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Journal of Bacteriology and Virology 2011. Vol. 41, No. 1 p.37 45 DOI 10.4167/jbv.2011.41.1.37 Original Article Genospecies Classification of Acinetobacter calcoaceticus- Acinetobacter baumannii Complex by Restriction Fragment Length Polymorphism Hyo Sun Lim, Hyo Jung Hong, Hyun Jung Jo, Do Hee Kim and Kyung Soo Chang * Department of Clinical Laboratory Science, Catholic University of Pusan, Busan, Korea Acinetobacter calcoaceticus-acinetobacter baumannii (A. calcoaceticus-a. baumannii) complex, which includes A. calcoaceticus (genospecies 1), A. baumannii (genospecies 2), Acinetobacter genospecies 3 and 13, has been identified as A. baumannii by automated bacteria identification system. The purpose of this study is to develop rapid genospecies classification of A. calcoaceticus-a. baumannii complex by molecular techniques. Random amplified polymorphic DNA (RAPD) and restriction fragment length polymorphism (RFLP) were determined for 4 reference strains and 80 isolates of A. calcoaceticus-a. baumannii complex from clinical sources. Four and eleven RAPD patterns were observed among the reference strains and the isolates, respectively. RAPD might be useful for genomic typing but not for genospecies classification of Acinetobacter spp. RFLP of 16S-23S rrna intergenic spacer gene with three selected restriction enzymes (ApaLI, SwaI, and SalI) showed only four RFLP patterns in the reference and the isolates. Of 80 isolates, 10 of A. calcoaceticus (12.5%), 50 of A. baumannii (62.5%), 11 of A. genospecies 3 (13.75%), and 9 of A. genospecies 13 (11.25%) were classified by RFLP. This result suggests that RFLP of 16S-23S rrna intergenic spacer gene of A. calcoaceticus-a. baumannii complex might be useful for genospecies classification. Key Words: Genospecies classification, A. calcoaceticus-acinetobacter baumannii complex, RAPD, RFLP, 16S-23S rrna intergenic spacer gene 서론 Acinetobacter 균종은그람음성짧은막대균으로운동성이없으며 oxidase 음성, catalase 양성이고, 포도당을발효하지않고 nitrate를환원하지않는다. 흔히토양이나물등의자연환경에널리존재하며특히건조한침대시트, 베개및호흡기구, 혈관내삽관튜브등의병원환경에오랫동안서식하다가면역력이약한환자에게서결막염, 피부염, 폐렴, 뇌수막염, 패혈증, 심내막염, 복강내감염, Received: January 30, 2011/ Revised: February 15, 2011 Accepted: February 18, 2011 * Corresponding author: Kyung Soo Chang. Department of Clinical Laboratory Science, Catholic University of Pusan, Busan 609-757, Korea. Phone: +82-51-510-0565, Fax: +82-51-510-0568 e-mail: kschang@cup.ac.kr ** This research was supported by the research fund of the Catholic University of Pusan. 수술부위감염, 요로감염등의합병증을일으킨다 (1~4). 과거에 Acinetobacter는전쟁과같은상황에서상처를입은환자들에게서가장흔히분리되었다 (5). 그러나최근에는원내감염을일으키는균으로알려져있고특히중환자실에서 Acinetobacter에의한폐렴감염이많이보고되고있다. 이중 Acinetobacter baumannii (A. baumannii) 는주로인공호흡기를부착한환자에서폐렴을, 화상환자에서상처감염을일으킨다 (6). 더욱이일반적으로사용하는여러항생제에내성을나타내는다약제내성을띄며습한환경보다는건조한환경에서도오래생존하여병원감염의역학에중요한역할을한다 (7). 과거에는 Acinetobacter에감염되어도쉽게치료가가능하고원내감염발병율도높지않아문제가되지않았으나현재항생제내성을나타내는 A. baumannii의분리가점점늘고있고원내감염의상당부분을차지하고있어병원내환자들을위협하고있다 (8, 9). 특히최근몇년사 37

38 HS Lim, et al. 이에다약제내성을띄는 A. baumannii 의급격한증가는원내감염은물론전세계적으로많은영향을미치고있어이에대한신속한분리, 동정및치료가요망되고있다 (2, 5). 이와같이 Acinetobacter는원내감염을일으키는주요원인균종으로해마다분리빈도가증가하는추세를보이고있지만현재까지 31개의 genomic species 중 17종에만균종명이부여될정도로정보가부족한상황이다. 그리하여유전학적분류가아닌표현형또는생화학적특징만으로는정확한감별이어려운상태이다 (3, 4). 특히 Acinetobacter calcoaceticus-acinetobacter baumannii (A. calcoaceticus-a. baumannii) complex는 A. baumannii (genospecies 2형 ), A. calcoaceticus (genospecies 1형 ), A. genospecies 3형, A. genospecies 13형이혼합되어있어서 API kit나자동미생물동정기로분류시모두 A. baumanii로판명이되어 Acinetobeter 속균에대한정확한동정이이루어지지않고있다 (2, 10~12). 많은연구자들은유전형검사법으로분류및동정법들을개발하기위해노력하고있으나아직병원에서실용화할만큼유용하지않기때문에신속정확한동정법의개발이필요하다 (13). 또한 Acinetobacter 균종은장내세균과표현형이매우비슷하여구별동정시장내세균으로오인될수있으므로더욱더정확한유전학적분류가필요하다. 지금까지몇연구자들은 restriction fragment length polymorphism (RFLP) 법 (2, 13) 를이용하여 Acinetobacter genospecies를분류하였으나, A. calcoaceticus-a. baumannii complex에속하고생화학적감별이어려운네균주에대한 genospecies 분류를수행한바가없다. 또한 randomly amplified polymorphic DNA (RAPD) 법 (7, 14) 은유전형분류에이용하여왔고, RAPD법으로표준 Acinetobacter genospecies의유전형감별은가능하였으나, 임상분리주의 genospecies 분류에적용하지않았다. 따라서, 본연구는 A. calcoaceticus-a. baumannii complex 인 A. calcoaceticus (genospecies 1형 ), A. baumannii (genospecies 2형 ), A. genospecies 3형, A. genospecies 13형을분자생물학적기법을이용하여신속정확히 genospecies 분류를수행하고, 임상에서생화학적검사상 A. baumannii로동정되는 A. calcoaceticus-a. baumannii complex 분리주의정확한 genospecies 분류를통해어떠한 genospecies들이임상에서질병과연관성이있으며, 앞으로 A. calcoaceticus- A. baumannii complex의 genospecies별다약제내성및병원성연구의기초자료를제공하고자하였다. 특히기존의 16S-23S rrna intergenic spacer 유전자를이용한 restriction fragment length polymorphism (RFLP) 법을수정하여더신속하고분명하게 A. calcoaceticus-a. baumannii complex의 genospecies 분류가가능하였다. 생화학적성상검사에서 A. baumannii로동정된 A. calcoaceticus-a. baumannii complex 중에서 A. baumannii의분리율은 62.5% 로나타났다. 또한 RAPD에의한임상분리주의 genospecies 분류가가능한지를 RFLP 결과가비교한바, 유의성은없었다. 재료및방법균주및배양 2009년 4월에서 8월까지부산의종합병원에서입원및외래진료환자로부터채취한가검물로부터세균을분리하였으며, 분리된세균은자동미생물동정기 (biomeriux, France) 를이용하여동정하였으며, 그중 A. baumannii로동정된 80균주를대상으로실험하였다. 표준균주로는 A. baumanii (ATCC 19606), A. calcoaceticus (ATCC 23055), A. genospecies 3 (ATCC 17803), A. genospecies 13 (ATCC 19004) 로미국 American Type Culture Collection (ATCC) 에서분양받았다. 균주들은 blood agar plate (BAP) 와 MacConkey agar (MAC) 에각각접종한후 37 에서 24 시간배양하거나, 순수집락을 brain heart infusion (BHI) broth에배양하면서사용하였다. Plasmid DNA extraction Plasmid DNA는 boiling법을사용하여추출하였다 (11). Boiling법은 E-tube에 3차증류수 100 μl를넣은후 1~2개의 colony를백금이로따서풀어준다음끓는물에서 5 분간중탕하였다. 이후얼음에 2분간방치하고 12,000 rpm으로 5분간원심후상층액을새로운 E-tube에옮겼다. 추출된 DNA는 V-530 UV/VIS spectrophotometer (Jasco, Japan) 로농도를측정한후 RAPD를위한 template DNA 및 16S-23S rrna intergenic spacer 유전자를증폭하기위한 template DNA로이용하였다. Random amplified polymorphic DNA (RAPD) 를이용한 genotyping RAPD 분석은 Koeleman 등 (7) 의방법을응용하여수행하였고분석을위해 6개의 RAPD primer를이용하였다 (Table 1). RAPD 분석을위한 PCR 반응혼합액은

Genospecies Classification of A. calcoaceticus-a. baumannii Complex by RFLP 39 Table 1. Sequences of the six primers for RAPD analysis RAPD primers DNA sequences (5' to 3') RAPD1 GGTGCGGGAA RAPD2 GTTTCGCTCC RAPD3 GTAGACCCGT RAPD4 AAGAGCCCGT RAPD5 AACGCGCAAC RAPD6 CCCGTCAGCA AccuPower PCR premix (Bioneer, Daejeon, Korea) 에 template DNA (50 ng/μl) 와각각의 RAPD 용 primer 1~6 (25 pm) 를각각 1 μl 넣고증류수로전체용량이 20 μl 되게첨가하였다. PCR 반응조건은 95, 5분간초기반응한후, 94 에서 60초, 36 에서 60초, 72 에서 120초로실시하며 45회반복하였다. 증폭된 DNA는 0.5 TBE buffer로만든 2% agarose gel을사용하여 0.5 TBE buffer 하에서 135 V로 70분간전기영동을실시한후 ethidium bromide (10 μg/ml) 로 10분간염색후 UV하에서관찰하였다. 전기영동상증폭된분절은유전자이미지분석장치인 Kodak imaging system과 software (Kodak, NY, USA) 를이용하여촬영과분석을실시하였다. 균주로는 A. calcoaceticus-a. baumannii complex 표준균주와 80개의임상분리주를모두사용하였다. A. baumannii에서 16S-23S rrna intergenic spacer 유전자증폭먼저 RFLP 방법을위해선택된 16S-23S rrna intergenic spacer 유전자를 PCR로증폭하였다. 이들유전자증폭용 primer는 Dolzani 등 (2) 이이용한 primer를사용하였다 (Table 2). A. baumannii 균종의 16S-23S rrna intergenic spacer 유전자를증폭하기위한 PCR 반응혼합액은 AccuPower PCR premix (Bioneer) 에 A. calcoaceticus- A. baumannii complex 표준균주와임상분리주로부터추출된 DNA template (50 ng/μl) 와 forward와 reverse spacer primer (25 pm/μl) 를각각 1 μl씩넣고증류수로전체용량이 20 μl되게첨가하였다. PCR 반응조건은 94 에서 5분간초기반응한후, 94 에서 1분, 50 에서 1분 30초, 72 에서 2분으로 30회반복하였고 72 에서 10분간연장반응을하였다. 증폭된 DNA는 1.2% agarose gel에서 100 V로 25분간전기영동하여확인하였으며, 증폭된 DNA Table 2. Sequences of primers to amplify 16S-23S rrna intergenic spacer gene for RFLP assay Primer names DNA sequences (5' to 3') Size Spacer-1 TTG TAC ACA CCG CCC GTC A 989 bp Spacer-2 GGT ACT TAG ATG TTT CAG TTC 의크기는 1 kb에서확인할수있다. A. baumannii에서만 16S-23S rrna intergenic spacer 유전자가증폭되는지는알아보기위하여, 그람양성균인 Staphylococcus aureus, Streptococcus pyogenes, Enterococcus faecalis, 그람음성균인 E. coli 0157, Salmonella typhimurium, Shigella dysenteriae 균으로부터 DNA를분리하여, 위와동일한조건으로 PCR을실시하였다 Restriction fragment length polymorphism (RFLP) 증폭된 16S-23S rrna intergenic spacer 유전자를확인하기위하여 DNA 염기서열분석을실시하였다. 증폭된 DNA는 agarose gel로부터절단하여 gel purification kit (Bioneer) 를사용하여분리정제하고염기서열분석을실시하였다. 염기서열분석은 dye terminator cycle sequencing법을이용하였으며 ABI prism 310 genetic analyzer에 loading 한후염기서열결과를수집하였다. A. calcoaceticus-a. baumannii complex 표준균주인 genospecies 1, 2, 3, 13형의 sequencing 결과를확인한후 RFLP 분석을위해제한효소분석프로그램인 NEB cutter 프로그램을이용하여 genospecies를감별할수있는제한효소를선택하였다. 선택된제한효소는 ApaLI, SwaI과 SalI이며, genospecies 1형의경우 ApaLI, genospecies 2형은 SwaI, genospecies 13형은 SalI에의해두가닥으로절단되었으며, genospecies 3형은세가지제한효소에의해절단되지않음이확인되어, 선택된제한효소에의해 genospecies 1, 2, 3, 13형을정확하게분류할수있었다. 따라서표준균주및 80개의임상균주의 DNA로부터증폭된 16S-23S rrna intergenic spacer 유전자를세가지제한효소로처리하였다. 제한효소처리는 E-tube에 PCR product 2 μl, 제한효소 0.5 μl, 10 buffer 2 μl, 100 BSA 0.2 μl (option) 로첨가한후, 3차증류수를 20 μl까지넣어 37 항온조에서 4시간반응하였다. RFLP pattern은 1.5% agarose gel에 100 V에서 25분간전기영동을실시한후 ethidium bromide (10 μg/ml) 로 10분간염색후 UV하에서관찰하였다. 전기영동상증폭된분절은유전자이미지분석장치인 Kodak imaging system과

40 HS Lim, et al. Figure 1. RAPD patterns of reference A. calcoaceticus-a. baumannii complex strains by PCR using the six RAPD primers. (A) RAPD patterns using RAPD primer 1, (B) RAPD patterns using RAPD primer 2, (C) RAPD patterns using RAPD primer 3, (D) RAPD patterns using RAPD primer 4, (E) RAPD patterns using RAPD primer 5, (F) using RAPD patterns using RAPD primer 6. M: marker, 2: A. baumannii (genospecies type 2), 1: A. calcoaceticus (genospecies type 1), 3: A. genospecies type 3, 13: A. genospecies type 13. software (Kodak) 를이용하여촬영과분석을실시하였다. 결과 RAPD를이용한 A. calcoaceticus-a. baumannii complex 표준균주와임상균주동정 RAPD를이용하여 A. calcoaceticus-a. baumannii complex 를감별할수있는지알아보기위해 A. calcoaceticus-a. baumannii complex 표준균주인 genospecies 1, 2, 3, 13로부터 DNA를분리하여 6개의 RAPD 용 primer set로 PCR을수행하였다. 네개의 A. calcoaceticus-a. baumannii complex 표준균주들은각각의 RAPD 용 primer에의해특이적으로감별될수있는 RAPD pattern을나타내었다 (Fig. 1). RAPD primer 1의경우표준균주들의분절개수가가장적고선명하게나와 genospecies 감별에용이하였다. 증폭이잘된선명한분절만으로 pattern을보면, A. baumannii는 2개의큰 band와 1개의작은분절이관찰되었으며, A. calcoaceticus는각각 1개의크고작은분절이, A. genospecies 3은 1개의큰분절과 3개의작은분절이관찰되었으며, A. genospecies 13은 2개의작은분절이특징이었다. 네표준균주모두 390 bp 크기의분절이공통으로관찰되었으며, A. genospecies 1, 2, 13형에서서로유사하면서도감별이용이한분절이많이관찰되었다. RAPD primer 2 역시분절개수가많지않아변별력이높은편이지만, A. genospecies 2형과 13형이서로유사한 band로각 genospecies의특이적인감별점이없어 primer 1 보다는 pattern 분석이적절하지않음을보여주었다. RAPD primer 3, 4, 5, 6은 A. genospecies 3형과 13형의 RAPD pattern이비슷하고분절 pattern이복잡하였다. 따라서이와같은결과로미루어보았을때분절수도많지않고어느정도분절간의간격이유지되며확연한분절이검출된 RAPD primer 1이가장 A. genospecies 감별에용이

Genospecies Classification of A. calcoaceticus-a. baumannii Complex by RFLP 41 Figure 2. RAPD patterns of representative clinical A. calcoaceticus-a. baumannii complex isolates by PCR using the six RAPD primers. (A) RAPD patterns using RAPD primer 1, (B) RAPD patterns using RAPD primer 2, (C) RAPD patterns using RAPD primer 3, (D) RAPD patterns using RAPD primer 4, (E) RAPD patterns using RAPD primer 5, (F) using RAPD patterns using RAPD primer 6. M: marker, 2-2d: A. baumannii (genospecies 2) subtype 2, subtype 2a, subtype 2b, subtype 2c, subtype 2d, respectively, 1: A. calcoaceticus (genospecies 1) subtype 1, 3-3a: A. genospecies 3 subtype 3, subtype 3a, respectively, 13-13b: A. genospecies 13 subtype 13, subtype 13a, subtype 13b, respectively. 하였다. 즉, RAPD primer 1을사용한경우감별분절로는 A. baumannii는 1.1 kb의분절, A. genospecies 3형은 680 bp 와 450 bp의분절에, A. genospecies 13형은 290 bp의분절이특징이며, 네표준균주는 390 bp의공통분절및 A. genospecies 1, 2, 3형은 1.3 kb의공통분절을특징으로하였다. RAPD primer 1을사용하여 80개의임상균주의 genospecies를분류한바, 각분절에따라 genospecies 1형, 2형, 3형, 13형으로분류하였으며, 비슷하지만약간다른경우를각각의 subtype으로나누었다. Subtype으로분류한결과 A. baumannii인 genospecies 2형은 2, 2a, 2b, 2c, 2d형으로, A. calcoaceticus인 genospecies 1형은 subtype이없었고, genospecies 3형은 3, 3a형으로 genospecies 13형은 13, 13a, 13b형으로분류되어 11개의 subtype들이검출되었다. 검출된 11개의 subtype에해당되는대표균주를이용하여 RAPD primer 1부터 6까지 RAPD pattern을분석한바, Fig. 2와같은결과를얻었다. 각각의 subtype들은모두 RAPD primer별로특이하고감별된 pattern을나타내었지만, 이를이용한 A. genospecies 분류는쉽지가않았으며실험실진단으로사용하기는적합하지가않았다. A. baumannii에서 16S-23S rrna intergenic spacer 유전자의특이성 Acinetobacter genospecies를감별하기위한다른분자생

42 HS Lim, et al. Figure 3. DNA fragments obtained by amplification of the 16S-23S rrna intergenic spacer gene of A. baumannii and other bacteria. M: marker, 1: A. baumannii (genospecies type 2) 2: Staphylococcus aureus, 3: Streptococcus pyogenes, 4: Enteroccus faecalis, 5: Escherichia coli 0157, 6: Salmomella typhimurium, 7: Shigella dysenteriae. 물학적방법으로 RFLP를실시하였다. 먼저 RFLP에이용한유전자인 16S-23S rrna intergenic spacer 유전자가 A. calcoaceticus-a. baumannii complex에특이적으로증폭되는지를알아보기위해, A. baumannii는물론다른균종인 Staphylococcus aureus, Streptococcus pyogenes, Enterococcus faecalis, E. coli 0157, Salmonella typhimurium, Shigella dysenteriae의 16S-23S rrna intergenic spacer 유전자를증폭하여확인하였다. A. baumannii를비롯한 A. genospecies에서 989 bp 크기의 band가증폭되었지만, S. aureus는어떠한 band도관찰되지않았으며, 다른세균들은모두 band가관찰되었으나크기가작았으며, 몇몇균종은 600~700 bp 사이에서 multiband가관찰되어약 1 kb 크기의 band가 A. calcoaceticus-a. baumannii complex에서만증폭됨이확인되었다 (Fig. 3). RFLP 기법을이용한 A. calcoaceticus-a. baumannii complex 표준균주와임상균주의유전형분석 A. calcoaceticus-a. baumannii complex 표준균주의 16S- 23S rrna intergenic spacer 유전자를증폭한후, DNA 염기서열분석및제한효소절단분석을통하여얻어진제한효소 ApaLI, SwaI과 SalI을사용하여 RFLP를실시하였다. 그결과, A. baumannii인 A. genospecies 2형은 989 bp 크기의 16S-23S rrna intergenic spacer 유전자가 ApaLI 처리에의해 701 bp와 288 bp로절단되었으며, A. calcoaceticus인 A. genospecies 1형은 SwaI 처리시 525 bp와 464 bp로절단되었으며, A. genospecies 13형은 SalI 처리시 764 bp와 225 bp로절단되었다 (Fig. 4). 이런결과를바탕으로임상에서분리된 A. calcoaceticus-a. baumannii complex 80주를대상으로세개의제한효소를이용하여 RFLP를실시한 Figure 4. RFLP patterns of the 16S-23S rrna intergenic spacer gene of reference A. calcoaceticus-a. baumannii complex strains treated with selected restriction enzymes. (A) not treated with restriction enzyme, (B) treated with ApaLI, (C) treated with SwaI, (D) treated with SalI. M: marker, 2: A. baumannii (genospecies type 2), 1: A. calcoaceticus (genospecies type 1), 3: A. genospecies type 3, 13: A. genospecies type 13. Table 3. Genospecies classification of eighty clinical A. calcoaceticus-a. baumannii complex isolates by RFLP A. genospecies No. of population Isolation frequency (%) A. calcoaceticus 10 12.5 A. baumannii 50 62.5 A. genospecies 3 11 13.75 A. genospecies 13 9 11.25 바, 표준균주와동일한 RFLP pattern을나타내어 genospecies 분류가가능하였다. 따라서자동미생물동정기로는 A. baumannii로동정되었던 A. calcoaceticus-a. baumannii complex 분리주 80주를분류한바, A. baumannii가 62.5% 로가장높은분리율을나타내었으며, 그다음으로는 A. genospecies 3가 13.75%, A. calcoaceticus가 12.5%, A. genospecies 13이 11.25% 로순으로분류되었으며 A. baumannii 를제외한세종류의 genospecies의분리율은큰차이를나타내지않았다 (Table 3). 또한, RAPD 기법으로분류되었던 11종류의 subtype의대표균주를 RFLP pattern으로 A. genospecies를분류한바, RAPD subtype 2, 2a, 2b, 2c, 2d과 3a번은 A. baumannii로분류되었으며, RAPD subtype 1과 13번은 A. genospecies 13, RAPD subtype 3, 13a과 13b번은 A. genospecies 3으로동정되었다 (Fig. 5). 따라서이와같은결과는 16S-23S

Genospecies Classification of A. calcoaceticus-a. baumannii Complex by RFLP 43 Figure 5. RFLP patterns of the 16S-23S rrna intergenic spacer gene of representative clinical A. calcoaceticus-a. baumannii complex isolates with selected restriction enzymes. (A) not treated with restriction enzyme, (B) treated with ApaLI, (C) treated with SwaI, (D) treated with SalI. M: marker, 2-2d: A. baumannii (genospecies 2) subtype 2, subtype 2a, subtype 2b, subtype 2c, subtype 2d, respectively, 1: A. calcoaceticus (genospecies 1) subtype 1, 3-3a: A. genospecies 3 subtype 3, subtype 3a, respectively, 13-13b: A. genospecies 13 subtype 13, subtype 13a, subtype 13b, respectively. rrna intergenic spacer 유전자를이용한 RFLP법은 RAPD 보다도 Acinetobacter 균종의 genospecies 분류에정확하고간편하며임상에서유용하게이용될수있을것으로사료된다. 고찰 Acinetobacter 균종은 genospecies 1형과 3형이비슷하고 genospecies 2형과 13형이비슷하여생화학적으로감별하는데한계가있다. 또한자동미생물동정기인 Vitek을이용시 A. calcoaceticus-a. baumannii complex 가 A. baumannii 로만동정되므로정확하게균종을감별할수없다 (15). Chang 등 (11) 은자동미생물동정기와 16S-23S rrna gene 의 spacer 영역의염기서열분석을통해, 자동미생물동정기의 A. genospecies 분류의정확성을비교하였다. 자동미생물동정기를사용한결과는 79개의실험균주중 18주 의 A. calcoaceticus와 61주의 A. baumannii로분리되었으나, 분자생물학적방법을이용한 genotype 분석에서는 46주의 A. baumannii, 19주의 A. genospecies 3, 11주의 A. genospecies 13로 79개중 76개의균주가동정되어동정분리율이 96.2% 이었으며, 자동미생물동정기를이용한 phenotype 동정분류법과 DNA 염기서열을이용한 genotype 분류법과는차이가있음이확인되었으며, 균종간생화학적성상에의한감별의어려움이확인되었다. 현재까지많은연구자는자동미생물동정기의한계성을알고다양한분자생물학적기법을통하여 A. genospecies 를분류하고자하였다 (6). A. genospecies를분류하기위한 typing system으로는 biotyping, antibiograms, serotyping, phage typing, bacteriocin typing, protein profiles, multilocus enzyme electrophoretic typing, plasmid profiles, pulse-field gel electrophoresis, ribotyping, PCR fingerprint같은방법들이있다 (6, 16). 최근 amplified ribosomal DNA restriction analysis (ARDRA), random amplified polymorphic DNA analysis (RAPD), amplified fragment length polymorphism (AFLP) 등의방법을 genospecies 분류에적용하였으나 (7), 실험이어렵고해석에전문성이필요하여신속한분류에한계가있다. 최근까지여러세균들의역학조사에이용되고있는 RAPD 분석방법은사용되는시약과 DNA 추출방법및 PCR 증폭조건등에서높은재현성을갖는다고보고되고있다 (7). 그러나 Acinetobacter 균종에서는정확하게보고되지않았고또한증폭되는분절이매우많고조밀하여확실하게구별이어려우며특히너무나많은 subtype이발견되어균을신속동정하는데는한계가있을것으로사료된다. RAPD법은 A. genospecies의분류보다는 genomic typing에응용되고있으나, 임상분리주들은너무나다양한 pattern을나타나며, 실험시표준균주들과비교해야하는복잡성때문에병원의임상검사실에서는적용하기어려울것으로생각된다. 본연구에서도 RAPD를이용한표준균주의 A. genospecies 분류는명확하였으나, 임상분리주에서는많은 subtype들이관찰되어신속감별에는적합하지않았다. 반면, 16S-23S rrna intergenic spacer 유전자를이용한 PCR-RFLP법은간편하고판독이용이하여 RAPD보다정확하고빠르게임상에적용될수있을것으로사료된다. 특히 16S-23S rrna intergenic spacer 유전자의 DNA 염기서열을이용한 genotyping법은매우유용하게사용되어왔다 (2, 4, 11). 본연구에서도임상가검물에서분리동정된 A. calcoaceticus-a. baumannii complex 80주를대상으로 16S-23S rrna intergenic spacer 유전자의 DNA 염기서

44 HS Lim, et al. 열을분석한바, RFLP 결과와일치하였다. 따라서염기서열을분석하지않고도임상에서간편하고정확한 A. genospecies의분류가가능할것으로판단된다. 특히, 본연구는 A. baumannii가가장많이동정되었으나, 다른 A. genospecies 3, A. calcoaceticus, A. genospecies 13도 13.75%, 12.5%, 11.25% 로순으로분류되어총 37.5% 로 Chang 등 (11) 이 16S-23S rrna intergenic spacer 유전자의염기서열을이용한분류와유사하였다. 하지만국내에서 Lee 등 (13) 이 rrna intergenic spacer length polymorphism (trna- ILP) 를통해보고한 83주의 Acinetobacter 균속중 80주의 A. baumannii가분리되어 97.6% 의분리율을나타내었다는국내의분리율과는다소차이를나타내었다. 이는 A. baumannii로판명된분리주들이 A. calcoaceticus-a. baumannii complex 형태로다른 A. genospecies와혼제되어있을가능성이있다고생각된다. 현재병원에서는실제분리되는빈도에비해 Acinetobacter 균종에대한정보가부족한상황이며특히, A. calcoaceticus-a. baumannii complex로임상검체에서분리동정된 A. genospecies의역학적유행패턴은보고되고있지않다. 따라서앞으로본연구결과를토대로지속적인역학조사및 A. genospecies 분석을통해다약제내성 Acinetobacter 균속의유행균주감시및통제체계를구출할있는자료로활용되리라기대한다. 참고문헌 1) Soddell JA, Beacham AM, Seviour RJ. Phenotypic identification of non-clinical isolates of Acinetobacter species. J Appl Bacteriol 1993;74:210-4. 2) Dolzani L, Tonin E, Lagatolla C, Prandin L, Monti-Bragadin C. Identification of Acinetobacter isolates in the A. calcoaceticus- A. baumannii complex by restriction analysis of the 16S-23S rrna intergenic-spacer sequences. J Clin Microbiol 1995;33: 1108-13. 3) Bartual SG, Seifert H, Hippler C, Luzon MA, Wisplinghoff H, Rodríguez-Valera F. Deveplopment of a multilocus sequence typing scheme for characterization of clinical isolates of Acinetoacter baumannii. J Clin Microbiol 2005;43:4382-90. 4) Vaneechoutte M, Dijkshoorn L, Tjernberg I, Elaichouni A, de Vos P, Claeys G, et al. Identification of Acinetobacter genomic species by amplified ribosomal DNA restriction analysis. J Clin Microbiol 1995;33:11-5. 5) Ecker JA, Massire C, Hall TA, Ranken R, Pennella TT, Agasino Ivy C, et al. Identification of Acinetobacter species and genotyping of Acinetobacter baumannii by multilocus PCR and mass spectrometry. J Clin Microbiol 2006;44:2921-32. 6) Bergogne-Bérézin E, Towner KJ. Acinetobacter spp. as nosocomial pathogens: microbiolgical, clinical, and epidemiological features. Clin Microbiol Rev 1996;9:148-65. 7) Koeleman JG, Stoof J, Biesmans DJ, Savelkoul PH, Vandenbroucke-Grauls CM. Comparison of amplified rimosomal DNA restriction analysis, random amplified polymorphic DNA analysis, and amplified fragment length polymorphism fingerprinting for identification of Acinetobacter genomic species and typing of Acinetobacter baumannii. J Clin Microbiol 1998;36:2522-9. 8) Lee HK, Kim HJ, Kim YC, Cho SR, Lee WG. Clinical and molecular epidemiologic analysis of a nosocomial outbreak of Acinetobacter baumannii in a neonatal intensive care unit. J Korean Pediatr Soc 2000;43:43-8. 9) Dueñas Díez AI, Bratos Pérez MA, Eiros Bouza JM, Almaraz Gómez A, Gutiórrez Rodríguez P, Miguel Gómez MA, et al. Susceptibility of the Acinetobacter calcoaceticus-a. baumannii complex to imipenem, meropenem, sulbactam and colistin. Int J Antimicrob Agents 2004;23:487-93. 10) Dijkshoorn L, Aucken H, Gerner-smidt P, Janssen P, Kaufmann ME, Garaizar J, et al. Comparison of outbreak and nonoutbreak Acinetobacter baumannii strains by genotype and phenotypic methods. J Clin Microbiol 1996;34:1519-25. 11) Chang HC, Wei YF, Dijkshoorn L, Vaneechoutte M, Tang CT, Chang TC. Species-level identification of isolates of the Acinetobacter calcoaceticus-acinetobacter baumannii complex by sequence analysis of the 16S-23S rrna gene spacer region. J Clin Microbiol 2005;43:1632-9. 12) Bernards AT, Dijkshoorn L, van der Toorn J, Bochner BR, van Boven CP. Phenotypic characterisation of Acinetobacter strains of 13 DNA-DNA hybridization groups by means of the Biolog system. J Med Microbiol 1995;42:113-9. 13) Lee SH, Lee MK, Park AJ, Choi ES. Identification of Acinetobacter genospecies by analysis of rrna spacer regions. Korean J Clin Pathol 2000;20:48-55. 14) Graser Y, Klare I, Halle E, Gantenberg R, Buchholz P, Jacobi HD, et al. Epidemiological study of an Acinetobacter baumannii outbreak by using polymerase chain reaction fingerprinting. J Clin Microbiol 1993;31:2417-20.

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