(460 신용길).fm

식물병연구 Res. Plant Dis. 19(1) : 36 44 (2013) http://dx.doi.org/10.5423/rpd.2013.19.1.036 Research Article Open Access Research in Plant Disease The Korean Society of Plant Pathology RT-PCR 에의한카네이션괴저바이러스와카네이션둥근반점바이러스정밀진단 이시원 1,2 강은하 1,3 허노열 1 김상목 1 김유정 1 신용길 1 * 1 농림수산검역검사본부식물검역기술개발센터, 2 단국대학교미생물학과, 3 성균관대학교유전공학과 Detection of Carnation necrotic fleck virus and Carnation ringspot virus Using RT-PCR Siwon Lee 1,2, Eun-Ha Kang 1,3, Noh-Yeol Heo 1, Sang-Mok Kim 1, Yu-Jeong Kim 1 and Yong-Gil Shin 1 * 1 Plant Quarantine Technology Center, Suwon 443-440, Korea 2 Department of Microbiology, Dankook University, Cheonan 330-714, Korea 3 Department of Genetic Engineering, Sungkyunkwan University, Suwon 440-746, Korea (Received on June 14, 2012; Revised on February 13, 2013; Accepted on February 20, 2013) Carnation is considered to be one of the top three cutting flowers in the world, which is a main crop with 21 billion annual volume of manufacture. The four carnation items such as cuttings, seed, plant and unrooted cuttings are imported and exported. Viruses can be easily transmitted during vegetative propagation of carnation. Carnation necrotic fleck virus (CNFV) and Carnation ringspot virus (CRSV) are designated as Korea plant quarantine viruses and inspected. This study was aimed to develop specific primer sets for easy and rapid detection of CNFV and CRSV. Two RT-PCR primer sets were efficiently amplified 288 and 447 bp fragments for CNFV and 503 549 bp fragments for CRSV. Furthermore, developed nested primer sets make possible to high sensitive detection and verification. CNFV nested PCR primer sets all produced band of 147 bp and CRSV nested PCR primer sets did bands of 395 and 347 bp. In addition, plasmid inserted 6 sequences in amplicon were used as a positive control to improve inspection confidence. The successful application of PCR module newly developed in this study will be highly useful for detect of CNFV and CRSV for quarantine inspections. Keywords : Carnation, Carnation necrotic fleck virus, Carnation ringspot virus, Mutation-positive control 서론 카네이션 (Dianthus caryophillus) 은지중해연안에자생하는석죽과의 Dianthus속에서개량된다년초로써세계 3대절화용화훼작물이며 (Kim 등, 2004), 중요한경제작물로취급되고있다 (Zuker 등, 1999). 국내에서는 4대절화작목중하나로연간농가생산액이 210억원에이르며, 주로김해와부산을중심으로남부지역과고랭지에서재배되고있다. 스승의날, 졸업과입학시즌및어버이날등특정시기에수요가급증하고, 정식기에는종묘의공급이부족하며, 카네이션의생산비문제로묘주를거의 **Corresponding author Phone) +82-31-204-0918, Fax) +82-31-204-0668 E-mail) syg1286@korea.kr 전량수입하여사용하고있다 (Kang 등, 2011). 카네이션은절화, 종자, 묘및삽수의 4품목으로수출입하고있다. 2010년식물검역연보에따르면, 우리나라에서는절화 221건 (965,509개), 묘 1건 (6,000개) 및삽수 11건 (17,995개) 의수출검사와절화 131건 (9,541,221개), 묘 102건 (5,556,511개 ) 및삽수 23건 (1,669 kg) 의수입검사가이루어졌으며, 전체적으로수출보다수입검사량이월등히많다. 2009 2010년식물검역연보의작물별수입검사건수에따르면, 옥수수 (40%), 목화 (18%), 밀 (16%) 및호박 (5.5%) 에이어카네이션은 4.5% 로 5번째를기록했으며, 2010년에도 4.5% 로 6번째를기록했다. 카네이션과같은영양번식성작물의경우, 증식하는과정중에바이러스의확산과전파가용이하며 (Kim 등, 2004), Carnation latent virus (CLV), Carnation ringspot virus (CRSV), Carnation mottle virus (CarMV) 및 Carnation

RT-PCR 에의한카네이션괴저바이러스와카네이션둥근반점바이러스정밀진단 37 vein mottle virus (CVMV) 등약 20여종의바이러스가감염되는것으로알려져있다 (Hollings와 Stone, 1964). 이중 Arabis mosaic virus (ArMV), Carnation etched ring virus (CERV), CNFV, CRSV 및 Tomato bushy stunt virus (TBSV) 는식물검역원고시제 2012-136호에따라관리병해충으로규정되어, 수입카네이션품목들에서검사하고있다. 자유무역협정 (Free Trade Agreement) 이후수출입의물동량이지속적으로증가하면서카네이션의수출입에대한검사건수도증가할전망이며, 이에따라식물바이러스진단과관련된보다효율적인검사방법이지속적으로요구되고있는추세이다. 최근에는현재의검사방법인 enzymelinked immunosorbent assay (ELISA) 보다간편하고민감도가높은 RT-PCR 방법으로식물바이러스를검사하는방법이연구되어정착되고있다 (Kim 등, 2000; Kim 등, 2005; Lee 등, 2011a, 2011b; Park 등, 2004). 본연구에서는카네이션에감염될수있는식물검역바이러스중, 카네이션괴저바이러스 (CNFV) 와카네이션둥근반점바이러스 (CRSV) 를간편하고신속하게진단할수있는종특이적인 primer를각각두 set씩고안하였고, 더높은민감도로검출이가능하면서 1차 PCR을검증할수있는 nested PCR primer set를선발하였다. 또한실험시검사의신뢰도를높일수있도록돌연변이-양성대조구클론 (mutation-positive control) 을제작하였다. 재료및방법 표준시료. 금지품수입허가를통해검사법개발대상바이러스인 CNFV와 CRSV가감염된시료를수집하였으며 (ADGEN, England), 2차와 3차선발에사용된 cdna 시료는국내기업 (PLUTOS, Korea) 에서구매하여실험에활용하였다. Primer 제작. CNFV와 CRSV의진단용 primer를설계하기위하여미국국립생물정보센터 (National Center for Biotechnology Information, NCBI) 로부터 CNFV (EU884443), CRSV (L18870) 그리고 CNFV와분류학적으로유사한클로스터비리데 (Closteroviridae) 3종 (Beet yellow stunt virus, Beet yellows virus 및 Citrus tristeza virus) 및 CRSV와분류학적으로유사한토버스비리데 (Tombusviridae) 7종 (Furcraea necrotic streak virus, Red clover necrotic mosaic virus, Sweet clover necrotic mosaic virus, Maize chlorotic mottle virus, Tomato bushy stunt virus, Tobacco necrosis virus 및 Carnation mottle virus) 의염기서열을다운로드하였다. 각각의다운로드한염기서열들은 DNAMAN DNA analysis software package (DNAMAN version 6.0; Lynnon Biosoft, Canada) 를사용하여 sequence alignment 후 annealing temperature 51 59 o C를조건으로종특이적인염기서열을탐색하였다 (Pan 등, 2000). CNFV는정방향 8가지와역방향 7가지, CRSV는정방향 9가지와역방향 8가지 primer 를설계하였으며 (data not shown), 설계한 primer 정보는 Table 1에기재하였다. Primer 선발. 설계한 CNFV와 CRSV의 primer는 PCR 증폭이가능한 21가지와 54가지로조합하였으며, 이후 4단계에걸쳐선발하였다. 1차선발로 primer 조합들과대상바이러스와의특이적반응여부를보고, 2차선발로유연관계에있는바이러스와의비특이적반응여부를확인하였다. 3차선발로기주관련바이러스와의비특이적반응여부를확인한후, 4차선발로기주 genomic DNA와의비특이적반응여부를확인하였다. 2차와 3차선발은각각바이러스들의 cdna를사용하였으며, CNFV는 ArMV, CRSV와의비특이적반응을확인하였고, CRSV는 Tobacco necrosis virus (TNV), TBSV, ArMV 및 CNFV와의비특이적반응을확인하였다. 이때, target의예상크기이외에추가로형성된밴드는모두비특이적인반응이라고간주 하였다. 핵산추출. SolGent RNA mini prep kit (Solgent, Korea) 를사용하여감염시료의잎에서 total RNA의추출하였으며, DNeasy Plant mini kit (Qiagen, Netherlands) 를사용하여카네이션의 genomic DNA를추출하였다 (Woo, 2002). 각시료 0.1 g을멸균된막자사발에담아액체질소를첨가하여마쇄하였고, 최종적으로 nucleic acid free water 20 µl에녹인후 RT-PCR 과 PCR의주형으로사용하였다. PCR. RNA에서 one-step RT-PCR을위에서추출한 total RNA 1 µl를주형으로, 설계한정방향과역방향 primer (25 pmol) 를각각 1 µl, deionized distilled water (Sigma, USA) 7 µl 및 RT-PCR PreMixture (Plutos, Korea) 10 µl를넣어총볼륨 20 µl로수행하였다. RNA에서 cdna 합성은감염시료의잎에서추출한 total RNA 2 µl를주형으로, M-MuLV Reverse transcriptase (Roche, Switzerland) 4 µl, N25 primer (50 pmol, NNN NNN NNN NNN NNN NNN NNN NNN N) 3 µl, 2 mm dntp (Enzynomics, Korea) 2 µl, RNasin (Promega, USA) 0.7 µl, M-MuLV (Roche, Switzerland) 1.6 µl 및 DW 6.7 µl로총볼륨 20 µl로수행하였다. 이후합성된 cdna를주형으로, Fast PCR PreMixture (Plutos, Korea) 10 µl를포함하여총볼륨 20 µl에맞춰 nested PCR을실시하였다. PCR은카네이션 genomic DNA 1 µl를주형으로정방향과역방향 primer (25 pmol) 를각각 1µl, deionized distilled water 7 µl 및 Fast PCR

38 이시원 강은하 허노열 김상목 김유정 신용길 Table 1. Nucleic acid sequence of oligonucleotide primers used RT-PCR assay of the Carnation necrotic fleck virus and Carnation ringspot virus in this study Primer name Sequence Length (bp) Location CNF_N10 5'-TTG CGT CAA CAG GAT TCC-3' 18 79 96 CNF_N20 5'-AAT CTC GTG AAG TGG CGT-3' 18 131 148 CNF_N30 5'-TAC ACT TAC GCC TTA CCC G-3' 19 355 373 CNF_N40 5'-TAT GTT CAG TTC CCG CAG-3' 18 449 466 CNF_N50 5'-GCA CAT AAT CAA CGA ACC C-3' 19 531 549 CNF_N60 5'-CGT ATC AGG CGT ATC AGT TAG-3' 21 636 656 CNF_N70 5'-GGA AAT GGT TTA CAG CCG-3' 18 732 749 CNF_N80 5'-CAT TAT GGT GTC GCC TGA-3' 18 864 881 CNF_C10 5'-CCA GGT AAG TAT GAA AGT CCA C-3' 22 1,031 1,052 CNF_C20 5'-GTG TCG CCA AAG TGG ATA-3' 18 806 823 CNF_C30 5'-CTC CAG AAC TAC GAA CAA CA-3' 20 669 688 CNF_C40 5'-ATT GTA ACC ACT CAA GGT GAC G-3' 22 504 525 CNF_C50 5'-CTG AAC ATA CGA CAC CTG AA-3' 20 438 457 CNF_C60 5'-GGC GTA AGT GTA AAT ACC TTG C-3' 22 345 366 CNF_C70 5'-AAC CCA TCT CTTGAG GTC G-3' 19 207 225 CRS_N08 5'-TAC TTC AGG GCA TTC GGT-3' 18 2,208 2,225 CRS_N10 5'-CGT CCA GAG AAT AGT AGA AGG T-3' 22 2,237 2,258 CRS_N20 5'-CGA CTT CAC AAG GAT TTA CTC G-3' 22 2,325 2,346 CRS_N30 5'-GCC TAA ACA GCG TCA GAA-3' 18 2,408 2,425 CRS_N40 5'-ACG CAA CCA CCC AGA TAG TC-3' 20 2,461 2,480 CRS_N50 5'-CCT ACT CCC AGT TTG CTC A-3' 19 2,583 2,601 CRS_N60 5'-GAC AGA GAC TCC CAA GAT GT-3' 20 2,745 2,764 CRS_N70 5'-CGA TGT CTG GAG GTT TGT AA-3' 20 2,855 2,874 CRS_N80 5'-CAG ACA GCA TAC TGG GAT G-3' 19 3,024 3,042 CRS_N90 5'-AGG AAC TCT GGT CGT AGG TC-3' 20 3,185 3,204 CRS_C10 5'-TAC TAA GGT TGC GGA CTG C-3' 19 3,566 3,584 CRS_C20 5'-GGT TCT CGT CTC CTA AGG TAA G-3' 22 3,505 3,526 CRS_C30 5'-AAC TTT GTT GGC GGC TAC-3' 18 3,401 3,418 CRS_C40 5'-TGG CAC CGA TTA CCG ATA-3' 18 3,211 3,228 CRS_C50 5'-TGT CCA TAA TCG GAG AGC-3' 18 2,900 2,917 CRS_C60 5'-ATA CAC AGC CGT AGA CAC CG-3' 20 2,806 2,825 CRS_C70 5'-AGT CTC TGT CCC ACA TCA GT-3' 20 2,735 2,754 CRS_C80 5'-CGA TAC AGG TCG TAG TTC G-3' 19 2,653 2,671 PreMixture 10 µl, 전체 20 µl로실시하였다. RT-PCR은 42 o C, 60분의역전사반응과 95 o C, 10분의 denaturation 후 95 o C에서 45초, 55 o C에서 1분, 72 o C에서 1분과정을 35회반복후, 마지막으로 72 o C에서 5분간반응시켰다. RNA 를주형으로 cdna 합성은 42 o C에서 60분후 60 o C에서 10분반응시켰으며, PCR은 RT-PCR 의역전사반응을제외한나머지와동일하게반응시켰다. PCR 산물은 1X TAE buffer를이용하여 1.2% agarose gel에서 80분전기영동후 ethidium bromide (SIGMA-ALDRICH) 로염색하여 UV 하에서확인하였다. 효율성검증과 nested PCR. 1 4차선발에합격한 primer 조합중민감도가가장높은 primer 조합을선발하기위하여 total RNA를원액 ~10 8 까지희석하였으며, 각각 1µl를주형으로 one-step RT-PCR로반응하여민감도가가장좋은 primer set를두개씩선발하였다. 최종선발된 primer set에대하여각각의 nested primer 조합을설계하였으며, 1차 PCR 산물을 1/100 희석하여 1µl를주형으로, 위에서사용한 PCR 조건과동일하게반응시켰다. 염기서열분석과양성대조구제작. 최종선발된 nested primer set의 PCR 증폭산물에대해염기서열분석을의

RT-PCR 에의한카네이션괴저바이러스와카네이션둥근반점바이러스정밀진단 39 뢰하였으며 (Bioneer, Korea), 분석된염기서열에서 primer binding site를확인하였다. 양성대조구제작을위하여최종선발된 primer set 두개의구간을모두포함하는 PCR 산물을증폭하였으며, 이것을 pgem -T Easy Vector를사용하여클로닝하였다 (Promega, USA). 양성대조구로선발된클론에 nested primer 증폭부위안쪽으로제한효소 Xho I이반응할수있는염기서열인 CTCGAG (6 bp) 를 Site-Directed Mutagenesis Kit를사용하여삽입하였으며 (Nelson과 McClelland, 1992), 제품의프로토콜에따라수행하였다. 결과 RNA 추출. 금지품허가를통해구입한 CNFV와 CRSV 감염시료에서 total RNA를각각 155.04 ng/µl와 345.36 ng/µl 추출하였다. 또한 CNFV에감염된잎은감염된바이러스의농도가너무낮아, 1과 3µl를사용하여 1차선발을수행하였다. Primer set 선발. CNFV의최적진단용 primer set를선발하기위해설계한 21가지 primer 조합들로 1차선발을진행한결과, one-step과 two-step RT-PCR 모두에서밴드가형성된것은조합 1(CNF_N10/C60, 288 bp), 조합 2(CNF_N10/C50, 379 bp), 조합 3(CNF_N10/C40, 447 bp), 조합 7(CNF_N20/C50, 327 bp), 조합 8(CNF_N20/C40, 395 bp), 조합 12(CNF_N30/C30, 334 bp) 및조합 18 (CNF_N50/C20, 293 bp) 로 7가지조합이선발되었다 (Fig. 1A). CRSV의최적진단용 primer set를선발하기위해설계한 54가지조합들로 1차선발을진행한결과, onestep과 two-step RT-PCR 모두에서좋은결과를나타낸밴드는조합 2(CRS_N10/C80, 435 bp), 조합 3(CRS_N10/ C70, 518 bp), 조합 27(CRS_N40/C70, 294 bp), 조합 28 (CRS_N40/C60, 365 bp), 조합 29(CRS_N40/C50, 457 bp), 조합 46(CRS_N70/C30, 564 bp), 조합 49(CRS_N80/C30, 395 bp), 조합 50(CRS_N80/C20, 503 bp) 및조합 54 (CRS_N08/C70, 547 bp) 로 9가지가선발되었다 (Fig. 1B). 염기서열유사바이러스와유연관계바이러스에서의비특이적인밴드가나타나는 primer 조합을제외하기위한 2, 3차선발에서 CNFV의조합들은 ArMV와 CRSV에비특이적인밴드를형성하지않아 7가지모두선발하였으나 (Fig. 2A), CRSV는 3차선발중 ArMV에서조합 28과 46 및 49에서비특이적인밴드가형성되어이를제외시킨 6가지조합을선발하였다 (Fig. 2B). 기주 genomic DNA 와의비특이적반응여부를확인하는 4차선발에서 CNFV 의 7가지조합들은카네이션의 genomic DNA와비특이 Fig. 1. First selection of specific primer sets for the detection of CNFV and CRSV. (A) CNFV. M, 100 bp step DNA Ladder maker (Genepia, Korea); lane 1 42, two-step. RT-PCR (template 1 µl and 3 µl); lane 43 63, one-step RT-PCR (set #1 21). Lane 1 2, set #1; 3 4, set #2; 5 6, set #3; 7 8, set #4; 9 10, set #5; 11 12, set #6; 13 14, set #7; 15 16, set #8; 17 18, set #9; 19 20, set #10; 21 22, set #11; 23 24, set #12; 25 26, set #13; 27 28, set #14; 29 30, set #15; 31 32, set #16; 33 34, set #17; 35 36, set #18; 37 38, set #19; 39 40, set #20; 41 42, set #21. (B) CRSV. M, 100 bp step DNA Ladder maker; lane 1 54, two-step RT-PCR; lane 55 108, one-step RT-PCR. 적인밴드를형성하지않았으며, CRSV의 7가지조합들역시카네이션과금낭화에서도 CRSV를선발하기위한 primer 조합들은비특이적인밴드를형성하지않았다 (data not shown). 효율성검증. 4단계선발을거친 CNFV 조합 7가지모두와 CRSV 조합 6가지중 nested primer 조합을많이

40 이시원 강은하 허노열 김상목 김유정 신용길 Fig. 2. Second and third selection of primer sets to detect CNFV and CRSV. (A) CNFV. M, 100 bp step DNA Ladder maker; lane 1 8 15, primer set #1; lane 2 9 16, primer set #2; lane 3 10 17, primer set #3; lane 4 11 18, primer set #7; lane 5 12 19, primer set #8; lane 6 13 20, primer set #12; lane 7 14 21, primer set #18. (B) CRSV. M, 100 bp step DNA Ladder maker; lane 1 10 19 28 37, primer set #2; lane 2 11 20 29 38, primer set #3; lane 3 12 21 30 39, primer set #27; lane 4 13 22 31 40, primer set #28; lane 5 14 23 32 41, primer set #29; lane 6 15 24 33 42, primer set #46; lane 7 16 25 34 43, primer set #49; lane 8 17 26 35 44, primer set #50; lane 9 18 27 36 45, primer set #54. 만들수있는조합 2가지를대상으로희석한계실험을실시하였다. 실험결과, CNFV primer 조합 1, 3 및 18에서 10 2 의민감도를보였고, 나머지조합들은모두 10 1 이하의민감도를보였으며 (Fig. 3A), CRSV는조합 50과 54에서각각 10 3 과 10 4 의민감도를보였다 (Fig. 3B). Nested PCR primer 선발. 선발된 CNFV 조합 1, 3 및 18에대하여각각 3가지, 7가지및 2가지의 nested primer 조합을설계하였고, CRSV 조합 50과 54에대하여각각 4가지와 13가지의 nested primer 조합을설계하였다. 설계 한모든조합에서밴드가형성되었으며, 일부흐리거나 target 하는크기에맞지않거는비특이적인밴드도나타났다 (Fig. 4). Nested PCR primer는밴드의밝기와두께, 비특이적인밴드의유무, primer set와의사이즈차이등을고려하여최종선발하였다 (Table 2). 최종선발된 nested PCR primer set는 CNFV의경우두개의 primer set 공통으로 CNF_N10/C70 (147 bp) 이선발되었고, CRSV의경우조합 50에대해서는 CRS_N80/C30 (395 bp) 이, primer set 54에대해서는 CRS_N30/C70 (347 bp) 이선발되었다.

RT-PCR에 의한 카네이션괴저바이러스와 카네이션둥근반점바이러스 정밀진단 41 Fig. 3. PCR sensitivity test for the detection of CNFV and CRSV. (A) CNFV. lane 1 9, primer set #1; lane 10 18, primer set #2; lane 19 27, primer set #3; lane 28 36, primer set #7; lane 37 45, primer set #8; lane 46 54, primer set #12; lane 55 63, primer set #18. (B) CRSV. lane 64 72, primer set #50; lane 73 81, primer set #54. Fig. 4. Specificity test of nested PCR detect for CNFV and CRSV. Circle, final selected nested primer sets.

42 이시원 강은하 허노열 김상목 김유정 신용길 Table 2. Final selection and nested primer sets to detect CNFV and CRSV Virus CNFV CRSV Final selection primer sets Nested primer sets Mutation positive control (bp) Upstream Downstream Length (bp) Upstream Downstream Length (bp) CNF_N10 CNF_C60 288 CNF_N10 CNF_C70 147 CNF_N10/C30 CNF_N10 CNF_C40 447 CNF_N10 CNF_C70 147 (616) CRS_N80 CRS_C20 503 CRS_N80 CRS_C30 395 CRS_N08/C19 CRS_N08 CRS_C70 549 CRS_N30 CRS_C70 347 (1,337) Table 3. Sequence information of final selection and nested primer sets Primer Sequence Size (bp) Length (bp) CNFV #1 CNFV #3 CNFV #1,3 nested CRSV #50 CRSV #54 CRSV #50 nested CRSV #54 nested CNF_N10 5'-TTG CGT CAA CAG GAT TCC-3' 18 CNF_C60 5'-GGC GTA AGT GTA AAT ACC TTG C-3' 22 CNF_N10 5'-TTG CGT CAA CAG GAT TCC-3' 18 CNF_C40 5'-ATT GTA ACC ACT CAA GGT GAC G-3' 22 CNF_N10 5'-TTG CGT CAA CAG GAT TCC-3' 18 CNF_C70 5'-AAC CCA TCT CTTGAG GTC G-3' 20 CRS_N80 5'-CAG ACA GCA TAC TGG GAT G-3' 18 CRS_C20 5'-GGT TCT CGT CTC CTA AGG TAA G-3' 22 CRS_N08 5'-TAC TTC AGG GCA TTC GGT-3' 18 CRS_C70 5'-AGT CTC TGT CCC ACA TCA GT-3' 20 CRS_N80 5'-CAG ACA GCA TAC TGG GAT G-3' 19 CRS_C30 5'-AAC TTT GTT GGC GGC TAC-3' 18 CRS_N30 5'-GCC TAA ACA GCG TCA GAA-3' 18 CRS_C70 5'-AGT CTC TGT CCC ACA TCA GT-3' 20 288 447 147 503 549 395 347 Primer set와 nested primer set의자세한정보는 Table 3 에기재하였다. 염기서열분석과돌연변이-양성대조구제작. 양성대조구제작을위해 primer set가제작된영역을포함하는부분인 CNFV 610 bp와 CRSV 1331 bp의밴드를증폭시켜클로닝후염기서열을분석한결과, 모두 binding site가확인되었다 (data not shown). 돌연변이-양성대조구는염기서열을삽입후제한효소 Xho I을처리하여확인한결과, 6개의 nucleotide가삽입되어각각 616 bp와 1,337 bp가증폭되었으며, plasmid에제한효소염기서열의삽입은 CNFV(Fig. 5A) 와 CRSV(Fig. 5B) 에서각각확인하였다. 고 찰 Fig. 5. Xho I restriction enzyme to cut mutation-positive plasmid. The digestion products were analyzed on a 1.2% agarose gel post prestained with ethidium bromide. (A) CNFV. M, 100 bp step DNA Ladder maker; lane 1 4, control; lane 5 8, results. (B) CRSV. M, 100 bp step DNA Ladder maker; lane 1 4, control; lane 5 8, results. 카네이션은 1996년부터 2012년까지 17년간, 종자 6건 (1,000 kg 미만 ), 묘 1,413건 (75,154,600개), 삽수 103건 (4,700 kg + 317,710개 ) 및절화 1,632건 (333,390 kg + 84,612,770개 ) 의수입검사가이루어졌다 (Pest information system, 농림검역검사본부인트라넷 ; http://10.110.128.100). 이중묘에서 Fusarium moniliforme, Alternaria alternata,

RT-PCR 에의한카네이션괴저바이러스와카네이션둥근반점바이러스정밀진단 43 Uromyces dianthi, Cladosporium echinulatum, Stemphylium botryosum 및 Botrytis cinerea와같은곰팡이 6종, 9건과절화에서 Uromyces dianthi, Cladosporium echinulatum, Alternaria dianthi, Cladosporium herbarum, Stemphylium botryosum, Alternaria alternata, Botrytis cinerea, Fusarium oxysporum, Epicoccum purpurascens 및 Fusarium avenaceum 과같은곰팡이 10종 185건등많은곰팡이검출실적을보였다. 반면, 지난 17년간 CNFV와 CRSV는각각 1,968,830 건의검사가이루어졌으나, 이를포함하여바이러스가검출되어검역처분을한경우는아직한번도없었다. 한편, 카네이션에서 CRSV를진단하기위한 non-isotopic molecular hybridization 방법은연구된적이있었지만 (Sánchez-Navarro 등, 1999), CNFV와 CRSV를진단하기위한 2단계 PCR 검사법은연구되지않았다. 따라서 2011 년까지국내수입되는카네이션시료에서 CNFV와 CRSV 의검사는모두 ELISA로이루어졌다. 검사에많은시간이소요되며, 민감도가낮다는문제점이있는 ELISA는 (Caruso 등, 2003; Priou 등, 2006) 최근에 2단계 PCR 검사방법 (RT-PCR과 nested PCR) 으로대체되었으며, 2012년부터는본연구에서개발한검사방법을도입하여 CNFV 와 CRSV를검사하고있다. 최근 Real-time PCR이나 Loop-mediated isothermal (LAMP) PCR 등과같은다양한방법들이등장하였다 (Cho 등, 2012; Lu 등, 2012; Meng 등, 2012; Pan 등, 2012). 하지만 Real-time PCR은비용이많이들고, 특별한 probe를제작해야하며, 실험실오염문제와짧은증폭부위때문에아직은검역적진단법으로아직사용하지못하고있으며, LAMP PCR 또한너무예민한민감도에따른거짓양성반응때문에검역검사방법으로는사용하지못하고있는실정이다. 본연구에서는 CNFV와 CRSV에종특이적인염기서열을이용하여 RT-PCR 과 nested PCR을위한 primer set와실험시양성대조구로사용할수있는돌연변이-양성대조구를고안하였다. 돌연변이- 양성대조구는실험시양성대조구로사용될것이며, 염기서열을분석하면 6개의염기서열삽입유무에따라 plasmid에서시료로부터의오염을확인할수있을것이다. 본연구에서개발한방법이카네이션절화, 종자, 묘, 삽수등수입검역시료에서 CNFV 와 CRSV를신속, 정확그리고특이적으로검출가능하여검역검사에기여할것이라고예상된다. 요약 카네이션은세계 3 대절화용화훼작물의하나로, 농가 생산액 210억원에이르는주요작물이다. 이들은절화, 종자, 묘및삽수의 4 품목으로수출입되고있다. 카네이션과같은영양번식성작물의경우, 증식하는과정중에바이러스의확산과전파가용이한데, 우리나라에서는카네이션괴저바이러스 (CNFV) 와카네이션둥근반점바이러스 (CRSV) 를식물검역바이러스로지정하여수입검사를수행하고있다. 본연구에서는 CNFV와 CRSV를신속, 정밀하고쉽게진단할수있는특이적인프라이머를고안하였으며, 높은검출감도를가지는 nested 프라이머조합을개발하였다. CNFV를검사하기위해최종선발된특이적인프라이머는 2 세트로 288과 447 bp를, CRSV를검사하기위해최종선발된특이적인프라이머는 2 세트로 503과 549 bp를증폭하였다. CNFV의 nested는 2 세트모두 147 bp로동일하며, CRSV는각각 395와 347 bp 의밴드를증폭하였다. 또한, 실험의신뢰도를높이기위하여, 증폭산물에염기서열 6개를삽입한플라스미드를제작하여양성대조구로활용하였다. 본연구에서개발한방법은, 향후 CNFV와 CRSV에대한신속, 정밀한국경검역을지원할수있을것이라고기대된다. References Caruso, P., Bertolini, E., Cambra, M. and López, M. M. 2003. A new and sensitive co-operational polymerase chain reaction for rapid detection of Ralstonia solanacearum in water. J. Microbiol. Method. 55: 257 272. Cho, M. S., Park, D. S., Lee, J. W., Chi, H. Y., Sohn, S. I., Jeon, B. K. and Ma, J. B. 2012. Quantitative real-time PCR assay for detection of Paenibacillus polymyxa using membrane-fusion protein-based primers. J. Microbiol. Biotechnol. 22: 1575 1579. Hollings, M. and Stone, O. M. 1964. Investigation of carnation viruses. I. Carnation mottle. Ann. Appl. Biol. 53: 103 118. Kang, C. H., Han, B. S., Kown, S. H. and Song, Y. J. 2011. Selection of suitable varieties of carnation (Dianthus caryophyllus L.) and optimization of culture conditions for efficient tissue culture. Korean J. Plant Res. 24: 121 129. (In Korean) Kim, D., Hyun, J., Hwang, H. and Lee, S. 2000. RT-PCR Detection of Citrus tristeza virus from early Satsuma mandarin and Yuzu in Cheju Island. Plant Pathology J. 16: 48 51. Kim, Y. J., Park, S., Yie, S. W. and Kim, K. H. 2005. RT-PCR Detection of dsrna Mycoviruses Infecting Pleurotus ostreatus and Agaricus blazei Murrill. Plant Pathology J. 21: 343 348. Kim, Y. S., Jeong, J. H. and Eun, J. S. 2004. Virus free healthy plant production through meristem culture in carnation

44 이시원 강은하 허노열 김상목 김유정 신용길 (Dianthus caryophillus). Korean J. Plant Res. 17: 331 338. (In Korean) Lee, J. S., Cho, W. K., Choi, H. S. and Kim, K. H. 2011a. RT-PCR Detection of Five Quarantine Plant RNA Viruses Belonging to Poty-and Tospoviruses. Plant Pathology J. 27: 291 296. Lee, J. S., Cho, W. K., Lee, S. H., Choi, H. S. and Kim, K. H. 2011b. Development of RT-PCR based method for detecting five non-reported quarantine plant viruses infecting the family Cucurbitaceae or Solanaceae. Plant Pathology J. 27: 93 97. Lu, X., Li, X., Mo, Z., Jin, F., Wang, B., Zhao, H., Shan, X. and Shi, L. 2012. Rapid identification of Chikungunya and Dengue virus by a real-time reverse transcription-loopmediated isothermal amplification method. Am. J. Trop. Med. Hyg. 87: 947 953. Meng, S., Xu, J., Xiong, Y. and Ye, C. 2012. Rapid and sensitive detection of Plesiomonas shigelloides by loop-mediated isothermal amplification of the huga gene. PLoS One 7: 1 6. Nelson, M. and McClelland, M. 1992. Use of DNA methyltransferase/endonuclease enzyme combinations for megabase mapping of chromosomes. Methods Enzymol. 216: 279 303. Pan, L., Zhang, L., Wang, G. and Liu, Q. 2012. Rapid, simple, and sensitive detection of the ompb gene of spotted fever group rickettsiae by loop-mediated isothermal amplification. BMC Infect Dis. 12: 254 260. Pan, Y. B., Burner, D. M. and Legendre, B. L. 2000. An assessment of the phylogenetic relationship among sugarcane and related taxa based on the nucleotide sequence of 5S rrna intergenic spacers. Genetica 108: 285 295. Park, M. R. and Kim, K. H. 2004. RT-PCR Detection of three non-reported fruit tree viruses useful for quarantine purpose in Korea. Plant Pathology J. 20: 147 154. Priou, S., Gutarra, L. and Aley, P. 2006. An improved enrichment broth for the sensitive detection of Ralstonia solanacearum (biovars 1 and 2A) in soil using DAS-ELISA. Plant Pathology J. 55: 36 45. Sánchez-Navarro, J. A., Cañizares, M. C., Cano, E. A. and Pallás, V. 1999. Simultaneous detection of five carnation viruses by non-isotopic molecular hybridization. J. Virol. Method. 82: 167 175. Woo, G. J., Park, S. H., Lee, D. H., Lee, W. Y., Lee, S. H., Park, Y. C., Kwak, H. S., Kang, Y. S., Park, J. S., Nam, B. S. and Kim, C. N. 2002. Establishment of the detection methods for genetically modified foods. Annu. Rep. KFDA. Zukker, A., Ahroni, T., Tzfira, T., Ben-Mier, H. and Vainstein, A. 1999. Wounding by bombardment yields highly efficient Agrobacterium-mediated transformation of carnation (Dianthus caryophyllus L.). Mol. Breeding 5: 367 375.