한국어병학회지제27권제1호 (214) www.ksfp.org pissn 1226-819, eissn 2233-5412 J. Fish Pthol., 27(1) : 47~56 http://dx.doi.org/1.7847/jfp.214.27.1.47 Propolis extrcts 가양식넙치의면역활성능에미치는영향 남현주 박경일 최민순 군산대학교해양과학대학수산생명의학과 Effects of propolis extrcts on the immune response in cultured flounder, Prlichthys olivceus Hyun ju Nm, Kyung Il Prk nd Min soon Choi Dept. of Aqutic Life Medicine Kunsn Ntionl University. Kunsn, 573-4, Kore Propolis is beehive product with very complex chemicl composition, widely used in folk medicine becuse of its severl therpeutic ctivities. This study ws conducted to mesure the efficcy of propolis on non-specific defense rections, specific immune response, nd protection levels ginst pthogen chllenge with Streptococcus inie. in vitro nd in vivo. In vitro, the phgocytic ctivity nd NBT ssy of peripherl blood leukocytes (PBL) were evluted in vrious propolis extrctsconcentrtions (, 1, 5, 1, 15, 25 nd 5 μg/ml). The optiml concentrtion showing ctivtion of propolis extrcts ws determined to 1 μg/ml. In vivo, they were divided into four groups (, propoli extrctss, vccine, propolis extrcts + vccine) in vivo. Fish were received i.p. injection of either or propolis extrcts, nd in the presence or bsence of formlin inctivted S. inie (1 1 8 CFU/fish), respectively. The level of hemtocrit is not ffected mong experimentl groups. The phgocytic ctivity nd the NBT reduction ctivities of hed kidney phgocyte were mrkedly (p<.5)ugmented in the propolis extrcts groups thn in the -control group, respectively. The level of serum lysozyme ctivity ws significntly (p<.5) incresed in the propolis extrcts treted groups thn in the -control group. The gglutinin titer ws significntly (p<.5) enhnced in the vccine+propolis extrcts group thn in the vccine group, but there ws no difference between -control nd propolis treted group. The results of the present study suggest tht propolis extrcts seems to be promising compounds of non-specific immune stimultor, lso being ble to use good djuvnt. Key words: propolis, NBT, phgocytosis, lysozyme, ntibody 국내의양식넙치산업에서문제시되고있는연 쇄구균증은주로어체의성장이빠른고수온기인 하절기에매년발생하기때문에넙치양식어가에 Corresponding uthor: Min-Soon Choi Tel: +82-1-6747-1883, Fx: +82-63-469-7444 E-mil: Choims@kunsn.c.kr 심각한경제적부담을초래하고있다. 본증의원인체는 Streptococcus. inie로서그람양성세균의 β- 용혈성을보이며, 이환된어체는외관상채색흑화, 안구백탁, 복부종대및탈장증상을보이는것이특징이다 (Kim et l., 25; Beck et l., 26; Angew nd Brnes 27). 본증의예방및치료를위해서주로항균요법에의존되어지고있다. 그렇지만과
48 남현주 박경일 최민순 도한약제의빈번한사용은약제내성균의확산으로치료에어려움을증가시킬뿐만아니라, 어체내에약제의잔류로인해서공중보건학적으로도매우심각한문제로지적되고있다 (Brton nd Iwm, 1991; Iwm et l., 1997; Kim et l., 26; Kim et l., 21). 이러한이유로최근에는경제적이면서부작용이적은미생물유래의 lipopolyscchride 및 Peptidoglycn/MDP, 약용-식용식물유래의 β-1,3-d-glucn, polyscchride 및 Aloe 추출물그리고합성제재인 levmisole 등을이용한어체의비특이적면역증강을통한질병예방효과가매우긍정적으로평가되고있다 (Ingrm, 1992; Ji nd Wu., 1993; Ski, 1999; Kim et l., 1999). 통상적으로식용및약용의천연산물들이양식어체의면역증강제로서활용되기위한조건으로서는어류체내에독성작용이거의없을것, 환경친화적일뿐만아니라, 증체율향상과더불어탁월한생리활성작용을필요로한다 (Burdock, 1998; Sthl, 1992; Kim et l., 1999; Ji & Wu 24). 한편, propolis extrcts는식물유래의 3여종의다양한성분들이꿀벌에의해서변조된수지성화합물이 9% 를차지하며, 꽃가루등의에스텔류, 유기물과미네랄등이 5% 등으로구성된혼합물질로알려져있다. 이들혼합성분들은항미생물, 항종양및항염등의효과적인것으로알려져있다 (Bnkov, 25,b). 최근포유류및가금등을대상으로비특이적면역증강물질로써활용가능성이매우긍정적으로평가되고있다. (Dobrovolski et l., 1991; Cuest et l., 25; Sforcin, 25; Chu, 26). 더욱이 propolis extrcts가천연산물로써환경친화적이며, 섭취후에독성이거의없기때문에면역활성물질로써이상적으로사료된다. 이에본실험에서는양식넙치를대상으로 propolis extrcts의면역증강효과에미치는영향을조사하였다. 재료및방법 시험어본실험에사용된넙치 Prlichthys olivceus( 약 5 g) 는전북부안에소재한군산대학교부속해양연구원에서사육중인넙치를산소공급조절장치가부착된수조운반차량을이용하여서 1 ton 원형의 FRP 수조에수용하였다. 전실험기간동안의평균사육수온은 22±2 범위로유지하였고, 환수는 1일 2회수량의 1/3정도를환수하면서필요에따라수온유지를위해 heter를사용하였다. 사료는넙치용 EP( 주 ; 우성사료 ) 사료를어체중량의 2% 를 1일 2회급이하였다. 세균불활화백신제조백신제작은국립수산진흥원으로부터분양받은 Streptococcus inie (S. inie, JSL28) 를이용하였다. 증균은균주를 1.5% NCl이첨가된 BHI broth (Difco, USA) 에접종하여 wter bth(3, 48 h) 로진탕배양하였다. 균액의불활화는 1% 중성포르말린 (Sigm) 을증균배양액의 3% 가되도록첨가하여 18시간처리하였으며, 배양균액의일부를 BHI gr(difco, USA) 에서접종배양시비발육상태를확인하였다. 백신으로사용할균액은불활화시킨균액을원심분리 (1 g, 1분 ) 하여상징액을제거하고멸균 phosphte buffered sline(, ph 7.2) 로 3회세정한다음비색계 (Schmzue, Jpn) 를이용하여 OD 63nm 1.(5 1 9 CFU/ml) 농도로제조하였으며, 제조한균액을냉장보존 (4 ) 하면서사용하였다. Propolis 수용액 proplis의추출은 Sforcin(25) 의방법에준하여시행하였다. 간기하면구입한프로폴리스 (3 g) 를증류수를첨가하여총량이 1ml이되게균질화희석시킨추출물을여과후에 evportion을시킨후 -7 냉동상태에보존하였다. 한편, 필요에따라서 propolis extrcts를 로 45 수조에서용해시킨후.45 μl filter 여과멸균하여사용하였다. Zymosn 옵소닌화 Zymosn(.2 g, Sigm) 을 FBS 1 ml를첨가하여 25, 3분간반응시켰다. 반응시킨 zymosn을원심분리 (35 g, 1 min) 상징액을제거하였다. 옵소닌화된 zymosn 을 L-15배지로세정후상징액을
Propolis extrcts 가양식넙치의면역활성능에미치는영향 49 버리고 nitroblue terzolium(nbt, Sigm) 1 mg/ml로조정된 NBT용액을 L-15 배지에넣어총 1 ml 되게하였다. In vitro에서말초혈액백혈구의활성능 In vitro에서 propolisextrcts 의농도차 (, 1, 5, 1, 15, 25 및 5 μg/ml) 에따른식세포의활성능을조사하기위해서양식넙치의 pheripherl blood leukocytes(pbl) 의 phgocytosis 및 NBT reduction 조사를하였다. 이때사용한어체는 5마리였다. PBL의분리및 propolis처리 PBL의분리및활성능측정은 Anderson et l (1992) 의방법에준하였다. 즉양식넙치를 MS-222 로마취시킨후에헤파린처리주사기를이용하여서미정맥으로부터채혈하였다. 멸균커버글라스 (22 4 mm, mrienfeld) 위에채혈한혈액을.2 ml 과 propolis extrcts 를농도별 (, 1, 5, 1, 15, 25 및 5 μg/ml) 로.2 ml을첨가하여 22 의 humidity chmber에서 1시간배양후에적혈구및비부착세포들을 로세정하였으며, 여과지로과다한세정액을제거하였다. NBT 및식균능측정 NBT 측정은멸균된슬라이드글라스위에.2% NBT(sigm) 용액.2 ml을적하시킨후상기와같이준비된백혈구부착커버글라스를거꾸로올려놓은다음습윤배양기에서 2 hrs 반응시켰다. 광학현미경 (4 X) 으로 formzn 형성한백혈구를검경하였다 (n=2). 이때 3반복으로측정하였다. 한편, 식균능의측정은백혈구부착커버글라스에 S. inie(1 1 7 CFU/ml) 액을.2 ml을적하시킨후습윤배양기에서 3 hrs 반응시킨다음실온에서건조시킨다음 Wright 염색을시행한후식균된세포를관찰해서탐식율을산출했다 (n=2). 이때 3 반복으로측정하였다. Formzn ssy(%)=(formzn 형성세포 / 관찰한식세포수 ) 1 식균율 (%)= (S. inie 식균된세포수 / 관찰한식세포수 ) 1 In vivo에서어체내백신및 Propolis extrcts 의처리불활화균액및 propolis 처리는 Chu et l(26) 및 Cuest et l(25) 의방법을보완하여사용하였다. 즉실험구는 4개구 (구, propolisextrcts 구, vccine단독구, vccine+propolis extrcts혼합구 ) 로구분하였으며, 각실험구당 5마리넙치를사용하였다. 어체를 MS-222(Sigm) 로충분히마취시킨후어체의내부장기에손상이가지않도록 1회용주사기를이용하여단독또는혼합한용액.2 ml 을어체복강내에주사하였다. 이때어체내투여농도는균액 (1 1 8 CFU/fish) 및 propolis extrcts (1 mg/kg) 농도가되도록조정하였다. 한편, 접종한어체를사육조에옮겨서가급적스트레스를받지않도록사육하면서백신접종 2주후에어체를희생하였다. 두신세포의분리두신세포의분리는 Secombes(199) 의방법에따랐다. 어체를 MS-222로마취시킨후에두부를절단하여서희생시켰다. 두신대식세포의식작용능을측정하기위하여넙치의복부를절개하여두신을무균적으로 1 cm의 petri dish(corning, USA) 분리하였다. 분리된두신을무균가위로세절하고멸균슬라이드로 tesing한후, nylon mesh를통과시켜세포현탁액을준비하였다. 사용한배지는 penicillin/streptomycin(sigm) 1 units/ml 및 heprin (Sigm) 1 units/ml 등을함유한 L-15배지 (Sigm) 이었다. tesing한세포현탁액을 35% 와 51% 농도의 percoll 용액이들어있는 15 ml 원심튜브 (Corning, USA) 위에조심스럽게중층시킨다음원심분리 (45 g, 3분간 ) 하여백혈구층만을조심스럽게회수한후 (ph 7.2) 로 3회세정하였다. 이때의세포의생존율은.3% trypn blue (Sigm) 로확인시 95% 이상을보였다. 분리된세포를 L-15배지를함유한 petri dish(corning, USA) 에 5 1 7 cells/ml 로조정하여 22, 5% CO 2 배양기에 3시간배양하였다. 부착되지않은세포는 로 3회세척제거하여부착세포만을식세포로이용하였다. 한편분리한세포를 penicillin/ streptomycin-1 units/ml 및 2% fetl bovine serum(fbs,
5 남현주 박경일 최민순 Gibco) 를함유한 L-15배지 (L-15 완전배지 ) 에 5 1 6 cells/ml 로조정하여필요에따라사용하였다. Hemtocrit 치측정 Hemtocrit치는 micro cpillry 방법으로측정하였다. 어체를 MS-222(Sigm) 에마취시킨다음 heprin(5, IU, Sigm) 처리한멸균플라스틱주사기로넙치의미부정맥에서채혈하였다. 채혈한혈액을시판 cpillry tube(chse Inc. USA) 에흡입하여봉인한다음 hemtocrit 측정용원심기를이용하여 (1, rpm로 5 min.) 측정하였다. hemtocrit치는전체혈액량에대한적혈구의비율을백분율 (%) 로환산하였다. 항체가측정응집항체가는 microtiter 법으로측정하였다 (Roberson 199). 즉, 백신균액접종후 2주째에어체를 MS-222로마취시킨후 1회용주사기를이용하여미부정맥에서채혈하여냉장고에 2 h 정치후원심분리 (4 g, 15min) 하여혈청을분리하였다. 96 well plte(corning, USA) 에서넙치로부터분리한혈청 5 μl를멸균생리식염수를이용하여 2 배계열희석한후, formlin 불활화항원을 5 μl씩반응시킨후, 24시간후에응집반응결과를확인하였다. 후 (ph 7.2) 로 3회원심 (5 g, 1 min) 하여균농도를 1 1 9 CFU/ml로조정후사용하였다. 식세포와표적세포를각각동량 (.5 ml) 혼합하여 3시간배양후각 well을 로 3회세정후 1%- methnol로고정한후 Wright 염색후광학현미경으로 2개의대식세포를관찰해서탐식율을산출했다. 식균율 (%)= (S. inie를탐식한대식세포 / 관찰한대식세포수 ) 1 두신대식세포의활성산소변화측정두신대식세포의활성산소변화측정은 Bulny et l.(1996) 의방법에준하여 nitroblue tetrzolium (NBT) reduction 방법으로측정하였다. 즉 96 well 에대식세포 (5 1 6 cells/ml) 및옵소닌화된 zymosn이함유된 NBT용액을동량 (1 μl) 첨가하고 22 에서 2 hrs 반응시켰다. 그후상청액을버리고 로 2회세정한다음 1% methnol로 1분간고정시켰다. 고정된세포를 7% methnol 로 2회세정한후건조하고각 well에 2 M KOH(Sigm) 용액 12 μl와 dimethyl sulphoxide(dmso, Sigm) 14 μl 를첨가하여 formzn을녹이고 63 nm에서흡광도를측정하였다. 이때 blnk 는 2 M KOH와 DMSO 의혼합용액을사용하였다. Lysozyme 측정혈청 lysozyme의활성은 Swicki nd Studnick (1987) 의방법에준하여 turbidimetric ssy로분석하였다. 즉냉동건조된 Micrococcus lysodeikticus (Sigm) 균체를.2 mg/ml (W/V) 의농도로 5 mm phosphte buffered sline(, ph 6.2) 에현탁하여기질로사용하였다. 균체가함유된기질 8 μl에측정용시료인혈청 1 μl를첨가후,.5분과 1분에 54 nm에서흡광도를각각측정하였으며, 1분당.1의흡광도감소를가져오는 lysozyme의활성값을 1 unit로표시하였다. 두신대식세포탐식능측정탐식능의표적세포는 Streptococcus. inie (S. inie) 균주를이용하였다. 즉배양기에 48시간배양 생존율조사생존율의측정은 4개처리구 (구, propolis extrcts구, vccine구및 Vccine+propolis extrcts 혼합구 ) 로구분하여각군마다 12마리의넙치를이용하였다. 즉각실험구별처리액.2 ml을넙치복강에주사후 2주째에 BHIB에서증균한대수증식기 S. inie 균액을멸균 에현탁하여균농도를 1 1 9 CFU/ml로조정하였다. 각실험구별로균액을어체복강에.1 ml씩주사한후 1일동안생존율을조사하였다. 통계학적유의성검정대조구와각실험구사이의통계학적유의성은 Student's t-test로검정하였으며, P<.5 일때유의성이있는것으로판정하였다.
Propolis extrcts 가양식넙치의면역활성능에미치는영향 51 Activtion index(%) 16 14 12 1 8 6 4 2 b 결 과 In vitro 에서 propolis extrcts 가넙치의혈액백 혈구 (PBL) 의활성능에미치는영향 In vitro 에서 propolis extrcts 농도차 (, 1, 5, 1, 15, 25 및 5 μg/ml) 에따른 PBL 의탐식능 및 NBT 환원능에미치는영향을조사하였던결과 는 Fig. 1 과같다. 즉 propolis extrcts 농도 5 15 μg/ml 범위대에서 PBL 의탐식능및 NBT 환원능이 대조구에비해서유의성있게증가를보였으며, 특 히 1 μg/ml 에서가장활성이높았다. 그렇지만 5 μg/ml 의농도에서는대조군에비해서오히려 활성이감소되었다. 따라서 in vivo 실험시 propolis extrcts 최적투여농도를 1 μg/ml 로선정하였다. In vivo 에서 propolis 가넙치의면역반응에미치 는영향 1) Hemtocrit(Ht) 치측정 hemtocrit 치의변화를조사한결과, 를처리 1 5 1 15 25 5 Phgocytosis NBT reduction In vitro Fig. 1. The effect of propolis extrct on the peripherl blood leukocyte(pbl) ctivities in cultured flounder. PBL were incubted in or with vrious concentrtions propolis extrct(, 1, 5, 1, 15, 25 nd 5 μg/ml) for 2 hrs t 22. The phgocytosis of bcteri were determined by counting 2 PBL nd expressed phgocytic index compred to control. NBT reduction ws evluted by formzn forming cells counting(n=2). Activtion index re normlized to the vlues obtined from control nd expressed s mens of triplicte redings. Sttisticl differences re indicted by letters. : P<.5, b; P<.1. b 한대조구는 3±3.5%, propolis extrcts 처리구는 29.5±1.6%, vccine 단독처리구는 31±3.7% propolis+vccine extrcts 혼합처리구는 29±3.4% 로대 조구에비해서 Ht 치가약간감소되는경향을보였 으나유의적차이를보이지않았다 (Fig. 2). Hemtocrit level(%) 2) Lysozyme 활성측정 혈청 lysozyme 의용균활성을조사한결과는 Fig. 2 와같다. 즉대조군의경우 145±11 치를보인반면 에 propolis extrcts 처리구에서는 178±13 치로유의 성있게높았다. 한편, vccine 단독군의경우는 25±14 치를보인반면에 vccine+propolis extrcts 혼합처리구의경우에서는 276±18 로유의성있게 높게나타났다 (Fig. 3). 3) 두신대식세포탐식능측정 대식세포탐식능을측정한결과를 Fig. 3 에나타 내었다. 처리군에서 33.2±1.2% 를보인반면에 propolis extrcts 처리군의경우탐식능이 42.9± 1.3% 로유의성이인정되었다. 한편, vccine 단독처 리구의경우탐식율이 47.8±2.2% 인데비해서 prop- 3 25 2 15 1 5 Propolis Fig. 2. The effect of propolis extrcts -tretment on the level of hemtocrit vlue in cultured flounder. They were divided into four groups(, Propolis extrcts, Vccine, Propoli extrctss + Vccine). Ech groups (5 fish/group) of fish were received i.p. injection of either or 1 mg/kg of propolis extrcts, nd in the presence or bsence of formlin inctivted S. inie (1 1 8 CFU/fish), respectively. Results re expressed s the mens±sd. of triplictes redings.
52 남현주 박경일 최민순 Lysozyme ctivity(u/ml) 3 b 25 2 15 1 5 propolis Fig. 3. The effect of propolis extrcts -tretment on the lysozyme ctivity. They were divided into four groups (, Propolis extrcts, Vccine, nd Vccine + Proplois extrcts) Ech groups(5 fish/group) of fish were received i.p. injection of either or 1 mg/kg of propolis extrcts, nd in the presence or bsence of formlin inctivted S. inie (1 1 8 CFU/fish), respectively. Results re expressed s the mens±sd of triplicte redings. Sttisticl differences (P<.5) re indicted s, when compred to -injected nd b, when compred to vccine treted. olis extrcts+vccine 혼합처리구에서는 57.8±2.6% 로유의성있게높았다 (Fig. 4). 4) 두신대식세포활성산소생성능측정 두신대식세포의대한반응기산소활성치를 Nitroblue tetrzolium(nbt) 환원후 OD 값을측정 한결과, 처리구의경우.24±.1 치에비하여 Propolis 처리경우에는.31±.2 치로유의성이인 정되었다. 한편, vccine 처리구의경우.36±.2 치를보인반면에 propolis extrcts +vccine 혼합처 리구에서는.44±.2 치로유의성있게높았다 (Fig. 5). 5) 응집항체가측정 응집항체가의변화를조사한결과는 Fig. 5 와같 다. 및 propolis extrcts 처리구에서는각각 2 1.2 ±.1 및 2 1.6 ±.2 로차이가인정되지않았다. 한편, vccine 단독처리구의경우응집항체가가 2 5.6 ±.5 이었으나, vccine+propolis extrcts 혼합처리구에 서는 2 7.8 ±.6 으로유의성이인정되어졌다 (Fig. 6). Phgocytic index 6 5 4 3 2 1 propolis Fig. 4. The effect of propopolis extrcts - tretment on the phgocytosis. They were divided into four groups (, Propolis extrcts, Vccine, Propolis extrcts + Vccine). Ech groups (5 fish/group) of fish were received i.p. injection of either or 1 mg/kg of propolis, nd in the presence or bsence of formlin inctivted S. inie (1 1 8 CFU/fish), respectively. Results re expressed s the mens±sd of triplicte redings. Sttisticl differences(p<.5) re indicted s, when compred to injected nd b, when compred to vccine treted. NBT reduction(od 63nm).4.3.2.1. propolis Fig. 5. The effect of propolis extrcts -tretment on the NBT reduction. They were divided into four groups (, Propolis extrcts, Vccine, Propolis extrcts+ Vccine). Ech groups (5 fish/group) of fish were received i.p. injection of either or 1 mg/kg of propolis, nd in the presence or bsence of formlin inctivted S. inie (1 1 8 CFU/fish), respectively. Results re expressed s the mens±sd of triplicte redings. Sttisticl differences (P<.5) re indicted s, when compred to injected nd b, when compred to vccine treted. 6) 어체생존율조사 넙치의연쇄구균에대한항병력에미치는영향 을조사한결과는 Fig. 6 과같다. 대조구의경우생 b b
Propolis extrcts 가양식넙치의면역활성능에미치는영향 53 Antibody titer(log 2) 8 7 6 5 4 3 2 1 propolis Fig. 6. The effect of propolis extrcts-tretment on the induction of ntibody production in cultured flounder. They were divided into four groups (, Propolis, Vccine, Propolis extrcts + Vccine). Ech groups (5 fish/group) of fish were received i.p. injection of either or 5 mg/kg of propolis extrcts, nd in the presence or bsence of formlin inctivted S. inie (1 1 8 CFU/ fish), respectively. Results re expressed s the mens± SD of triplicte redings. Sttisticl differences(p<.5) re indicted s b, when compred to vccine treted. 존율이 22% 에비해 propolis extrcts 구는 46%, vccine 단독구의경우생존율이 72% 이었으나, vccine+propolis extrcts 혼합처리구는 86% 의생존율 을보였다 (Fig. 7). Survivl rtre(%) 8 Propolis 6 4 2 Fig. 7. The effect of propolis extrcts-tretment on the survivl rte for 1 dys post chllenges. They were divided into four groups (, Propolis extrcts, Vccine, Propolis extrcts + Vccine). Ech groups (12 fish/group) of fish were received i.p. injection of either or 5 mg/fish of propolis extrcts, nd in the presence or bsence of formlin inctivted S. inie (1 1 8 CFU/fish), respectively. Results re expressed s the mens of triplicte redings. b 고찰 어체내에생리활성물질을투여하는경우에어류의면역체계중에서도세포성면역의증강을유도되어진다. 이들물질의투여에의한어체의면역증강효과는비특이적면역반응활성을통하여부수적으로특이적면역반응또한활성화시킴으로써어류의항상성을유지시키게된다 (Nikl et l., 1993; Secombes, 1996). 본실험 (in vitro) 에서 propolis extrcts농도차에따른 PBL의탐식능및 NBT 환원능을조사하였던바 propolis extrcts의 5 25 μg/ml 범위대에서 처리구에비해서활성능이유의적으로증가를보였으며, 그중 1 μg/ml 에서가장높았다 (Fig. 1). 이러한결과를근거로넙치복강내 propolis extrcts 적정처리농도는어체당 1 mg/kg 으로선정하였다. lysozyme은주로백혈구, 혈장및체표면등에넓게분포되어있는효소로서세균세포벽성분중의 peptidoglycn의 β-1,4-glycoside 결합을가수분해하여용균효과를나타내며, 보체나식세포등과협력하여살균및용균반응을강화시켜서생체방어를증강시키는데중요한역할을수행한다 (Fletcher nd White, 1976; Tkhshi et l., 1986; Kim et l., 1992; Pulsen et l, 22). 한편, in vivo상에서 propolis 처리유무 (, Propolis, Vccine, Propolis + Vccine) 에따른 lysozyme의활성치를조사하였던바 propolis 처리구는대조구에비해서 lysozyme 활성능이유의적으로증가되어졌다 (Fig. 2). 한편, lyzozyme의활성이그람양성세균보다는그람양성세균에효과적이란점으로미루어볼때 propolis extrcts가양식넙치의새균성고질병의하나인연쇄구균증의예방을위한유용하게활용되어질것으로평가되어진다. 대식세포는체내에침습한다양한미생물에대하여식작용및살균작용등을수행함으로써생체의방어작용에직접및간접적으로중요한역할을수행한다 (Sthl 1992; Secombes, 1996). 식세포에의해서탐식된외부병원체에대한주요살균작용은식세포의활성산소 (O 2 rdicl) 의작용에의해이루어진다. 즉, 외부의병원체가숙주의식세포막을자극하면 O 2 로부터형성된 O - 2 와 H 2 O 2 등과같은
54 남현주 박경일 최민순 일련의반응기산소 (rective oxygen intermedite, ROI) 가외부병원체에대하여살균작용을하는것으로알려져있다 (Secombes, 199; Shon, 1999). 본실험에서 propolis extrcts처리구는대조구에비해서식작용능이유의성있게증가되었으며, NBT 환원능또한유의성있게증가시켰다 (Fig.3, Fig. 4). 이러한결과는 propol is extrcts가대식세포를자극하여서탐식작용및 superoxide nion(o - 2 ) 의생성작용을활성화시켰기때문에결과적으로 S. inie 감염에대한 propolis 처리구의생존율을높이는것으로판단된다. 따라서 propolis extrcts 가 ROI 의활성에있어서시발점이되는강력한살균력을보여주는 superoxide nion(o - 2 ) 의활성을현저하게증가시킨다는점에서적어도양식넙치의비특이적인면역증강제로활용될가능성이높을것으로기대된다. 특이항체매개성면역반응은세포내재성병인체에의한감염성질환을방어하는숙주방어기작에중요한역할을한다 (Suzuki et l., 1997). 본실험에서 vccine+propolis extrcts혼합처리구는 vccine 단독처리구에비하여균체응집소가는유의적으로높게나타난결과 (Fig. 5) 는마우스에 proplis extrcts 를경구적으로단기간처리경우에도항체생성의증강효과를보인결과 (Sforcin et l., 25) 와 propolis extrcts를복강내로백신과혼합투여시항체가 2주째부터대조군에비하여매우증가되었다는보고 (Fn et l., 21) 들과일치되어진다. 한편, 이러한결과는 propolis extrcts가항체생성세포를직접적으로활성화를유발하기보다는면역계시발세포인대식세포를활성화에따른일련의 cytokine작용으로항체생성을증가시켰을것으로추정되나본실험만으로는명확히알수가없었다. 본실험에서 propolis extrcts가균체의감염방어력에미치는영향을평가하기위해서 S. inie를이용하여공격실험을한결과 vccine단독구에비해서 propolis extrcts+vccine혼합처리구에서생존율이유의적으로높게나타났다 (Fig. 6). 이러한결과는 propolis extrcts가선천적면역계의활성 (lysozyme, 탐식능및 NBT환원능 ) 을유도하고아울러특이항체생성및항체의존성식세포살해작 용 (ntibody dependent cell cytotoxcity, ADCC) 등의특이적면역반응을활성화시킨결과어체에감작된 S. inie균에대해서방어능력을현저하게향상시켰기때문으로사료된다. 따라서 propolis extrcts 는양식넙치뿐만아니라타어종에서문제시되는각종병인체의질병예방에도매우효과적일것으로판단되어진다. 최근균체의 formlin 불활화 vccine이개발되어서양식현장에서질병의예방에널리활용되고있다 (Nknishi nd Ototke, 1997; Ellis, 1999; Cho et l., 26; Angew nd Brnes, 27 ). 이들상용백신들의면역지속기간을연장하기위한일환으로 luminum hydroxide, minernl oil 및 lbumin 등을 djuvnt로활용하였으나어체의국소적인염증유발과같은부작용등으로사용이제한적이기때문에 djuvnt 로이용하기위한생리활성물질의탐색을위한다양한노력이시도되고있다 (Nknishi nd Ototke, 1997; Ellis, 1999). 따라서본실험에서 propolis extrcts를처리한군간의 hemtocrit치의변화율에큰영향을미치지않은결과 (Fig. 2) 는사람및마우스에 propolis extrcts 를처리시혈구, 혈색소및기타혈장성분에이상을유발시키지않았다고보고등 (Sforcin et l., 1995., Mni et l., 26) 과일치한다. 또한 propolis extrcts가화학물질의노출에의해서저하되었던혈구성분및혈장성분을정상치로회복시키는작용이있었다는보고 (Cetin et l., 21) 로미루어 propolis extrcts를처리경우는조혈장기의대한부작용이거의없는점으로미루어향후백신 djuvnt 로서도활용가능성이높을것으로추정되어진다. 이상의결과를요약해보면 propolis extrcts가양식넙치의혈청중의 lysozyme, 대식세포의식작용능및활성산소환원능등을활성화시킨결과로미루어볼때양식어류의면역증강제의유용물질로서활용가능성이높을것으로사료된다. 그렇지만어류의양식특성상다양한스트레스환경에처해질가능성이매우높기때문에따라서양식현장에서 propolis extrcts를면역증강제로활용하기위해서는면역계주요작동세포인 T 및 B림프구들의미치는영향및백신지속기간등에대한추가시험이필요하리라사료된다.
Propolis extrcts 가양식넙치의면역활성능에미치는영향 55 요 약 Propolis extrcts 는다양한성분으로구성되어있 는수지상의혼합물로서여러약리작용을보여주 기때문에민간요법으로널리이용되어왔다. 특히 propolis extrcts 는독성이거의없다는장점때문 에면역증강제재로서활용가능성이높게평가되 고있다. 이에본실험에서는대상으로 in vitro 및 in vivo 상에서 propolis extrcts 가양식넙치면역반 응에미치는영향을조사하였다. In vitro 상에서 propolis extrcts 가 PBL 의탐식능 및 NBT ssy 활성능에미치는영향을조사한바 유효농도는 5 15 μg/ml 이었으며, 가장활성이 높은농도는 1μg/ml 이었다. In vivo 상에서양식 넙치에 propolis extrcts 를단독또는 S. inie 불활 화균액과혼합하여어체에투여후에면역반응에 미치는영향을조사하였다. Hemtocrit 치는 propolis extrcts 단독및 vccine 과혼합처리할때유의 적차이를보이지않았다. 그렇지만, 혈청 lysozyme 과신장대식세포의탐식능, 활성산소환원능및항 체가는 propolis extrcts+vccine 투여구에서유의 적으로증가하였다. 이러한결과들에의하여 propolis extrcts 는양식넙치에서특이적및비특이적 면역증강작용이우수하므로향후양식어류에있 어서비특이적면역증강물질및 djuvnt 로활용 가능성이기대되어진다. 감사의글 본연구는 213 년도군산대학교수산과학연구 소지원연구비에의하여수행되어졌습니다. References Agnew W., Brnes A.C.: Streptococccus inie : An qutic pthogen of globl veterinry significnce nd chllenging cndidte for relible vccintion. Vet. Microbiol,. 122: 1-15, 27. Anderson, D.P., Moritomo, T. nd de Grooth, R.: Neutrophil, glss-dherent, nitroblue tetrzolium ssy gives erly indiction of immuniztion effectiveness in rinbow trout. Vet. Immunol. Immunopthol., 3: 419-429, 1992. Beck G.W., Kim J. H., Gomez D.K. nd Prk S.C. : Isoltion nd chrcteriztion of Streptococcus sp. from disesed flounder(prlichthys olivceus) in Jeju islnd. J. Vet Sci. 7: 53-58, 26. Bnkov, V. : Chemicl diversity of propolis the problem of stndrdiztion. J. Ethnophmcol. 1: 114-117, 25. Bnkov, V. : Recent trends nd importnt developments in propolis reserch. ECAM. 2: 29-32. 25b. Brton, B. B. nd Iwm, G. K. : Physiologicl chnges in fish from stress in quculture with emphsis on the response nd effects of corticosteroids. Ann. Rev. Fish Dis. 1: 3-26, 1991. Bulny, M. O., Quentel, C., Fournier, V., Lmour, F. nd Gouvello, R. : Effect of long-term orl dministrtion of β-glucn s n immunostimulnt or n djuvnt on some non-specific prmeters of the immune response of turbot Scophthlmus mximus. Dis. Aqut. Org., 26: 139-147, 1996. Burdock, G.A. : Review of the biologicl properties nd toxicity of bee propolis (propolis). Food Chem. Toxicol. 36: 347-363, 1998. Cetin, E., Knbur M., Silici S., Erlsl G.: Propetmphosinduced chnges in hemtologicl nd biochemicl prmeters of femle rts: Protective role of propolis. Food Chem. Toxicol. 48: 186-181, 21. Cho M. Y., Lee J. S., Lee D.C., Choi H. J., nd Kim J. W. : Immune response of olvive flounder Prlichthys olivceus ginst β-hemolytic Streptococccus inie formlin-killd cell. J. Fish. Pthol. 19: 73-82, 26. Chu W. H. : Adjuvnt effect of propolis on immuniztion by inctivted Aeromons hydrophil in crp (Crssius urtus gibelio), Fish & Shellfish Immunol. 21: 113-117. 26. Cuest A., Rodriguez A., Estebn M. A nd Meseguer J. : In vivo effects of propolis, honeybee product, on gilthed sebrem innte immune responses. Fish & Shellfish Immunol. 18: 71-8, 25. Dobrovolski, J. W., Vohor, S. B., Shrm, K., Shh, S. A., Nqvi S. A. H. nd Dndiy, P. C. : Antibcteril, ntifungl, ntimoebic, ntiinflmmtory nd ntipyretic studies on propolis bee products. J. Ethnophrmcol. 35: 77-82, 1991. Ellis, A. E. : Immunity to bcteri in fish. Fish & Shellfish Immunol., 9: 291-38, 1999. Fn Y., Hu Y., Wng D., Guo Z., Zho X., Guo L.,
56 남현주 박경일 최민순 Zho B., Zhng J., Wn Y nd Nguyen T.: Epimedium polyscchride nd propolis flvone cn synergisticlly stimulte lymphocyte prolifertion in vitro nd enhnce the immune responses to ND vccine in chickens, Int. J. Biol. Mcromol. 47: 87-92, 21. Fletcher, T. C. nd White, A. : The lysozyme of the plice pleuronecyes pltess L. Comp. Biochem. Physiol., 55: 27-21, 1996. Hvsteen, B. : Flvonoids, clss of nturl products of high phrmcologicl potency. Biochemicl Phrmcology. 32: 1141-1148, 1983. Heo, G. J., Shin K. S. nd Lee. M. H. : Diseses of quculture nimls nd prevention of drug residues. Kor. J. Food Hygiene, 7: S1-S19. 1992. Ingrm, G. A. : Substnces involved in the nturl resistnce of fish to infection review. J. Fish Biol., 16: 23-6, 1992. Iwm, G., Pickering, A. D., Sumpter, J. P. nd Schreck, C. B.: Fish stress nd helth in quculture. Cmbridge University Press, 125-156, 1997. Ji, J. nd Wu, Z : Effects of trditionl Chinese medicine on nonspecific immunity nd disese resistnce of lrge yellow croker, Pseudomoscine croce(richrdson). Aquculture 218: 1-9, 23. Kim H. J., Woo S. H., Kim J. W. nd Prk S.I. : Morphologicl chrcteristics nd pthogenesity of Streptococcus inie. J. Fish Pthol., 18: 167-178, 25. Kim, J. W., Lee C. H., nd Kim E. H. : Trnsferble R plsmid of streptococci sp. isolted from disesed olive flounder(prlichthys olivceus) in Jeju. J. Fish Pthol., 19: 267-276, 26. Kim, J. W., Prk, S. I. nd Chun, S. K. : Purifiction nd ntibcteril effect of lysozyme from flounder, Prlichthys olivceus. J. Fish Pthol., 5: 87-92, 1992. Kim, K. H., Hwng, Y. J. nd Bi, S. C. : In vitro effect of loe on the respirtory burst ctivity of olive flounder(prlichthy olivceus) leucocytes. J. Fish Pthol., 12: 1-6, 1999. Kim M. S., Seo. J. S., Prk., M. A., Cho., J. M., Hwng., J. Y., Kwon., M. G., Jung., S. H.: Antimicrobil resistnce of Edwrdsiell trd, Vibrio spp., Streptococcus spp. isolted from olive flounder Prlichthys olivceous. J. Fish. Pthol. 23: 37-45, 21. Nknishi, T. nd Ototke, M. : Antigen uptke nd immune responses fter immersion vccintion. In Fish Vccinology, (ed. Cudding, R., Lillehug, A., Midtlying, P.J. nd Brown, F.), pp. 59-68, Krger Press, 1997. Nikl, L., T. P. T. Evelyn nd L. J. Albrigt : Trils with n orlly nd immersion-dministered Bet-1,3-glucn s n immunoprophylctic ginst Aeromo ns slmonicid in juvenile chinhook slmon Oncorhynchus tshwytsch. Dis. Aqut. Org., 17: 191-196. 1993. Roberson, B. S. : Bcteril gglutintion. In techniques in fish immunology.(eds. Stolen J. S., Flecher, G. C., Anderson, D. P., Roberson, B. S. nd vn Muiswinkle W. B) pp. 137-154, Fir Hven(NJ): SOS publiction; 199. Ski, M.: Current reserch sttus of fish immunostimulnts. Aquculture 172: 63-92, 1999. Secombes, C. J. : Isoltion of slmonid mcrophges nd nlysis of their killing ctivity. In Techniques in fish immunology. (eds. Stolen J.S, Flecher G.C., nderson D.P., Roberson B.S. nd vn Muiswinkle W.B), pp. 137-154. Fir Hven (NJ): SOS publiction, 199, Secombes, C. J.: The nonspecific immune system: Cellulr defences In: The fish immune system: Orgnism, pthogens, environment (eds. Iwm, G. nd Nknish, T.): pp.63-13, Acdemic Press, USA. 1996. Sforcin, J. M., Oris, R. O. nd Bnkov, V. : Effect of propolis, some isolted compounds nd its source plnt on ntibody production. J. Enthnophrmcol. 98: 31-35, 25. Shon, Y. C. : Effects of medicl herb stuff extrcts nd mitogens on the ctivtion of kidney mcrophge in nile tilpi, Oreochromis niloticus. Mster Thesis, Pukyung Ntionl University, Kore, p63, 1999. Siwicki, A nd Studnick, M., : The phgocytic bility of neutrophils nd serum lysozyme ctivity in experimentlly infected crp, Cyprinus crpio L. J. Fish Biol., 31(Suppl A): 57-6, 1987. Sthl, P. D. : The mnnose receptor nd other mcrophges lectins. Cur. Opin. Immunol., 4: 49-52, 1992. Suzuki, Y., Otk, T., Sto, S., Hou, Y. nd Aid, K. : Reproduction relted immunoglobulin chnges in rinbow trout. Fish. Physiol. Biochem., 17 : 415-421, 1997. Tkhshi, Y., Itmi, T. nd Konegw, K. : Enzymtic properties of prtilly lysozyme from the skin mucus of crp. Bull. Jp. Soc. Sci. Fish., 52: 129-1214, 1986. Mnuscript Received : Februry 11, 214 Revised : Mrch 31, 214 Accepted : April 9, 214