J Koren So Food Si Nutr 한국식품영양과학회지 44(9), 27~278(25) http://dx.doi.org/.3746/jkfn.25.44.9.27 HT-29 인체대장암세포에서검정콩된장의 in vitro 항암효과 박의성 이재양 2 박건영 부산대학교식품영양학과 2 ( 주 ) 인산가 Antiner Effets of Blk Soyen Doenjng in HT-29 Humn Colon Cner Cells Eui Seong Prk, Je-Yng Lee 2, nd Kun-Young Prk Deprtment of Food Siene nd Nutrition, Pusn Ntionl University 2 Insn In. ABSTRACT In vitro ntiner effets of lk soyen doenjng on HT-29 humn olon ner ells were studied. SD (soyen doenjng prepred with nine-time ked moo slt) nd BD (lk soyen doenjng prepred with nine-time ked moo slt) were ompred with CD (ommeril doenjng). There were no signifint differenes etween experimentl groups in terms of ph, mino-type nitrogen, nd mmoni-type nitrogen levels of the doenjng smples. BD showed the highest ntioxidtive effet, followed y SD nd CD in tht order. BD lso showed the highest totl polyphenol onentrtion of ll smples. CD, SD, nd BD extrts showed no toxi effets on norml RAW 264.7 ells t onentrtion rnging from. to.5 mg/ml. BD exhiited ntiner effet on HT-29 ells y MTT ssy. Also, BD mnipulted mrna expressions in ertin ftors; it suppressed pro-inflmmtory ytokines suh s TNF-α, IL-6, nd COX-2, promoted ell-yle-relted genes of p2, nd p53, suppressed expression of ylin D, nd suppressed nti-poptoti Bl-2; suh mnipultion y BD ws the strongest, followed y SD nd CD in order. From the results ove, BD exhiited the highest ntiner effets y inhiiting growth of HT-29 ells, proly y regulting pro-inflmmtory ytokines, ell yling relted genes, et. These results might e due to using lk soyens ontining high levels of polyphenol, inluding nthoynins. Key words: lk soyen, doenjng, HT-29 olon ner ells, ntiner 서 된장은우리나라의대표적인전통발효식품으로된장국은한국인이가장선호하는음식중하나로자주섭취하는음식이다. 된장은콩을주원료로한우수한단백질의공급식품이고, 저장성이뛰어난조미식품이다. 또한된장은발효, 숙성과정중생성되는각종펩타이드, 아미노산, 유리당등에의해구수한맛과향을가진것이특징이며 (), 페놀화합물과 melnoidin 종류의항산화물질을가지는것으로알려져있다 (2). 된장의발효는콩의유용한성분을인체에흡수가잘되는물질로변화시켜 (3), 항염증 (4), 항산화 (5), 항암기능 (6) 등을가지는것으로알려져있다. 콩의여러가지이로운성분중하나는 isoflvone이며, 콩의 isoflvone은 gluoside 형태인 genistin, didzin, glyitin 등으로형성되어있다. 하지만된장에서콩의발효가진행됨에따라이들은 Reeived 8 June 25; Aepted 2 August 25 Corresponding uthor: Kun-Young Prk, Deprtment of Food Siene nd Nutrition, Pusn Ntionl University, Busn 4624, Kore E-mil: kunyprk@pusn..kr, Phone: +82-5-5-2839 론 glyon 형태인 genistein, didzein, glyitein으로전환된다 (7). 이러한 glyon된형태의 genistein, didzein은항염증 (8), 항산화 (9), 항암효과 () 를가진것으로알려져있으며된장이발효되면서이러한성분이많이생성된다 (7). 우리나라에서흔히먹는검정콩중흑태는검은콩가운데서도크기가크고콩밥이나콩자반등에사용되며서리태는껍질이검은색이지만속이파랗다고하여속청이라고불린다. 서목태는다른검은콩보다크기가작아마치쥐눈처럼보인다고하여쥐눈이콩이라고부른다 (). 콩에함유된주요성분들은단백질이 4%, 지질이 2%, 탄수화물이 35%, 기타성분이 5% 정도로구성되어있다. 이들성분은단백질, 지질, 탄수화물, 비타민, 무기물등과같은영양성분과생리활성을나타내는식물성물질인비영양성분으로나눌수있는데, 검정콩의성분을살펴보면일반노란콩과영양성분면에서큰차이가없고단지종피색이다른것으로알려져있다 (2). 검정콩은일반콩과비교하여노화방지성분이 4 배나많으며 (3), 다이어트에효과가있다고알려져있다 (4). 검정콩이일반적인노란콩과다른점중하나는종피에 nthoynin이함유되어있는것인데, nthoynin은
HT-29 인체대장암세포에서검정콩된장의 in vitro 항암효과 27 수용성플라보노이드색소로항산화효과등의생리활성이높은것으로알려져있으며 (5), 검정콩종피에는노란콩보다많은 nthoynin을함유하고있어높은항산화 (6) 및항암 (7) 작용을하는것으로알려져있다. 본실험은검정콩된장과노란콩된장, 일반된장을이용하여 ph, 암모니아태질소및아미노태질소함량및항산화효과, RAW 264.7 ells에서된장추출물의독성확인, HT- 29 인체대장암세포를이용하여암세포성장억제효과, RT-PCR을이용해대장암의 inflmmtion 관련유전인자 TNF-α, IL-6, inos, COX-2와대장암세포의 ell yle에영향을주는유전인자인 p2, p53, ylin D과 poptosis 와관련된유전인자 Bl-2의발현정도도살펴보았다. 재료및방법실험재료본연구에서는 ( 주 ) 인산가 (Hmyng, Kore) 에서메주를이용하여전통식으로제조후 년을발효하고 9회죽염이첨가된노란콩 ( 대원콩 ) 된장 (soyen doenjng, SD) 과검정콩 ( 서리태 ) 된장 (lk soyen doenjng, BD) 을사용하였다. 각각의된장은콩을세척하고불린후가마솥에서장작불로삶고나서분쇄하여일정한크기의육면체모양 (3 kg, 5 2 m) 의메주를제조한후볏짚을깔아둔선반에진열하여메주를띄웠다 (4 C). 메주성형후 6일이지난뒤햇빛에말리고물로깨끗이세척한후 9회죽염 (Insng, Hmyng, Kore) 을첨가한 2% 의소금물에 :2( 메주 : 소금물 ) 의비율로항아리에담았다. 4개월후간장과된장을분리하고분리된된장은따로항아리에담아 년간발효시켰다. 메주를이용하여전통식으로제조후 년을발효하고정제염이첨가된일반 ( 노란콩 ) 된장 (ommeril doenjng, CD) 은농협마트 (Hmyng, Kore) 에서구입하였다. 이화학적실험에사용된된장은동결건조하여실험에이용하였는데시료를 -8 C, vuum guge (Snwon Freezing Engineering Co., Busn, Kore) 의조건에서일주일간동결건조한다음파쇄하여가루로만든후실험에사용하였다. 여 AM-55-Kit(Asn Prmeutils, Hwseong, Kore) 에의한 Indophenol법으로측정하였다 (9). 총폴리페놀측정각각된장의총폴리페놀함량은 Dewnto 등 (2) 의방법에따라 Folin-Ciolteu regent가시료의폴리페놀성화합물에의해환원된결과몰리브덴청색으로발색하는것을원리로측정하였다. 동결건조된각각의된장을. mg/ml 농도로희석한시료 2 ml에 2% N 2CO 3 용액 2 ml를첨가한후 2분간실온에방치하였다. 그리고 5% Folin-Ciolteu regent(sigm-aldrih Co., St. Louis, MO, USA) 2 ml를가한후 3분동안실온 (2~25 C) 에서방치하여반응을시켰다. 반응후 UV-VIS spetrophotometer(jso, Tokyo, Jpn) 를이용하여 75 nm에서흡광도값을측정하였으며, 표준물질로 glli id를사용하여표준곡선을작성하였다. 총폴리페놀함량은시료 L당 mg glli id equivlent(gae) 로나타내었다. 된장추출물의제조 Prtt과 Bir(2) 의실험을변형하여추출물을제조하였다. 된장을동결건조시킨후건조된된장시료를파쇄하여가루로만든뒤시료에 2배 (w/v) 의메탄올을혼합하여 24시간교반을한번실행한뒤여과하고, 배 (w/v) 의메탄올을혼합하여 24시간교반을한번더실행한뒤여과하여추출액을얻었다. 추출액을회전식진공농축기 (EYELA, Tokyo Rikkiki Co., Tokyo, Jpn) 로농축해추출물을얻었으며, 이들을 dimethylsulfoxide(dmso, Knto Chemil Co., Tokyo, Jpn) 에용해하여적당한농도로희석한후각실험에사용하였다. DPPH rdil 소거효과측정메탄올로용해희석한 5 μm DPPH(,-diphenyl-2- pirylhydrzyl) 용액 μl를농도별로준비된시료 μl에가하여 96-well plte에혼합해 3분간실온에서반응시킨뒤, UV-VIS spetrophotometer(jso) 로 537 nm 에서흡광도를측정하였다. 메탄올 μl를대조군으로하여흡광도차이를백분율 (%) 로나타내었다 (22). ph, 아미노태질소및암모니아태질소함량측정 ph는 SevenEsy ph meter(863, Mettler-Toledo AG, Shwerzenh, Switzerlnd) 를이용하여측정하였으며, 증류수로 배희석한된장시료를사용해실온에서측정하였다. 아미노태질소함량측정을위해 배희석한된장시료 5 ml에중성 formlin 용액 5 ml를가한후,. N NOH를이용하여 ph 8.4가될때까지적정하였다. 이때소비된. N NOH 용액의 ml 수를 formol법으로계산하여아미노태질소함량을나타내었다 (8). 암모니아태질소함량은 배희석한된장시료를이용하 RAW 264.7 대식세포 ( 정상세포 ) 를이용한 in vitro 된장메탄올추출물의독성측정한국세포주은행 (Seoul, Kore) 에서 RAW 264.7 세포를분양받아실험에사용하였다. 세포배양을위해 DMEM medium(gibco, Grnd Islnd, NY, USA) 에 unit/ml 의 peniillin-streptomyin, % 의 fetl ovine serum (FBS) 이함유된배지를사용하여 37 C, 5% CO 2 inutor (Model 354, Form Sientifi In., Mriett, OH, USA) 에서배양하였다. 배지는 24시간마다교환해주면서일주일마다계대배양을실시하며실험에사용하였다. 세포배양을
272 박의성 이재양 박건영 위해 96 well plte에 well당 2. 4 ells/ml로분주하고, 24시간후배지를버리고 smple을일정농도로희석하여 48시간동안 37 C, 5% CO 2 inutor에서배양하였다. 48시간후배지로 3-(4,5-dimethylthizol-2-yl)-2,5- diphenyltetrzolium romide(mtt) 용액을 5 mg/ml의농도로희석한후 well당 μl를첨가하여동일한조건에서 4시간동안더 inutor에배양한다음, DMSO에생성된 formzn을녹여서 ELISA reder(model 68, Bio- Rd, Tokyo, Jpn) 로 54 nm에서흡광도를측정하였다 (23). HT-29 인체대장암세포에서의 in vitro 항암효과측정 MTT ssy: 한국세포주은행에서 HT-29 인체대장암세포를분양받아실험에사용하였다. 암세포배양을위해 RPMI 64 medium(gibco) 에 unit/ml의 peniillinstreptomyin, % 의 FBS가함유된배지를사용하여 37 C, 5% CO 2 inutor(model 354, Form Sientifi In.) 에서배양하였다. 배양한세포는 96 well plte에 well당 2. 4 ells/ ml로분주하였다. 24시간후배지를제거한후 smple을일정농도로희석후에 48시간동안 37 C, 5% CO 2 inutor에서배양하였다. 배양이끝나면배지로 5 mg/ml 의 MTT 용액을기존의배지는제거한후 well당 μl를첨가한다. 샘플은세포를배양했던조건에서 4시간동안 inutor에서배양한다음, DMSO를 μl 첨가하였다. MTT로 ell에형성된 formzn을 DMSO로녹여보라색을띠게한뒤 ELISA reder(model 68, Bio-Rd) 로 54 nm 에서흡광도를측정하였다 (23). RT-PCR을이용한 TNF-α, IL-6, inos, COX-2, p2, p53, ylin D, Bl-2 의 mrna 발현분석 : HT-29 인체대장암세포를위와동일한방법으로배양하여 6 well plte 에 well당.5 6 ells/ml로분주하고된장추출물을배지에일정농도를희석하여암세포에처리한후상층액을모아원심분리기 (,2 rpm, 3 min, 4 C) 로세포와배지를분리하였다. 6 well plte에부착된세포는 Trizol regent (Invitrogen Co., Crlsd, CA, USA) 를이용하여제조사의방법에따라분리하였다. 분리된 RNA를정량한후 Oligo dt primer(invitrogen Co.) 와 AMV reverse trnsriptse를이용하여 2 μg의 RNA를 reverse trnsription( 역전사 ) 하여 ssdna로만들었다. 만들어진 DNA를주형으로이용하여 TNF-α, IL-6, inos, COX-2, p2, p53, ylin D, Bl-2 유전자를 polymerse hin retion (PCR) 방법으로특정유전자부위를증폭하였다. Internl ontrol은 housekeeping 유전자인 GAPDH(glyerl dehyde-3-phosphte dehydrogense) 를이용하여이들의발현정도를비교하였고, 각유전자의 primer sequene는 Tle 에표기하였다. PCR은 utomti Bioneer thermoyler(bioneer, Dejeon, Kore) 로증폭시키고, 증폭된 DNA 산물들을 2% grose gel을이용하여전기영동하고 ethidium romide(etbr, Sigm-Aldrih Co.) 를이용하여염색한후 UV 하에서확인하였다. 통계처리대조군과각시료로부터얻은실험결과들의유의성을검정하기위하여분산분석 (ANOVA) 을행한후 P<.5 수준에서 Dunn's multiple rnge test를실시하였으며, 그결과는평균 (men)± 표준편차 (stndrd devition, SD) 로표시하였다. 모든통계분석은 SPSS(v8., SPSS In., Chigo, IL, USA) 통계프로그램을이용하여처리하였다. P값이 5% 미만일때유의성이있다고판정하였다. Tle. Primer sequenes of inflmmtion, ell yle nd poptosis relted genes used for RT-PCR in HT-29 ells Gene nme Sequene TNF-α IL-6 COX-2 p2 p53 Cylin D Bl-2 GAPDH 5'-CGGAGTCCGTCCGGGCAGGT-3' 5'-GCTGGGTAGAGAATGGATGAACA-3' 5'-CTGCAAGAGACTTCCATCCAGTT-3' 5'-AGGGAAGGCCGGTGGTTGT-3' 5'-GAATCATTCACCAGGCAAATTG-3' 5'-TCTGTACTGCGGGTGGAACA-3' 5'-CTCAGAGGAGGCGCCATG-3' 5'-GGGCGGATTAGGGCTTCC-3' 5'-GCTCTGACTGTACCACCATCC-3' 5'-CTCTCGGAACATCTCGAAGCG-3' 5'-GAGGAGCAGCTCGCCAA-3' 5'-CTGTCAAGGTCCGGCCAGCG-3' 5'-CAGCTGCACCTGACG-3' 5'-GCTGGGTAGGTGCAT-3' 5'-TGACGCTGGACCAATCAG-3' 5'-ACCTCATTGGACTGCATAGC-3'
HT-29 인체대장암세포에서검정콩된장의 in vitro 항암효과 273 Tle 2. ph, mino-type nitrogen, nd mmonium nitrogen ontents in doenjng smples CD ) SD BD ph Amino type nitrogen (mg%) Ammonium nitrogen (mg%) 5.6±. 754.±.3.4±. 5.2±. 833.5±8.6 6.5±. 5.6±.,22.±2.8 6.4±.2 ) CD: ommeril doenjng, SD: soyen doenjng, BD: lk soyen doenjng. Mens with the different letters (-) in the sme row re signifintly different (P<.5) y Dunn's multiple rnge test. 결과및고찰 3 Totl polyphenol 된장의발효특성 ph, 아미노태및암모니아태질소함량 : Tle 2에서보는바와같이 ph는 CD군과 BD군이 5.6±.이었고, SD군은 5.2±.을나타내었다. 보통 ph는발효기간이오래될수록낮아지는데발효기간이많이차이가나지않아 CD군과 BD군간의차이는보이지않았다. 하지만같은발효기간임에도 SD군은 5.2를나타내었는데, 이는일반적인된장의 ph에벗어나지않는범위로적절한품질상태를보인다고할수있다 (4). 아미노태질소함량의경우 CD군이 754.±.3 mg%, SD군이 833.5±8.6 mg%, BD군이,22±2.8 mg/% 로나타났다. Kim 등 (24) 의연구에의하면아미노태질소함량은한달동안숙성했을시 463 mg% 를나타내었다고한다. 식품공전상된장의아미노태질소함량의규격은 6 mg% 이상이므로모든시료는적절한품질을가지고있는된장으로볼수있다. 암모니아태질소함량의경우 CD군은.4±. mg%, SD 군은 6.5±. mg%, BD군은 6.4±.2 mg% 로나타났다. Kim 등 (25) 의연구에따르면 4가지의시판된장을조사했을때암모니아태질소함량은.~29.25 mg% 로나타났다. 그리고식품공전상된장의암모니아태함량은 4 mg% 이하인것을고려할때모든시료는적절한품질을가지고있다고생각된다. 총폴리페놀측정된장의총폴리페놀함량측정결과는 Fig. 과같다. CD 군이 9.7±.6 mg/l, SD군이 8.4±.8 mg/l, BD군이 26.6±.4 mg/l를나타내었다. BD군이 CD군과 SD군보다높은폴리페놀함량을나타내었는데, 이는검정콩종피의총페놀화합물양이노란콩종피의총페놀화합물양보다많아이러한결과가나온것으로생각된다 (6). 또한이러한총페놀화합물의양으로인해각된장마다다른항산화및항암활성을보일것으로생각된다. 콩발효식품에는 glli id, prototehin, tehin 등의페놀화합물이있는것으로알려져있고 (26), 검정콩종피에는 nthoynin, glli id, prototehin, tehin 등의함량이노란콩에비해많은것으로알려져있다 (5,6). Totl polyphenol (mg/l). 25 2 5 5 CD SD BD Fig.. Totl polyphenol ontents in doenjng smples. CD, ommeril doenjng; SD, soyen doenjng; BD, lk soyen doenjng. Mens with the different letters (-) ove the rs re signifintly different (P<.5) y Dunn's multiple rnge test. DPPH 소거효과측정된장의 DPPH 소거효과의결과는 Fig. 2에나타난바와같다. 농도가증가함에따라 DPPH 소거활성은증가하였으며, 모든시료군에서항산화활성을보였고그중 BD군이모든농도에서가장높은항산화활성을보였다 (.5 mg/ ml: 2.2±%, mg/ml: 26.4±.4%,.5 mg/ml: 3.9 ±.%, 2 mg/ml: 48.4±.8%)..5 mg/ml 농도에서검정콩된장은 CD나 SD보다항산화효과를가지는것으로나타났다 (P<.5). 하지만노란콩된장인 CD와 SD는비슷한결과를나타내었다. 된장을메탄올로추출하였을때대두속의항산화물질인 Svenging tivity (%). 6 5 4 3 2 DPPH.5.5 2 Conentrtion (mg/ml) CD SD BD Fig. 2. DPPH svenging tivities of doenjng extrted smples. CD, ommeril doenjng; SD, soyen doenjng; BD, lk soyen doenjng. Mens with the different letters (-) ove the rs re signifintly different (P<.5) in the sme onentrtion y Dunn's multiple rnge test.
274 박의성 이재양 박건영 토코페롤, 페놀산, 아이소플라본및대두및곡류등의분해에의하여생성된아미노산, 펩타이드성분들, 그리고용출된총페놀화합물과 melnoidin 종류의항산화물질이나오는것으로알려져있으며 (2), 그추출물은항산화성을가진다는보고가있다 (2). 따라서된장추출물이 DPPH 소거효과를냈다고볼수있으며, 앞서실험한폴리페놀의함량을볼때 BD군이높은폴리페놀함량을보였고따라서 BD군이가장높은 DPPH 소거활성을보인것으로생각된다. 정상세포 (RAW 264.7 ell) 를이용한된장메탄올추출물의 in vitro 독성측정된장추출물의농도별독성을측정한결과는 Fig. 3과같다. RAW 264.7 ells는식품추출물의독성여부를확인할때자주이용되는세포이다 (27). 된장추출물의.~.5 mg/ml의농도까지는 RAW 264.7 ells의증식이억제되지않았다. 하지만 mg/ml의농도에서는 CD군이 8±3.2%, SD군은 7.4±.4%, BD군은 7.3±.5% 의 ells만살아남았다. 따라서.~.5 mg/ml의농도까지는정상세포에특별한영향을미치지않는것으로확인되었다. HT-29 인체대장암세포에서 in vitro 항암효과측정 MTT ssy: 된장추출물의농도별암세포성장억제에 A Surviving rte (%). B Inhiition rte (%). 4 2 8 6 4 2 8 6 4 2-2 -4 NS NS NS..25.5 CD SD BD Conentrtion (mg/ml) CD SD BD..25.5 Conentrtion (mg/ml) Fig. 3. Anti-prolifertive tivities of doenjng extrted smples on norml RAW 264.7 (A) nd HT-29 humn ner ells (B). CD, ommeril doenjng; SD, soyen doenjng; BD, lk soyen doenjng. Mens with the different letters (,) ove the rs re signifintly different (P<.5) in the sme onentrtion y Dunn's multiple rnge test. NS: not signifint. 대한결과는 Fig. 3과같다. CD군의. mg/ml 농도를제외하고모든시료와농도에서대장암세포의성장을억제하였다. BD군이. mg/ml 농도에서 38.8±4.7%,.25 mg/ ml 농도에서 43.7±9.2%,.5 mg/ml 농도에서 65.5±2.4 %, mg/ml 농도에서 78.3±.9% 의억제율로시료중가장높은성장억제효과를보였다. SD군은. mg/ml 농도에서 32.±4.5%,.25 mg/ml 농도에서 38.4±8.6%,.5 mg/ml 농도에서 6.4±.%, mg/ml 농도에서 77.3±.9% 의억제율로 BD군보다조금낮은성장억제효과를보였으나통계적인유의성은나타나지않았다. CD군은. mg/ml 농도에서 -3.8±7.7%,.25 mg/ ml 농도에서 3.3±.8%,.5 mg/ml 농도에서 37.9± 5.7%, mg/ml 농도에서 38.7±5.3% 로가장낮은성장억제효과를보였다 (P<.5)..5 mg/ml의농도에서비교할때 BD와 SD는효과가크지만비슷한결과값을보였고, CD 는통계적으로낮은수치를보였다 (P<.5). SD군의경우 CD군에비해총폴리페놀의함량은적었고 DPPH 소거효과에서는비슷한수치를나타내었으나 MTT ssy에서 CD군에비해높은항암효과를나타내었는데, 이는죽염을사용하여된장을담았기때문으로생각된다 (5). CD군의경우정제염을이용하여된장을담았는데 Yoon (28) 의연구에서는된장제조시사용한소금의종류에따라암세포성장억제효과를관찰했을때죽염을첨가한된장에서가장높은암세포성장억제효과를관찰하였다. 따라서이러한결과가나온것으로생각된다. BD군의경우 SD군에비해다소높은항암효과를나타내었는데, 이는검정콩에함유된안토시아닌과총페놀화합물의양에의해높은암세포성장억제효과를낸것으로생각된다 (4). RT-PCR 을이용한 TNF-α, IL-6, COX-2 의 mrna 발현분석 : TNF-α, IL-6와 COX-2의 mrna 발현을측정하였다 (Fig. 4). BD군은 Con군과 CD, SD군에비해 TNFα, IL-6와 COX-2의 mrna 발현이유의적으로감소하였다 (P<.5). 대장암세포에죽염으로만든된장을처리하였을때다른소금으로만든된장에비해대장암세포의 TNF-α, IL-6와 COX-2의발현이억제된것을볼수있다 (5). 이러한차이는죽염의미네랄중 K, Mn, Fe, P의함량이정제염과천일염에비해많아이러한 ytokines 유전자의발현에영향을준것으로생각된다 (29). 또한안토시아닌은 inflmmtory pthwy를조절하는것으로알려져있다 (3). 그러므로 TNF-α, IL-6의발현의감소는 BD군이 Con군이나 CD, SD군에비해염증성사이토카인의유전자발현단계를조절하여이들사이토카인의생성을억제할수있음을의미한다. 대장암발현에서 COX-2는매우중요한부분을담당하고있는유전자로, COX-2를억제시키는물질을 rt에게투입하면 zoxymethne 으로유도된 rt의이상함몰점 (errnt rypt foi ACF) 과폴립의형성에영향을주는것으로알려
HT-29 인체대장암세포에서검정콩된장의 in vitro 항암효과 275 mrna expression (fold rtio)..8.6.4.2 TNF-α d mrna expression (fold rtio)..8.6.4.2 IL-6 d Con CD MD SD mrna expression (fold rtio)..8.6.4.2 COX-2 Fig. 4. mrna expression levels of doenjng extrted smples on TNF-α, IL-6, nd COX-2 in HT-29 ner ells (.5 mg/ml) y the tretment of different kinds of doenjngs. CD, ommeril doenjng; SD, soyen doenjng; BD, lk soyen doenjng. Fold rtio: Gene expression/ GAPDH ontrol numeril vlue (Control fold rtio=). Mens with the different letters (-d) ove the rs re signifintly different (P<.5) y Dunn's multiple rnge test. 져있다 (3). 대식세포에서사이토카인, TNF-α, lipopolyshride와같은자극은염증반응의전사인자인 NF-κB 를활성화시키며, 그결과 COX-2를발현시켜 nitri oxide 와 PGE 2 를생성하여염증을일으킨다 (32). 또한 COX-2는염증성자극에의해단시간에유도되어발현되며, 염증상황아래에서증폭되어대식세포, 단핵세포등에존재하는효소로염증, 통증, 발열등과관련이깊은것으로알려져있고, 이로인해염증에서발현되는암과관련된유전자로알려져있다 (33). 따라서 BD군이 Con군이나 CD, SD군에비해염증관련유전자발현단계를조절하여염증반응을억제할수있음을의미하며, 대장암의증상완화에효과적일수있다고말할수있다. 대장암을유발한쥐에게검정콩외피를섭취하였을때에노란콩에비해대장조직에서 COX-2의발현을억제시켰는데 (34), 검정콩의안토시아닌으로인해이를억제하는것으로보고되었다 (5). RT-PCR 을이용한 p2, p53, ylin D, Bl-2 의 mrna 발현분석 : p2, p53, ylin D과 Bl-2의발현결과는 Fig. 5와같다. BD군은 Con군과 CD군에비해 p2 과 p53의 mrna 발현이유의적으로증가하였다 (P<.5). Cylin D은 SD군이가장낮은발현을나타내었다 (P<.5). 하지만 BD군도 Con군과 CD군에비해낮은 ylin D의발현을나타내었다 (P<.5). p2은 DNA 손상에의한종양억제유전자 p53에의해조절을받으며, 이는세포주기전반에서세포증식을억제하는세포주기와연관된가장중요한조절인자로알려져있다. 또한여러 ylin/cdk omplex를억제하여세포각주기에작용하는광범위한 inhiitor이며 p53의하위 trget effetor로알려져있다. p53은암세포생성을억제하는유전자로알려져있으며인체조직에발생하는절반이상의암종에서변형되어나타나는것으로밝혀져있다 (35). 대장암이발현된쥐에서죽염으로만든된장이다른소금으로만든된장에비해 p2, p53의발현이높아졌다고한다 (36). 또한안토시아닌은 p53을조절하여 poptosis를유도하고 (37), 정상세포에는영향을끼치지않지만암세포에는 p2, p53과 ylin D을조절하여암세포활성을억제한다고한다 (38). 따라서 BD군에서 p2 과 p53의발현이증가한것과 ylin D의발현이줄어든것은된장속의죽염과안토시아닌에의해암세포증식을억제하였다고생각한다. Bl-2는 BD군이 Con군과 CD, SD군에비해가장낮은
276 박의성 이재양 박건영.4 p2 mrna expression (fold rtio)..8.6.4.2 mrna expression (fold rtio)..4.8.6.4.2 p53 mrna expression (fold rtio)..8.6.4.2 Cylin D mrna expression (fold rtio)..4.8.6.4.2 Bl-2 Fig. 5. mrna expression levels of doenjng extrted smples on p2, p53, ylin D, nd Bl-2 in HT-29 ner ells (.5 mg/ ml) y the tretment of different kinds of doenjngs. CD, ommeril doenjng; SD, soyen doenjng; BD, lk soyen doenjng. Fold rtio: Gene expression/ GAPDH ontrol numeril vlue (Control fold rtio=). Mens with the different letters (-d) ove rs re signifintly different (P<.5) y Dunn's multiple rnge test. 발현을보였다. Bl-2 fmily에속하는유전자는 poptosis 를직접적으로유발하거나억제하는데관여하며, 그들사이의상대적인유전자발현의양적차이에의해 poptosis 유발여부가결정된다 (39). 대장암이유도된쥐에서죽염으로만든된장을먹인쥐가다른소금으로만든된장을먹인쥐보다 Bl-2의 mrna 발현이낮아졌다고한다 (35). 하지만본실험에서는 CD군과 SD군이 Con군에비해 mrna의발현이증가되었다. 그리고 BD가 Con에비해낮아진것은검정콩의안토시아닌에의해발현이억제된것으로생각되며, 안토시아닌이 HCT-6 인체결장암세포의 Bl-2 발현을낮추는것으로연구되어있다 (4). 따라서된장을담을때어떤종류의재료를사용했는지에 따라된장의항암기능성이달라진다고볼수있으며, 검정콩된장에대한 in vivo 실험과발효기간을달리한검정콩된장에관련된추가적인연구가필요할것으로생각된다. 요약시료된장의 ph, 아미노태, 암모니아태수치는각군간특별한차이는보이지않았다. 검정콩된장이가장높은폴리페놀농도, DPPH를이용한항산화효과를보였다. 된장추출물은.~.5 mg/ml 범위까지는 RAW 264.7 ells의증식을억제하지않았으며, HT-29를이용한 MTT에서 BD 군이가장높은암세포성장억제율을보였다. HT-29에서
HT-29 인체대장암세포에서검정콩된장의 in vitro 항암효과 277 pro-inflmmtory ytokine 인 TNF-α, IL-6와염증관련인자 COX-2 의 mrna 발현은시료처리군에서대조군에비해낮은수치를나타냈으며 BD군에서가장낮은수치를보였다 (P<.5). 세포증식에관여하는 p2, p53과 ylin D의 mrna 발현은 p2과 p53가 BD군에서발현이증가하였고, ylin D은 BD군에서낮아졌다. Apoptosis 관련유전자인 Bl-2는 BD군이가장낮은발현을보였다. 이상의결과로 BD군은 CD, SD군에비해높은폴리페놀농도, 항산화효과, 대장암세포에서 pro-inflmmtory ytokines과세포증식에관여하는유전자등을조절한다. 이결과는아마도서목태된장의높은총페놀화합물의양과안토시아닌의함량으로얻어진결과로생각된다. 감사의글 이연구는 NCEED( 인하대학병원국가지정소화기질환의료제품유효성평가서비스센터 ) 의지원으로이루어졌음에감사를드립니다. REFERENCES. Kwk EJ, Prk WS, Lim SI. 23. Color nd qulity properties of doenjng dded with itri id nd phyti id. Koren J Food Si Tehnol 35: 455-46. 2. Kim MH, Im SS, Yoo YB, Kim GE, Lee JH. 994. Antioxidtive mterils in domesti Meju nd Doenjng: 4. Seprtion of phenoli ompounds nd their ntioxidtive tivity. J Koren So Food Nutr 23: 792-798. 3. Kim MJ, Rhee HS. 99. Studies on the hnges of tste ompounds during soy pste fermenttion. Koren J So Food Si 6: -8. 4. Jeong JK. 22. Improvement of qulity nd proioti effet of meju nd doenjng prepred with mixed strter ultures. PhD Disserttion. Pusn Ntionl University, Busn, Kore. p 4-5. 5. Shim JH, Prk ES, Kim IS, Prk KY. 25. Antioxidtive nd ntiner effets of doenjng prepred with moo slt in HT-29 humn olon ner ells. J Koren So Food Si Nutr 44: 524-53. 6. Jeong JK, Chng HK, Prk KY. 22. Inhiitory effets of meju prepred with mixed strter ultures on zoxymethne nd dextrn sulfte sodium-indued olon rinogenesis in mie. J Crinog : 3. 7. Cowrd L, Brnes NC, Sethell KDR, Brnes S. 993. Genistein, didzein, nd their β-glyoside onjugtes: ntitumor isoflvones in soyen foods from Amerin nd Asin diets. J Agri Food Chem 4: 96-967. 8. Hämäläinen M, Nieminen R, Vuorel P, Heinonen M, Moilnen E. 27. Anti-inflmmtory effets of flvonoids: genistein, kempferol, queretin, nd didzein inhiit STAT- nd NF-κB tivtions, wheres flvone, isorhmnetin, nringenin, nd pelrgonidin inhiit only NF-κB tivtion long with their inhiitory effet on inos expression nd NO prodution in tivted mrophges. Meditors Inflmm 27: 45673. 9. Ungr Y, Osundhunsi OF, Shimoni E. 23. Therml stility of genistein nd didzein nd its effet on their ntioxidnt tivity. J Agri Food Chem 5: 4394-4399.. Guo JM, Xio BX, Liu DH, Grnt M, Zhng S, Li YF, Guo YB, Liu Q. 24. Biphsi effet of didzein on ell growth of humn olon ner ells. Food Chem Toxiol 42: 64-646.. Lim SY, Prk KY, Be MS, Kim KH. 29. Effet of doenjng with lk soyen on ytokine prodution nd inhiition of tumor metstsis. J Life Si 9: 264-27. 2. Son JH, Choung MG, Choi HJ, Jng UB, Son GM, Byun MW, Choi C. 2. Physiologil effet of Koren lk soyen pigment. Koren J Food Si Tehnol 33: 764-768. 3. Lio HF, Cou CJ, Wu SH, Khoo KH, Chen CF, Wng SY. 2. Isoltion nd hrteriztion of n tive ompound from lk soyen [Glyine mx (L.) Merr] nd its effet on prolifertion nd differentition of humn leukemi U937 ells. Antiner Drugs 2: 84-846. 4. Kwon SH, Ahn IS, Kim SO, Kong CS, Chung HY, Do MS, Prk KY. 27. Anti-oesity nd hypolipidemi effets of lk soyen nthoynins. J Med Food : 552-556. 5. Khn HMS, Akhtr NAVEED. 22. Determintion of ntioxidnt tivity nd totl nthoynin. Asin J Chem 24: 2829-283. 6. Žilić S, Akıllıoğlu HG, Serpen A, Perić V, Gökmen V. 23. Comprisons of phenoli ompounds, isoflvones, ntioxidnt pity nd oxidtive enzymes in yellow nd lk soyens seed ot nd dehulled en. Eur Food Res Tehnol 237: 49-48. 7. Hngen L, Bennink MR. 22. Consumption of lk soyens nd nvy ens (Phseolus vulgris) redued zoxymethne-indued olon ner in rts. Nutr Cner 44: 6-65. 8. Prk SK, Seo KI, Shon MY, Moon JS, Lee YH. 2. Qulity hrteristis of home-mde doenjng, trditionl Koren soyen pste. Koren J So Food Si 6: 2-27. 9. Brnd-Willims W, Cuvelier ME, Berset C. 995. Use of free rdil method to evlute ntioxidnt tivity. LWT -Food Si Tehnol 28: 25-3. 2. Dewnto V, Wu X, Liu RH. 22. Proessed sweet orn hs higher ntioxidnt tivity. J Agri Food Chem 5: 4959-4964. 2. Prtt DE, Bir PM. 979. Soure of ntioxidnt tivity of soyens nd soy produts. J Food Si 44: 72-722. 22. Blois MS. 958. Antioxidnt determintions y the use of stle free rdil. Nture 8: 99-2. 23. Prk KT, Kim MY, Chun SS. 29. Qulity hrteristis of Koren whet wet noodles with pomegrnte ortex powder. Koren J Culinry Res 5: 28-36. 24. Kim HL, Lee TS, Noh BS, Prk JS. 999. Chrteristis of the stored smjngs with different doenjngs. J Koren Food Si Tehnol 3: 36-44. 25. Kim YS, Kim JY, Choi HS. 2. Qulity hrteristis of ommeril rie soyen pste. Koren J Food Preserv 8: 853-858. 26. Cho KM, Hong SY, Mth RK, Lee JH, Kmirnd DM, Kim JM, Islm SMA, Yun MG, Cho JJ, WJ Lim WJ, Yun HD. 29. Biotrnsformtion of phenolis (isoflvones, flvnols nd phenoli ids) during the fermenttion of heonggukjng y Billus pumilus HY. Food Chem 4: 43-49. 27. Hong Y, Prk S, Yoon BY, Choi BD, Choi YJ. 2. Sreen of funtionl tivity of polyshride nd glyosminoglyn from se hre (Aplysi kurodi) y ell line. J Koren So Food Si Nutr 4: 4-9. 28. Yoon HH, Kim IC, Chng HC. 22. Growth inhiitory effets of Doenjng, prepred with vrious solr slts, on n-
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