원저 Lab Med Online Vol. 6, No. 1: 36-40, January 2016 임상미생물학 혈액배양검체접종을위한 Previ Isola 시스템과수기법의비교평가 Evaluation of Automated Specimen Inoculation for Blood Culture Samples by Use of the Previ Isola System Compared with the Manual Method 박영춘 윤진상 김지명 권계철 구선회 Yeongchun Park, M.D., Jin Sang Yoon, M.T., Jimyung Kim, M.D., Gye Cheol Kwon, M.D., Sun Hoe Koo, M.D. 충남대학교의과대학진단검사의학교실 Department of Laboratory Medicine, College of Medicine, Chungnam National University, Daejeon, Korea Background: Recently, a new automated inoculating instrument, Previ Isola (biomérieux, France) was introduced. Although there are many evaluation reports about the inoculation of urine and body fluid samples using Previ Isola, no evaluation has been reported for blood samples. The objectives of this study were to evaluate this instrument for the inoculation of blood samples and to compare the microbiological results with the manual loop-to-plate method. Methods: From March 2014 to July 2014, a total of 296 non-duplicate blood samples showing positive signals on the BacT/Alert 3D system were obtained, and both manual and automated methods were used for sample inoculation. Results of the two methods were compared according to five aspects: the culture result, number of single colonies, morphology of colonies, number of re-inoculations, and time required for inoculation. Results: The sensitivity and specificity of Previ Isola were 98.9% and 96.6%, respectively. The positive and negative predictive values were 99.6% and 90.3%, respectively, and the total concordance rate was 98.6%. For Previ Isola and the manual methods, the number of average usable single colonies per plate was 25 and 16, the number of re-inoculations was 60 and 62, and the inoculation time for 15 blood samples was 30 min and 75 min, respectively. The morphology of colonies showed no differences between the two methods. Conclusions: The automated inoculation instrument, Previ Isola, showed relative good concordance with manual method, with high sensitivity and high specificity for blood sample inoculation. Previ Isola may be useful for inoculating specimens including blood samples. Key Words: Previ Isola, Automation, Inoculation, Blood culture 서론 균혈증은혈액내세균이존재하는경우로써, 효과적인항균제 로치료하기위하여혈액배양검사를통하여원인균을신속하게 검출하고정확하게동정하는것이매우중요하다 [1]. 혈액배양은 Corresponding author: Sun Hoe Koo Department of Laboratory Medicine, Chungnam National University Hospital, 282 Munhwa-ro, Jung-gu, Daejeon 35015, Korea Tel: +82-42-280-7798, Fax: +82-42-257-5365, E-mail: shkoo@cnu.ac.kr Received: December 5, 2014 Revision received: June 12, 2015 Accepted: June 12, 2015 This article is available from http://www.labmedonline.org 2016, Laboratory Medicine Online This is an Open Access article distributed under the terms of the Creative Commons Attribution Non-Commercial License (http://creativecommons.org/licenses/by-nc/3.0/) which permits unrestricted non-commercial use, distribution, and reproduction in any medium, provided the original work is properly cited. 일반적으로혐기성및호기성혈액배양을동시에실시하며양성으로나오는경우균동정검사에들어가게된다. 임상미생물검사실업무중균동정및감수성검사는자동화된장비를많이사용하고있으나검체접종은아직까지업무의특성상수기법에많이의존하고있으며이에많은인력과시간이요구되고있다. 이를개선하기위하여 Inocula instrument (Dynacon Inc., Mississauga, Ontario, Canada), MicroStreak (LabTech Systems, Kent Town, South Australia) 과 Previ Isola (biomérieux, France) 등과같은자동접종장비들이국내에소개되었지만아직까지활발히사용되고있지못하는실정이다 [2-4]. 그중 Previ Isola 장비의체액과요검체자동접종에서의유용성에대한평가는있으나아직까지혈액검체자동접종의유용성에대한평가가이루어지지않은실정이다. 이번연구에서는혈액배양된검체를여러가지평판배지에접종함에있어서 Previ Isola 를이용한자동접종법과수기법을비교평가하였다. 36 www.labmedonline.org eissn 2093-6338
재료및방법 예측도를계산하였다. 1. 검체 2014년 3월부터 7월까지혈액배양이의뢰된검체중 BacT/Alert 3D system (biomerieux Inc., Durham, NC, USA) 에서양성신호를보인 296명환자의혈액검체를평가에이용하였다. 같은환자에서중복검체가온경우한검체만연구에포함시켰다. 혈액배양병은성인은혈액배양한세트인호기성과혐기성배양병으로 BacT/ Alert SA/SN bottle (biomerieux Inc.) 을사용하였고소아에서는 BacT/ALERT PF Culture bottles (biomerieux Inc.) 을사용하였다. 균동정및감수성검사는 Vitek II System (biomerieux, Marcy, I Eltoile, France) 을이용하였고필요시 API 동정 Kit (biomerieux, Durham, NC, USA) 를보조적으로이용하였다. 2. 검체접종 : 자동화장비법자동화장비 PREVI Isola (biomerieux, France) 를회사의지침서에따라사용하였다. 먼저일회용멸균주사기를이용하여혈액배양병의검체를 2.5 ml 정도검체튜브에옮긴후장비에장착하면일회용 tip을이용하여혈액검체 10 μl를미리장착된평판배지에자동으로분주하고접종기구 (applicator) 를사용하여 50 rpm의속도로원형회전하는평판배지에획선하였다. 3. 검체접종 : 수기법 1 ml 일회용멸균주사기를이용하여호기성또는혐기성배양병에서적당량의혈액검체를흡인후평판배지에한방울 (10-20 μl) 떨구고정량백금이를이용하여 4획선법으로획선하였다. 배지선택은혈액한천과 MacConkey 배지를기본으로혐기성배양병에서만자란경우추가로초콜릿배지와 phenylethyl alcohol agar (PEA) 배지에접종하였고소아용혈액배양병검체는초콜릿배지에도접종하였다. 접종한배지는모두 35, 5% CO 2 배양기에서최소 18시간배양하였다 [1]. 4. 수기법과자동화장비법의비교평가수기법과자동화장비법으로혈액검체가접종된평판배지들은동시에판독하여다음과같은다섯가지항목에대하여기록하고비교평가하였다. 1) 배양결과에따른통계적분석배양양성의기준은배지에서집락의크기에상관없이하나이상의집락이관찰되는경우로하였고음성기준은 5일까지재배양을하여도균집락이형성되지않는경우로정의하였다. 수기법을기준으로하여자동접종법의민감도와특이도, 양성예측도, 음성 2) 단독집락수혈액한천에서만균이자란경우혈액한천배지에서만단독집락수를계수하였고혈액한천배지와 MacConkey배지모두에서균이자란경우대부분그람음성균이므로 MacConkey배지에서만단독집락수를계수하여기록하였다. 3) 집락성상균집락의성상을크기, 모양, 빛깔및혼합집락여부를기록하고두가지방법간에차이를비교하였다. 집락의크기는 1 mm 미만인경우아주작음 (tiny), 1-2 mm 사이는작음 (small), 2-3 mm 사이는중간 (medium), 3 mm 이상은큼 (large) 으로기록하였고모양은 round, irregular, round with projection, undetermined 로구분하여기록하였다. 4) 재접종여부단독균집락을얻을수없는경우, 균집락이아주작은경우, 효모형균주가의심되는경우, 접종실패한경우와혼합균주인경우재접종을시행하였다. 또한효모형균주가의심되는경우육안으로구별되지않는그람양성균과혼재가능성을배제하고효모형균주단독집락을얻기위하여 Sabouraud dextrose agar (SDA) 평판배지에재접종하였다. 5) 접종소요시간접종소요시간은 15개의혈액검체를검체바코드출력으로부터검체접종을완료하기까지의소요시간을기록하여두가지방법간에비교하였다. 결과 BacT/Alert 자동혈액배양기에서양성신호를보인검체는 296개였으며배양기간을보면 1일만에자란경우가 180건 (67.2%) 으로가장많았고 2일만에자란경우가 56건 (20.9%), 3일만에자란경우가 20건 (7.5%), 4일만에자란경우가 7건 (2.6%), 5일만에자란경우가 5건 (1.9%) 이었다. 그중 111개검체의배양병에자란균증식여부를기록하였고분석한결과호기성배양병에서만균이증식한경우는 32건 (28.8%), 혐기성배양병에서만균이증식한경우는 27 건 (24.3%), 두가지배양병에서모두균이자란경우가 39건 (35.1%) 이었으며, 소아용혈액배양병에서균이자란경우가 13건 (11.7%) 이었다. 수기법과자동화장비법으로접종한배지에서균집락이자란경우는총 268 검체였으며, 균집락이관찰되지않은경우는 www.labmedonline.org 37
28 건으로이는자동혈액배양기의위양성이었다. 268 검체에서동 정된균주는총 286 건이며그중그람양성알균은 139 건, 그람양 성막대균은 18 건, 그람음성막대균은 112 건, 효모균은 16 건이었 다 (Table 1). 1. 수기법과자동화장비법의비교 1) 배양결과에따른통계적분석 수기법에서는 267 건에서균이증식되었고 29 건에서는균이증 식되지않았으며자동화장비법에서는 265 건에서균이증식되었 고 31 건에서는균이증식되지않았다. 두방법간에차이를보이는 경우는 4 검체였으며그중한검체는자동화장비법의혈액한천배 지에서는균이증식되었으나수기법에서균이증식되지않아수기 법의위음성이었으며 Candida pelliculosa 로동정되었다. 나머지 3 검체는모두소아검체로혈액한천배지에재접종한결과, 균증식 이관찰되었고각각 Weissella confusa, Bacillus species 와 Streptococcus sanguis 로동정되었다. 그외혐기성배양병에서만균이 증식된 2 검체는수기법에서는혈액한천배지와초콜릿배지모두에 서자랐으나자동화장비법에서초콜릿배지에서만균이자랐으며 각각 Enterococcus faecium 과 Staphylococcus epidermidis 였다. 자동화방법의민감도와특이도는각각 98.9% 와 96.6% 였고양성 예측도와음성예측도는각각 99.6% 와 90.3% 였고전체일치도는 98.6% 였다 (Table 2). Table 1. Results of isolated bacteria species Gram stain Number Species Gram (+) Cocci 139 Coagulase-negative staphylococci, Staphylococcus aureus, Enterocaoccus faecium, Enterococcus faecalis, Streptococcus pyogenes, Staphylococcus saprophyticus, Alloiococcus otitis, Gemella sanguinis Bacilli 18 Bacillus spp., Corynebacterium jeikeium, Corynebacterium striatum, Corynebacterium amycolatum, Weissella confusa (formerly Lactobacillus confusa) Gram (-) Bacilli 112 Escherichia coli, Klebsiella pneumoniae, Acinetobacter baumannii, Pseudomonas aeruginosa, Enterobacter cloacae, Klebsiella oxytoca, Morganella morganii, Stenotrophomonas maltophilia, Salmonella group D Yeast Cocci 16 Candida albicans, Candida tropicalis, Candida glabrata, Candida parapsilosis Table 2. Comparison of Previ Isola with the manual method Automated method (Previ Isola )* Growth No growth Total Manual method Growth 264 1 265 No growth 3 28 31 Total 267 29 296 *Automated method: sensitivity, 98.9%; specificity, 96.6%; positive predictive value, 99.6%; negative predictive value, 90.3%; concordance rate, 98.6%. 2) 단독균집락수산정 단독균집락수를비교한결과자동접종방법에서는매평판배 지당평균 25 개였고수기법에서는평균 16 개였으며대부분자동접 종방법에서더많은단독균집락수를보였고수기법에서더많은 집락수를보이는경우는주로 bacillus species 와일부 coagulase negative staphylococci 였다. 또한두가지균주가혼합된경우에도 자동화장비법에서단독균집락수가더많이관찰되어분리가더 용이하였다. 3) 집락성상 두가지방법으로접종한배지에서모두균이자란경우에대하 여집락의성상을관찰한결과일치하는성상이관찰되었다. 차이 가있는경우는자동접종법에서집락의크기가수기법보다크게 보이는경우가 10 건정도있었으나크기등급에는차이가없었다. 혼합집락은두가지방법모두 17 건에서관찰되었으며그람염색 결과, 모두그람음성인경우가 5 건, 모두그람양성인경우가 2 명, 그람음성균과양성균이함께분리된경우는 10 건으로두가지방 법상일치하는결과를보였다. 4) 재접종 재접종이필요한경우는자동접종법에서 60 건 (22%), 수기법에 서 62 건으로큰차이를보이지않았다. 자동접종법에서재접종의 원인을분석한결과균주가아주작은경우 (tiny) 가 19 건, 혼합균주 인경우가 18 건, 효모형균주인경우가 13 건, 접종에실패한경우 가 5 건, 단독집락을얻지못한경우가 5 건이었다 (Table 3). 5) 접종소요시간 하루평균접종수인 15 개의혈액검체를대상으로시간을측정 Table 3. Reasons for re-inoculation with Previ Isola Reasons Number Species Mixture 18 Enterococcus faecium & Escherichia coli, Staphylococcus epidermidis & Pseudomonas aeruginosa, E. coli & Klebsiella pneumoniae, Staphylococcus capitis & K. pneumoniae, E. coli & E. faecium, Stenotrophomonas maltophilia & E. faecium, etc. Tiny colony 19 Streptococcus, Bacillus spp., Actinomyces, Corynebacterium spp., Streptococcus parasanguinis, Aerococcus, Gemella sanguinis, etc. Yeast 13 Candida albicans, Candida tropicalis, Candida glabrata, Candida parapsilosis No single colony 5 Bacillus spp., K. pneumoniae, etc. Inoculation failure 5 E. faecium, S. epidermidis, Bacillus spp., Streptococcus sanguis, Weissella confusa (formerly Lactobacillus confusa) 38 www.labmedonline.org
한결과검체접수및배지준비에 45분, 검체접종에 75분소요되어총 120분이소요되었고 Previ Isola 를사용한경우는검체접수및배지준비에 30분, 검체접종에 30분소요되어총 60분이소요되었다. 한개의검체당평균접종시간은 4분이단축되었다. 고찰 혈액배양은균혈증, 패혈증, 심내막염, 판막염, 정맥내카테터연관혈류감염증, 화농성혈전정맥염및진균성동맥류의원인균을진단하고치료지침및예후를결정하는데필수적인검사법이다. 기존의접종방식은시간을많이필요로하고반복적이고숙련된기술을요구하는작업으로, 검사자에게반복적인스트레스와감염위험이있다. 최근에개발된 Previ Isola 는액상미생물검체를 Pre-Poured Media (PPM) 에분주하고접종하도록고안된자동화된장비로서자체 HEPA 필터가갖춰져있어기존접종과정에서발생할수있는검체간오염이없으며검사실내, 검사자, 타검체간에발생될수있는오염원및감염원을효과적으로제거하고시간과인력절감효과가있으며높은재현성을제공한다는장점들이있다. 이번연구에서는 BacT/Alert 자동혈액배양기에서양성신호를보인 296건의검체를분석하였으며그중에서균집락이자란경우는 268건, 균이자라지않은경우는 28건으로위양성률은 9.4% 였으며이는 Uh 등의보고에서의 3.7%-12.3% 빈도와유사하였다 [5]. 접종된검체의양은자동화장비법에서는 10 μl로수기법에서의한방울 (10-20 μl) 보다좀더적었지만매평판배지당관찰된단독집락수는자동화장비법에서 25개로수기법의 16개보다평균 9개의단독균집락을더형성하는것을볼수있었다. 균동정이나감수성검사시단독집락을사용하기에배지에서검사에필요한충분한단독집락수가있는지여부는자동접종법의유용성평가에서매우중요한항목이었다. 또한혼합집락이존재하는경우에도독립된균집락이더많이관찰되어균집락의분리가수기법보다용이하였다. 배지에서관찰되는균집락이너무작거나두가지이상의다른성상의집락을보이거나, 단독집락을얻을수없는경우재접종이필요할수있다. 이번연구에서재접종이필요한경우는자동화접종법에서전체 296개의검체중 60건으로 22% 를차지하였는데이는수기법의 62건과비슷하였으며재접종의원인은균종특성상균집락이너무작거나두가지이상균이혼재된경우가가장많았다. 검체접종에소요되는시간은 15개의검체기준으로수기법에서 75분, Previ Isola 자동접종장비에서 30분소요되어시간절약및노동력절감효과가있을것으로예상하였다. 이번연구에서 Previ Isola 를이용한자동화접종법은수기법에비하여 98.6% 의높은일치도를보였으며민감도와특이도는각각 98.9% 와 96.6% 를보였다. 이는 Glasson 등의보고에서의 99% 의민감도와 99.7% 의특이도와비슷하였다 [2]. 자동화장비법에서균이증식되었으나수기법에서균이자라지않은 1건은 Candida pelliculosa로동정되어수기법의위음성으로추정되었다. 수기법에서는균이자랐으나자동화장비법에서균이자라지않은검체는 3건이었고자동화접종법의위음성이었다. 그외그람양성균이자란 2검체는수기법에서는 BAP와초콜릿배지모두에서자랐으나자동화장비법에서는초콜릿배지에서만균이자랐고혈액배지에서는균이자라지않아부분접종실패라고볼수있었다. 원인은일시적인오류에의하여접종기구 (applicator) 의축이동이발생하거나검체튜브의위치이동등원인에의하여일회용 tip이검체튜브밖에위치하면서검체흡인실패로배지에혈액검체접종이되지않은경우였다. 이와같이자동화장비법으로접종한배지에서예기치않게균이증식되지않는경우그람염색결과를확인하여그람양성또는그람음성균이관찰되면재접종및재배양을하기때문에놓칠가능성은거의없다고볼수있다. 검체접종시간은 75분에서 30분으로단축되어시간절약및노동력감축효과로검사실효율증대효과를가져올수있었다. Previ Isola 자동접종장비는검사자의숙련도의영향을받지않아일관된결과를얻을수있다는장점과검사소요시간을반으로줄여검사효율을증대하는효과를얻을수있다는장점이있지만단점으로장비사용과유지보수에따른비용이발생함으로혈액검체뿐만아니라소변등여러검체에서적용할때비용대비효과적일수있을것으로생각된다. 본연구에서는혈액검체만을대상으로하였으나혈액외에도소변, 체액, 객담등여러가지검체에서의자동접종효과에관련하여여러연구결과가발표되어다양한검체에서 Previ Isola 자동접종방법을사용함으로써전반적인미생물검사실자동화에도움이될것으로생각된다 [2, 4, 6, 7]. 이번연구를통하여 Previ Isola 장비를이용한혈액검체자동접종법은수기법과높은일치도, 민감도와특이도를보였으며혈액검체자동접종에수기법을대체하여유용하게사용될수있을것으로판단하였다. 요약 배경 : 최근임상미생물검사실에검체의접종업무를자동으로수행하는 Previ Isola (Bio-merieux, France) 가소개되었다. Previ Isola 장비의체액과요검체자동접종에서의유용성에대한평가는있으나아직까지혈액검체자동접종의유용성에대해서는평가가이루어지지않은실정이다. 이번연구에서는혈액검체를자동접종함에있어서수기법과비교하여그유용성을평가하였다. 방법 : 2014년 3월부터 7월까지임상미생물검사실에혈액배양이의뢰된검체중 BacT/Alert 3D system (biomerieux Inc., USA) 에서양 www.labmedonline.org 39
성신호를보인중복되지않는 296명환자의혈액검체를임의로선택하였다. 수기법과자동화장비법으로혈액검체가접종된평판배지들은동시에판독하여배양결과, 단독집락수, 집락성상, 재접종여부, 접종소요시간등다섯가지항목에대하여기록하고비교평가하였다. 결과 : 자동화방법의민감도와특이도는각각 98.9% 와 96.6% 였고양성예측도와음성예측도는각각 99.6% 와 90.3% 였고전체일치도는 98.6% 였다. 단독집락수는자동접종법에서매평판배지당평균 25개로수기법 (16개 ) 보다 9개가많았고, 집락의성상은차이를보이지않았다. 재접종이필요한경우는자동화장비법 (60건) 이수기법 (62 건 ) 과비슷하였고접종소요시간은 15개검체를기준으로자동화장비법 (30분) 이수기법 (75분) 보다단축되었다. 결론 : 자동화장비 Previ Isola 는수기법과의일치도가 98.6% 로비교적우수하였고, 높은민감도와특이도를보였으므로혈액검체자동접종에유용하게사용될수있을것으로판단되었다. REFERENCES 1. Chong Y, Lee K, et al. Diagnostic microbiology. 4th ed. Seoul: Seoheung Publishing Company, 2009:58-113. 2. Glasson JH, Guthrie LH, Nielsen DJ, Bethell FA. Evaluation of an automated instrument for inoculating and spreading samples onto agar plates. J Clin Microbiol 2008;46:1281-4. 3. Greub G and Prod hom G. Automation in clinical bacteriology: what system to choose? Clin Microbiol Infect 2011;17:655-60. 4. Mischnik A, Mieth M, Busch CJ, Hofer S, Zimmermann S. First evaluation of automated specimen inoculation for wound swab samples by use of the Previ Isola system compared to manual inoculation in a routine laboratory: finding a cost-effective and accurate approach. J Clin Microbiol 2012;50:2732-6. 5. Uh Y, Jang IH, Park SD, Kim KS, Seo DM, Yoon KJ, et al. Factors influencing the false positive signals of continuous monitoring blood culture system. Ann Clin Microbiol 2014;17:58-64. 6. Nebbad-Lechani B, Emirian A, Maillebuau F, Mahjoub N, Fihman V, Legrand P, et al. New procedure to reduce the time and cost of broncho-pulmonary specimen management using the Previ Isola automated inoculation system. J Microbiol Methods 2013;95:384-8. 7. Kim Y, Yoon S, Sohn YS, Lee Y, Chung HS, Lee W, et al. Evaluation of an automated instrument, PREVI Isola for inoculation of body fluids and urine samples onto agar plates. Lab Med Online 2011;1:105-9. 40 www.labmedonline.org