어젠다코드 1-7 - 22 구 분 세부완결 기술분야코드 V1 기술유형코드 S04 작목구분코드 PG-03-PG31 과제종류 기관고유 세세부사업 - 연구과제및세부과제 수행기간 과제책임자및세부책임자 자생식물자원화기반구축 09~ 13 농식품연구소 김희연 식물기원추출물은행및생리활성 library 작성 09~ 13 농식품연구소 김희연 색인용어 자원식물, 추출물 ABSTRACT We collected native plants in Gangwon-do of Korea. The native plants were extracted by water and ethanol and registered plant extract bank. In the anti-cancer activity, the growths of both human prostate cancer (DU145) and human colonic carcinoma cell (HT29) were inhibited up 80% by adding 10 mg / ml of plant extracts. Antioxidative activity of plant extracts were determined DPPH radical scavenging activity and SOD-like activity. Anti-inflammatory activity of plant extracts have been evaluated on lipopolysaccharide (LPS) induced release of nitric oxide (NO) by the macrophage RAW 264.7 cells. The selected extracts could be potentially used as a resource of bioactive materials for health functional foods. 1. 연구목표천연재료를활용한산업제품이소비트랜드로굳어져고부가가치산업화하고있으며, 식물자원이다양한강원도의전략산업으로유망하다. 천연물연구의효율적추진을위하여식물기원및소재의표준화, 추출물은행운영, 효율적이고정확한시료의원활한공급등통합적연구지원시스템구축과새로운소재탐색의기초자료로활용될 1차스크리닝작업이필요하다. 2. 재료및방법 ( 시험 1) 자생식물의수집및표본제작가. 식물수집국내자원은강원도자생식물을중점적으로수집하였으며, 국외자원은중국흑룡강성에서식하고있는기능성초본과목본을수집하였다. 명확한동정과지속적인채집이어려울경우시료와함께대부분종묘나종자형태로같이수집하여농식품연구소유전자원포에식재해두고, 이용부위, 채취시기에따라시료채집하고, 개화기에완전표본제작을통하여명확한식물분류 동정에사용하였다. 4. 농식품연구소 381
나. 식물표본제작채집한시료는채집식물의크기에따라거꾸로된형태의 V자, N, M자형으로적절하게꺾어서신문지 4절안에들어올수있는크기로잘펴서누르며, 흡습지 ( 시판압화건조용품활용 ) 를표본과표본사이에두고야책으로단단히눌러서냉풍제습건조기에서건조하였다. 건조된표본은표본용풀을이용하여대지에부착시키고, 채집위치, 일시, 채집자명등을기입하여표본보관함에보관하였다. ( 시험 2) 추출물조제및보관가. 시료추출및조제본실험에사용한자생식물시료는채취후동결건조 (PVTFD10R, Ilshin, Yangju, Korea) 하여사용하였다. 시료추출용매는물과에탄올을사용하였다. 물추출은분말시료 20 g에 1 차증류수 200 ml를첨가하여 60 o C에서 6시간동안초음파추출기 (8510R-DTH, Bransonic, Danbury, CT, USA) 를이용하여 2회추출하였다. 추출물은여과지 (No. 2, Whatman, Maidstone, England) 가깔려있는 Buchner funnel을통과시켜잔재물을제거한후감압여과하여 rotary vacuum evaporator (N-21NS, EYELA, Tokyo, Japan) 로완전히농축하였다. 농축이완료된후건조물은증류수 10 ml를첨가하여용해시킨후, 동결건조하여 -20 o C의냉동고에보관하면서사용하였다. 에탄올추출은분말시료 20 g에에탄올 200 ml를첨가하여상온에서 120 rpm의진탕기에서 12시간동안 2회추출하였다. 농축후시료제조과정은상기와같다. 나. 추출물보관및추출물은행등록추출물은수율에따라 1~5g 내외수준으로확보하여 25 ml 바이알에보존하며, 추출물등록번호, 용량을정확하게표기하여 -20 에서저온보관하였다. 1 유전자원등록관리대장 - G0001~( 숫자앞자리는수집연도, 나머지세자리는일련번호 ) 2 표본등록대장 - 식물표본 : GWAP0001~( 숫자앞자리는수집연도, 나머지세자리는일련번호 ) 3 추출물등록대장 - 등록번호 : 수집용도별일련번호기입관리 GWAPW0001~ : 자원식물물추출물 (25, 초음파추출 6h) (GWAP: 강원도농업기술원농식품연구소, W:Water, E:EtOH) ( 시험 3) 기능성탐색가. 항암활성검정 293 cell, HT-29 cell, DU-145 cell을한국세포주은행으로부터분양받아배양하면서실험에사용하였다. 배양된세포는 96 well plate에 1 104 cells/ ml가되도록 100 μl씩분주하여 37 CO2 Incubator에서 48시간배양하였다. 배지를제거한후, serum free 배지 90 μl를넣고 382 Ⅲ. 시험연구결과
각농도별로조제한시료를 10 μl씩분주하였으며, 37 CO2 Incubator에서 24시간배양하였다. 여기에 3-(4,5-dimethylthiazol-2-yl)-2,5-diphenyltetrazolium bromide(mtt) 용액 20 μl를첨가하여동일한배양조건에서 4시간동안더 incubation하였다. 이때생성된 formazan결정을 DMSO에녹여서 ELISA reader로 570 nm에서흡광도를측정하였다 (Wang 등 2006) 생존율 (%)=(1-시료처리군의흡광도 / 대조군의흡광도 ) 100 나. 항산화활성검정항산화활성은 DPPH radical에대한소거활성과 SOD(superoxide dismutase) 유사활성으로측정했으며, Biois의방법 (1958) 과 Lee 등의방법 (2009) 을변형하여측정하였다. 각농도별로조제한시료 0.2 ml에 0.2 mm의 DPPH 용액 0.8 ml를가하여혼합한뒤상온에서 30분간반응시킨후 UV-visible spectrophotometer(du 730, Beckman Coulter, Fullerton, USA) 를이용하여 517 nm에서흡광도를측정하였고, 각시료를 3회반복실시하여평균하였다. DPPH radical 소거능은시료용액의첨가구와무첨가구사이의흡광도의차이를아래와같이백분율로나타내었으며, 기존의항산화제인 Ascorbic acid(sigma, St. Louis, MO, USA) 를대조물질로사용하여비교하였다. DPPH radicals scavenging activity(%) = (1-시료첨가구의흡광도 / 무첨가구의흡광도 ) 100 SOD 유사활성은각각의추출물시료 0.2 ml과 Tris-HCl(pH 8.5) 3 ml 및 7.2 mm pyrogallol(sigma) 0.2 ml을첨가하여실온에서 10분동안반응후 1 N HCl 1 ml을가하여반응을정지시키고, UV/VIS spectrophotometer로 420 nm에서흡광도를측정한다. SOD 유사활성은시료용액의첨가구와무첨가구사이의흡광도의차이를백분율로나타내었다. 다. 항염활성검정 NO 소거활성은 Park 등의방법 (2010) 에따라한국세포주은행에서분양받은마우스의대식세포세포주인 Raw264.7 세포를이용하여측정하였다. 세포는 10% 의 FBS가함유된 DMEM media에서계대배양하였다. NO 소거활성을측정하기위하여세포를 24 well plate 에각 well당 1 105 cells을분주한후, 37, 5% CO2 incubator에서 24시간배양하였다. 그리고 final 농도를 10 mg / ml로조제한 sample과 1 μg / ml의 lipopolysaccharide(lps) 20 μl를세포배양 well에첨가하여 37, 5% CO2 incubator에서 24시간배양하였다. 시료에대한대조구로는 1 μg / ml의 LPS만을 20 μl처리하여활성화된세포를사용하였다. 배양후상징액 100 μl를회수하고여기에 2-naphthylamine이포함된 Griess solution(fluka Chmie AG, Buchs, Switzerland) 을첨가하여상온에서 15분간반응시킨후상등액의발색도를 ELISA reader(asys UVM-340, Biochrom Asys, Slazburg, Austria) 를사용하여 517 nm에서흡광도를측정하였다. 세포가생산한 NO는 sodium nitrate를사용하여표준곡선을작성한후 NO 함량을정량하였다. 4. 농식품연구소 383
3. 결과및고찰 ( 시험 1) 수집시료목록 식물명 학명 각시서덜취 Saussurea macrolepis (Nakai) Kitam. 각시원추리 Hemerocallis dumortieri Morren 각시취 Saussurea pulchella (Fisch.)Fisch. 개시호 Bupleurum longeradiatum Turcz. 고광나무 Philadelphus schrenkii Rupr. var. schrenkii 고려엉겅퀴 Cirsium setidens (Dunn) Nakai 고추나물 Hypericum erectum Thunb. 곤달비 Ligularia stenocephala (Maxim.) Matsum.&Koidz. 곤드레 Cirsium setidens (Dunn) Nakai 곰취 Liguraia fischeri (LEDES) TURCZ. 광대싸리 Securinega suffruticosa (Pall.) Rehder 구릿대 Angelica dahurica (Fisch.exHoffm.) Benth.&Hook.f. ex Franch.&Sav. 기린초 Sedum kamtschaticum Fisch. & Mey. 꿀풀 Prunella vulgaris var. lilacina Nakai 꿩의다리 Thalictrum aquilegifolium var. sibiricum Regel & Tiling 나비나물 Vicia unijuga A.Braun 냉이 Capsella bursapastoris (L.) L.W.Medicus 노랑민들레 Taraxacum ohwianum Kitam. 노루오줌 Astilbe rubra Hook.f. & Thomson var. rubra 누룩치 Pleurospermum camtschaticum Hoffm. 는쟁이냉이 Cardamine komarovii Nakai for. komarovii 다래나무 Actinidi aarguta (Siebold&Zucc.) Planch. ex Miq. var. arguta 단풍취 Ainsliaea acerifolia Sch. Bip. 달맞이꽃 Oenothera biennis L. 담배풀 Carpesium abrotanoides L. 더덕 Codonopsis lanceolata (Siebold & Zucc.) Trautv. 돌나물 Sedum sarmentosum Bunge 돌단풍 Mukdenia rossii (Oliv.) Koidz. 돌미나리 Oenanthe javanica (Blume) DC. 동의나물 Caltha palustris L. var. palustris 두릅 Aralia elata (Miq.) Seem. 땅두릅 Aralia cordata Thunb. 수리취 Synurus palmatopinnatifidus var. indivisus (Makino) Kitam. 뚝깔 Patrinia villosa (Thunb.) Juss. 384 Ⅲ. 시험연구결과
식물명 학명 마타리 Patrinia scabiosaefolia Fisch. ex Trevir. 만병초 Rhododendron brachycarpum D. Don ex G.Don 머위 Petasites japonicus (Siebold & Zucc.) Maxim. 모시대 Adenophora remotiflora (Siebold & Zucc.) Miq. 울릉도엉겅퀴 Cirsium nipponicum (Maxim.) Makino 돌미나리 Oenanthe javanica (Blume) DC. 미역취 Solidago virgaurea subsp. asiatica Kitam. ex Hara var. asiatica 박쥐나물 Parasenecio auriculata var. matsumurana Nakai 방가지똥 Sonchus oleraceus L. 버들나물 Hieracium umbellatum L. 범꼬리 Bistorta major S.F. Gray var. japonica Hara 병풀 ( 말굽 ) Centella asiatica (L.) Urb. 병풍쌈 Parasenecio firmus (Kom.) Y.L.Chen 부처꽃 Lythrum anceps (Koehne) Makino 비비추 Hosta longipes (Franch. & Sav.) Matsum. 뻐국채 Rhapontic umuniflorum (L.) DC. 사철쑥 Artemisia capillaris Thunb. 산마늘 Allium victorialis var. platphyllum MAKINO. 산미나리 Aegopodium podagraria L. 산씀바귀 Lactuca raddeana Maxim. 삽주 Atractylodes japonica KOIDZ. 생강나무 Lindera obtusiloba Blume var. obtusiloba 서덜취 Saussurea grandifolia Maxim. 서양민들레 Taraxacum officinale Weber 섬오갈피 Eleutherococcus gracilistylus (W.W.Sm.) S.Y.Hu 섬초롱 Campanula takesimana Nakai 쇠비름 Portulaca oleracea L. 수박풀 Hibiscus trionum L. 시호 Bupleurum falcatum var. scorzoneraefolium (Willd.) Ledeb. 싱아 Aconogonon alpinum (All.)S chur 싸리나물 ( 싸리 ) Lespedeza bicolor 쑥부쟁이 Aster yomena (Kitam.) Honda 씀바귀 Ixeridium dentatum (Thunb. ex Mori) Tzvelev 어수리 Heracleum moellendorffii Hance 얼레지 Erythronium japonicum (Balrer) Decne. 엉겅퀴 Cirsium japonicum var. maackii (Maxim.) Matsum. 영아자 Asyneuma japonicum (Miq.) Briq. 4. 농식품연구소 385
식물명 학명 오이풀 Sanguisorba officinalis L. 우산나물 Syneilesis palmata (Thunb.) Maxim. 원추리 Hemerocallis fulva 으아리 Clematis terniflora var. mandshurica (Rupr.) Ohwi 음나무 Kalopanax septemlobus (Thunb. ex Murray) Koidz. 응달고사리 Cornopteris crenulatoserrulata (Makino) Nakai 이고들빼기 Crepidiastrum denticulatum (Houtt.) Pak & Kawano 잔대 Adenophora triphylla var. japonica (Regel) H.Hara 좁쌀풀 Lysimachia vulgaris var. davurica (Ledeb.) R.Kunth 쥐똥나무 Ligustrum obtusifolium Siebold & Zucc. 지리산오갈피 Eleutherococcus divaricatus var. chiisanensis (Nakai) C.H.Kim & B.Y.Sun 진범 Aconitum pseudolaeve Nakai 질경이 Plantago asiatica L. 짚신나물 Agrimonia pilosa Ledeb. 참나물 Pimpinella brachycarpa (Kom.) Nakai 참당귀 Angelica gigas Nakai 참쑥 Artemisia dubia Wall. 참으아리 Clematis terniflora DC. 컴프리 Symphytum officinale L. 큰까치수염 Lysimachia clethroides Duby 큰미역취 Solidago virgaurea subsp. gigantea (Nakai) Kitam. 톱풀 Achillea alpina L. 파드득 Cryptotaenia japonica Hassk. 풀고비 Athyrium yokoscense (Franch. & Sav.) H.Christ 풀솜대 Smilacina japonica A.Gray var. japonica 할미질빵 Clematis trichotoma Nakai 홀아비꽃대 Chloranthus japonicus Siebold 활나물 Crotalaria sessiliflora L. 흰민들레 Taraxacum coreanum Nakai ( 시험 2) 기능성탐색가. 항암활성소재탐색자원식물 205종용매별 410점대상으로정상세포, 전립선암, 장암세포활성을검정한결과 GWAP8044 등물추출물 12종, 에탄올추출물 14종선발되었다. 386 Ⅲ. 시험연구결과
4. 농식품연구소 387
그림 5. 항암활성결과 나. 항산화활성소재탐색 자원식물 205종용매별 410점대상으로 DPPH 라디컬소거능과 SOD 유사활성을검정한결과 GWAP8058 등물추출물 4종, 에탄올추출물 4종선발되었다. 388 Ⅲ. 시험연구결과
그림 6. 항산화활성결과 4. 농식품연구소 389
다. 항염활성소재탐색 자원식물 205종용매별 410점대상으로 NO 생성능을검정한결과 GWAP0401 등 14 종선발되었다. 그림 7. 항염활성결과 4. 적요가. 강원도에서식하는기능성초본과목본을수집 추출하여천연물추출물은행을구축함나. 자원식물 205종용매별 410점대상으로항암활성을검정한결과 GWAP8044 등물추출물 12종, 에탄올추출물 14종이선발되었고, 항산화활성검정결과 GWAP8058 등물추출물 4종, 에탄올추출물 4종이선발되었고, 항염활성검정결과 GWAP0401 등 14종이선발되었음 5. 인용문헌 Wang HZ, Chang CH, Lin CP and Tsai MC. 2006. Using MTT viability assay to test the cytotoxicity of antibiotics and steroid to cultured porcine corneal endothelial 390 Ⅲ. 시험연구결과
cells. Journal of Ocular Pharmacology and Therapeutics. 12:35-43. Park YH, Lim SH, Ham HJ, Kim HY, Jeong HN, Kim KH and Kim S. 2010. Isolation of anti-inflammatory active substance β-sitosterol from seabuckthorn(hippophae rhamnoides L.) stem. Journal of Korean Society Food Science Nutrition. 39:980-985. Biois MS. 1958) Antioxidant determination by the use of a stable free radical. Nature. 26:1198-1201. Lee KJ, Park MH, Seo HT, Park YH, Kwon CJ, Lim SH, Kim KH, Jeon SJ and Won JH. 2009. Screening of biological activities of ethanol extracts from several varieties of endives. The Korean Society Food Reservation. 16:1008-1012. 6. 연구결과활용 천연물연구과제에추출물을지원하고결과활용은지원하는과제의결과활용에따름 7. 연구원편성 구분소속직급성명수행업무 참여년도 11 12 13 과제책임자 농식품연구소 농업연구사 김희연 과제수행 공동연구자 김시창 - - 농업연구관 허남기 과제지원 - 농업연구사 이광재 생리활성탐색 - 연구원 박유화 추출물조제 - - 함헌주 - - 이기연 생리활성탐색 홍수영 추출물조제 4. 농식품연구소 391