine dependent strains of Escherichia coli selected by trimethoprim-sulphamethoxazole therapy. Pathology 6(2):161-167, 1974. 10. Yuen KY, Seto WH, Tsui KH, Hui WT. Septicemia caused by cysteine-dependent Escherichia coli. J Clin Microbiol 28(5):1047-1048, 1990. 51