(19) 대한민국특허청 (KR) (12) 등록특허공보 (B1) (51) 국제특허분류 (Int. Cl.) C12Q 1/00 (2006.01) C12N 1/14 (2006.01) C12Q 1/24 (2006.01) C12Q 1/68 (2006.01) G01N 33/569 (2006.01) (52) CPC 특허분류 C12Q 1/00 (2013.01) C12N 1/14 (2013.01) (21) 출원번호 10-2015-0025066( 분할 ) (22) 출원일자 2015 년 02 월 23 일 심사청구일자 2015 년 02 월 23 일 (65) 공개번호 10-2015-0035864 (43) 공개일자 2015 년 04 월 07 일 (62) 원출원특허 10-2013-0018689 원출원일자 심사청구일자 (56) 선행기술조사문헌 KR101035898 B1* 2013 년 02 월 21 일 2013 년 02 월 21 일 표고버섯에서진균바이러스의수직감염, 곽서영, 경상대학교대학원미생물학과졸업논문 (2010)* FUNGAL BIOLOGY, vol.115, pp. 852-861(2011).).* * 는심사관에의하여인용된문헌 (45) 공고일자 2016년09월07일 (11) 등록번호 10-1653791 (24) 등록일자 2016년08월29일 (73) 특허권자 전북대학교산학협력단 전라북도전주시덕진구백제대로 567 ( 덕진동 1 가 ) (72) 발명자 김대혁 전라북도전주시덕진구안덕원로 251 한신휴플러스아파트 108 동 1505 호 양문식 전라북도전주시덕진구솔내로 120 현대 4 차아파트 402 동 504 호 김정미 전라북도전주시완산구신촌 3 길 1 우성중산타운 104 동 1201 호 (74) 대리인 최규환 전체청구항수 : 총 1 항심사관 : 김정태 (54) 발명의명칭마이코바이러스에감염된진균류의마이코바이러스제거방법 (57) 요약 본발명은마이코바이러스에감염된진균류의마이코바이러스제거방법에관한것으로, 본발명의방법을이용하면마이코바이러스 (mycovirus) 에감염된진균류에서마이코바이러스를간단하고효율적으로제거할수있다. 따라서, 바이러스가없는 (vius-free) 균주를대량으로확보할수있으므로버섯종균생산에유용할것으로기대된다. 대표도 - 도 6-1 -
(52) CPC 특허분류 C12Q 1/24 (2013.01) C12Q 1/686 (2013.01) G01N 33/569 (2013.01) 이발명을지원한국가연구개발사업 과제고유번호 부처명 연구관리전문기관 연구사업명 연구과제명 기여율 1/1 IPET114064-03-2-HD020 농림축산식품부 농생명산업기술개발 농림수산식품기술기획평가원 저병원화바이러스를활용한생물방제재개발연구 주관기관 전북대학교 연구기간 2014.09.25 ~ 2017.09.24 공지예외적용 : 있음 - 2 -
명세서청구범위청구항 1 삭제청구항 2 삭제청구항 3 1) 마이코바이러스에감염된표고버섯산조701 균주를 23~27 의온도에서 4~7주동안배양하는단계 ; 2) 상기표고버섯산조701 균주배양플레이트에멸균수를첨가하여균사를현탁한후균사액을수집하는단계 ; 3) 상기균사액을공극크기가 20~60μm인분자체 (molecular sieve) 를이용하여여과한후여과액을 10-2 내지 10-5 배희석하여진균배양배지에도말하는단계 ; 및 4) 상기진균배양배지에형성된콜로니중바이러스에감염되지않은기탁번호가 KCTC12368BP 또는 KCTC12369BP인표고버섯산조701 균주를선발하는단계를포함하는마이코바이러스가제거된표고버섯산조701 균주의제조방법. 청구항 4 삭제청구항 5 삭제청구항 6 삭제청구항 7 삭제청구항 8 삭제청구항 9 삭제 발명의설명 [0001] 기술분야본발명은마이코바이러스에감염된진균류의마이코바이러스제거방법에관한것으로, 더욱상세하게는고체배지에서배양한마이코바이러스 (mycovirus) 에감염된진균 (fungus) 의균사를멸균수로현탁하여수집한후, 수집한균사액을분자체 (molecular sieve) 로여과하고희석하여진균배양배지에도말하는단계및상기진균배양배지에새롭게형성된콜로니중바이러스에감염되지않은진균을선발하는단계를포함하는마이코바이러스에감염된진균류의마이코바이러스제거방법및상기방법에의해생산된마이코바이러스가제거된진균에관한것이다. - 3 -
[0002] [0003] [0004] [0005] [0006] 배경기술사상성곰팡이에서흔히발견되는이중가닥 RNA 성분 (double-strand RNA component) 들은마이코바이러스 (mycovirus) 로알려져있다 (Ghabrial, Virus Genes 16, 119-131 (1998)). 이들은식물에병원성을일으키는곰팡이 (plant-pathogenic fungi) 의주요그룹들모두에서발견된다. 곰팡이에감염되는바이러스에대해서는대부분이밝혀지지않은상태이지만, 일부바이러스는세포분열, 포자번식 (sporogenesis) 또는세포융합이일어나는동안세포내로전달되어숙주곰팡이의성장속도, 포자형성 (sporulation), 색소형성 (pigmentation) 및효소활성에영향을끼치는것으로알려져있다 (Anagnostakis and Van Alfen, Phytopathology 69, 1226-1229 (1993)). 이러한바이러스매개조절 (virus-mediated modulation) 의대표적인예로밤나무에줄기마름병을일으키는곰팡이크리포넥트리아파라시티카 (Cryphonectria parasitica) 와다섯개의 dsrna 마이코바이러스패밀리 (Chrysoviridae, Hypoviridae, Partitiviridae, Reoviridae 및 Totiviridae) 중하이포바이러스과 (Hypoviridae family) 에속하는크리포넥트리아하이포바이러스 (Cryphonectria hypovirus; CHV) 가알려져있다 (Nuss, Phytopathology 69, 854-858 (2005)). CHV는밤나무에서크리포넥트리아파라시티카곰팡이의병원성을상당히감소시키며, 숙주곰팡이의포자형성, 색소형성및유전자발현에도영향을미친다 (Rigling et al., Phytopathology 79, 219-223 (1989)). 밤나무에줄기마름병을일으키는크리포넥트리아파라시티카와같은곰팡이의경우에는바이러스감염에의해그병원성이감소하여인간에게이로운영향을미칠수있다. 그러나자실체를형성하는버섯같은경우에는바이러스감염에의해균사와자실체의생장속도가느려지고, 버섯갓끝이나표면이갈라지고휘어지게된다. 이밖에도버섯대의길이가짧아지고, 기형이나타나거나버섯의분화가거의이루어지지못하며, 균사밀도가낮아지는등의문제를일으켜버섯의상품성을하락시키고재배농가에피해를준다. 또한, 바이러스에감염된버섯은그버섯으로부터재생된균사체및종균에도바이러스를전달할수있으며, 진단이어렵고특별한방제방법도없다. 따라서바이러스에감염되지않은종균을이용하여충실한균상을만드는방식으로버섯을재배하는것이가장바람직하다고할수있다. 따라서본발명에서는크리소바이러스 (chrysovirus; CnV1-BS122) 가감염된숙주곰팡이크리포넥트리아니츠케이 (C. nitschkei) BS122 균주및마이코바이러스가감염된표고버섯산조701에서마이코바이러스를제거 (curing) 하고바이러스가없는 (virus-free) 균주를확보하기위한연구를진행하였다. 한편, 한국등록특허제0640282호에는 ' 바이러스에이병된느타리속버섯의바이러스퇴치방법 ' 이개시되어있고, 한국공개특허제2011-0134616호에는 ' 표고버섯바이러스 LeSV 진단용특이프라이머, 및이를이용한진단방법 ' 이개시되어있다. 그러나본발명에서와같이, 마이코바이러스에감염된진균류의바이러스제거방법에대해서는개시된바가전혀없다. 발명의내용 [0007] 해결하려는과제본발명은상기와같은요구에의해도출된것으로서, 크리소바이러스 (chrysovirus; CnV1-BS122) 가감염된숙주곰팡이크리포넥트리아니츠케이 (C. nitschkei) BS122 균주및마이코바이러스 (mycovirus) 가감염된표고버섯 (Lentinula edodes) 산조701의균사를현탁한후분자체 (molecular sieve) 로여과하고희석하여배양했을때, 새롭게형성된콜로니에서바이러스에감염되지않은진균을얻을수있다는것을확인하였고, 마이코바이러스가제거 (curing) 된균주를선발함으로써본발명을완성하였다. [0008] [0009] [0010] [0011] 과제의해결수단상기과제를해결하기위해, 본발명은 1) 마이코바이러스 (mycovirus) 에감염된진균 (fungus) 을고체배지에서배양하는단계 ; 2) 상기진균배양플레이트에멸균수를첨가하여균사를현탁한후균사액을수집하는단계 ; 3) 상기균사액을분자체 (molecular sieve) 를이용하여여과한후여과액을희석하여진균배양배지에도말하는단계 ; 및 - 4 -
[0012] [0013] [0014] [0015] [0016] 4) 상기진균배양배지에형성된콜로니중바이러스에감염되지않은진균을선발하는단계를포함하는마이코바이러스에감염된진균류의마이코바이러스제거방법을제공한다. 또한, 본발명은상기방법에의해생산된마이코바이러스가제거된진균을제공한다. 또한, 본발명은상기방법을이용하여크리소바이러스 (chrysovirus) 가제거된크리포넥트리아니츠케이 (Cryphonectria nitschkei) 균주를제조하는방법을제공한다. 또한, 본발명은상기방법을이용하여마이코바이러스가제거된표고버섯 (Lentinula edodes) 균주를제조하는방법을제공한다. 또한, 본발명은상기방법에의해제조된마이코바이러스가제거된표고버섯균주를제공한다. [0017] 발명의효과본발명의마이코바이러스제거방법을이용하면, 크리소바이러스 (chrysovirus) 가감염된숙주곰팡이크리포넥트리아니츠케이 (C. nitschkei) BS122 균주및마이코바이러스 (mycovirus) 가감염된표고버섯 (Lentinula edodes) 산조701에서마이코바이러스를간단하고효율적으로제거할수있다. 또한, 바이러스가없는 (viusfree) 균주를대량으로확보할수있어버섯종균생산에유용할것으로기대된다. [0018] 도면의간단한설명도 1은크리포넥트리아니츠케이 (C. nitschkei) 균주의표현형및 dsrna 양상을확인한결과이다. (A) 야생형크리포넥트리아니츠케이 KACC44972, KACC44973 및 KACC44974 균주및크리소바이러스 (chrysovirus; CnV1- BS122) 에감염된한국크리포넥트리아니츠케이 BS122, bs131, bs132 및 BS321 균주를 25 에서 11일동안배양한결과. (B) 크리포넥트리아니츠케이균주의 dsrna 양상, 레인 1kb: 사이즈마커, 레인 UEP: 양성대조구로사용된 12.7 kb의게놈을갖는하이포바이러스감염크리포넥트리아파라시티카 UEP (CHV1-EP713), a: KACC44972, b: KACC44973, c: KACC44974, d: BS122, e: bs131, f: bs132, g: BS321. 도 2는크리소바이러스 (CnV1-BS122) 에감염된한국크리포넥트리아니츠케이 BS122의균사단편현미경사진및 dsrna 추출결과를나타낸다. (A) 나일론막 (40 μm ) 으로여과한균사단편의현미경관찰, 스케일바 : 20 μm. (B) 나일론막으로여과한균사단편을도말한배지에형성된콜로니에서추출한 dsrna의아가로스겔전기영동결과, 레인 M: 람다사이즈마커, 레인 Pc: CnV1-BS122 감염 BS122 균주, 레인 1~19: 균사단편으로부터형성된콜로니에서추출한 dsrna. 도 3은바이러스가제거 (curing) 된균주의 ITS 영역의서열분석결과를 NCBI BLAST에서확인한결과를나타낸다. 도 4는 CnV1-BS122가감염된균주 BS122(V+) 및 CnV1-BS122 바이러스가제거된균주 (T2, T3, TL 및 TG) 의 dsrna 추출및 RT-PCR 결과를나타낸다. RT-PCR에서, CnV1-BS122은 CnV1-BS122의외피단백질의일부영역을증폭할수있는프라이머를사용하여수행되었다. 도 5는 CnV1-BS122가감염된균주 BS122(V+) 및 CnV1-BS122 바이러스가제거된균주 (T2, T3, TL 및 TG) 의 dsrna에대한노던블럿결과를나타낸다. 왼쪽패널은 EtBr 염색겔, 오른쪽패널은감광시킨 X-선필름을나타낸다. 레인 BS122: CnV1-BS122가감염된균주, 레인 T2, T3, TL 및 TG: CnV1-BS122 바이러스가제거된균주, 레인 1 kb: 사이즈마커. 도 6은나일론막 (40 μm ) 으로여과한표고버섯산조701의균사단편으로부터형성된콜로니에서추출한 dsrna 의아가로스겔전기영동결과를나타낸다. 레인 1: 사이즈마커, 레인 2: 양성대조구로사용된바이러스에감염된표고버섯산조 701 균주, 레인 3, 4, 7, 9 및 17: 바이러스가제거된표고버섯균주, 레인 5, 6, 8, 10, 11, 12, 13, 14, 15 및 16: 바이러스가제거되지않은표고버섯균주. [0019] [0020] [0021] 발명을실시하기위한구체적인내용본발명의목적을달성하기위하여, 본발명은 1) 마이코바이러스 (mycovirus) 에감염된진균 (fungus) 을고체배지에서배양하는단계 ; 2) 상기진균배양플레이트에멸균수를첨가하여균사를현탁한후균사액을수집하는단계 ; - 5 -
[0022] [0023] [0024] [0025] [0026] [0027] [0028] 3) 상기균사액을분자체 (molecular sieve) 를이용하여여과한후여과액을희석하여진균배양배지에도말하는단계 ; 및 4) 상기진균배양배지에형성된콜로니중바이러스에감염되지않은진균을선발하는단계를포함하는마이코바이러스에감염된진균류의마이코바이러스제거방법을제공한다. 본발명에서마이코바이러스는진균류에감염하는바이러스를총칭한다. 마이코바이러스는숙주균에감염하여균주의생육, 포자형성 (sporulation), 색소형성 (pigmentation), 형태, 대사, 효소활성및병원성등에변화를일으킨다고알려져있으나, 진균에감염되는바이러스및생물학적특성에대해서는그일부만밝혀져있다. 특히, 표고버섯에감염되는마이코바이러스에대해서는대부분이밝혀져있지않은상태이다. 본발명의일구현예에있어서, 상기마이코바이러스에감염된진균은크리포넥트리아니츠케이 (Cryphonectria nitschkei) 균주또는표고버섯 (Lentinula edodes) 균주일수있으나, 이에제한되지않는다. 본발명의일구현예에따른마이코바이러스에감염된진균류의마이코바이러스제거방법에서, 상기 1) 단계는구체적으로, 마이코바이러스 (mycovirus) 에감염된진균 (fungus) 이크리포넥트리아니츠케이균주인경우, 마이코바이러스에감염된크리포넥트리아니츠케이균주를고체배지에서 3~5주동안배양할수있으며, 바람직하게는고체배지에서 23~27 의온도로 3~5주동안배양할수있으며, 더바람직하게는고체배지에서 25 의온도로 4주동안배양할수있으며, 가장바람직하게는고체배지에서 25 의온도및빛공급조건으로 4주동안배양할수있으나, 이에제한되지않는다. 또한, 상기 1) 단계는구체적으로, 마이코바이러스에감염된진균이표고버섯균주인경우, 마이코바이러스에감염된표고버섯균주를고체배지에서 4~7주동안배양할수있으며, 바람직하게는고체배지에서 23~27 의온도로 4~7주동안배양할수있으며, 더바람직하게는고체배지에서 25 의온도로 6주동안배양할수있으며, 가장바람직하게는고체배지에서 25 의온도및빛차단조건으로 6주동안배양할수있으나, 이에제한되지않는다. 본발명의일구현예에따른마이코바이러스에감염된진균류의마이코바이러스제거방법에서, 상기 2) 단계는구체적으로, 상기진균의균사가배양된플레이트에멸균수를첨가하여균사를현탁한후균사액을수집하는단계일수있으나, 이에제한되지않는다. 상기배양플레이트에첨가되는멸균수의양은적당한수준에서조절될수있으며, 바람직하게는 90 mm 15 mm 크기의플레이트에배양한균사에 7~15 ml의멸균수가첨가될수있으며, 더바람직하게는 10 ml의멸균수가첨가될수있으나, 이에제한되지않는다. 상기균사의현탁에는스프레더 (spreader) 또는유리막대 (glass rod) 를이용할수있으나, 균사를현탁할수있는도구라면이에제한되지않는다. 본발명의일구현예에따른마이코바이러스에감염된진균류의마이코바이러스제거방법에서, 상기 3) 단계는구체적으로, 균사액을나일론막 (nylon membrane), 멸균한거즈 (gauze) 또는무명천 (cheese cloth) 과같은분자체로여과한후, 멸균수또는배양배지를이용하여여과액을 10-1 내지 10-4 배희석하고진균배양배지에도말하는단계일수있으며, 바람직하게는균사액을나일론막으로여과한후멸균수를이용하여여과액을 10-2 배희석하고진균배양배지에도말하는단계일수있으나, 이에제한되지않는다. 또한, 상기분자체의공극 크기 (pore size) 는 20~60 μm, 바람직하게는 30~50 μm, 더욱바람직하게는 40 μm일수있으나, 이에제한되지않으 며, 진균의크기에따라공극크기가조절될수있다. [0029] 본발명의일구현예에따른마이코바이러스에감염된진균류의마이코바이러스제거방법에서, 상기 4) 단계는구체적으로, 마이코바이러스 (mycovirus) 에감염된진균 (fungus) 이크리포넥트리아니츠케이균주인경우, 상기진균배양배지를 23~27 의온도에서배양한후형성된콜로니중바이러스에감염되지않은진균을선발하는단계일수있으며, 바람직하게는상기진균배양배지를 25 의온도에서 5일동안배양한후형성된콜로니중바이러스에감염되지않은진균을선발하는단계일수있으며, 더바람직하게는상기진균배양배지를 25 의온도및빛조건에서 5일동안배양한후형성된콜로니중바이러스에감염되지않은진균을선발하는단계일수있으나, 이에제한되지않는다. 또한, 상기 4) 단계는구체적으로, 마이코바이러스에감염된진균이표고버섯균주인경우, 상기진균배양배지를 23~27 의온도에서배양한후형성된콜로니중바이러스에감염되지않은진균을선발하는단계일수있으며, 바람직하게는상기진균배양배지를 25 의온도에서 10일동안배양한후형성된콜로니중바이러스에감염되지않은진균을선발하는단계일수있으며, 더바람직하게는상기진균배양배지를 25 의온도및빛차단조건에서 10일동안배양한후형성된콜로니중바이러스에감염되지않은진균을선발하는단계일수있으나, 이에제한되지않는다. 상기바이러스에감염되지않은진균의선발에는아가로스겔전기영동, RT-PCR (Reverse transcriptase-polymerase Chaim Reaction) 또는노던블럿 - 6 -
분석방법이이용될수있으나, 이에제한되지않는다. [0030] [0031] [0032] [0033] [0034] [0035] [0036] [0037] [0038] [0039] [0040] [0041] [0042] [0043] [0044] [0045] [0046] [0047] [0048] [0049] 본발명의진균류배양에는 ph 5.5~6.5의 PDAmb 배지, PDA 배지, EP 완전배지, PDBmb 배지또는 PDB 배지가이용될수있으나, 진균류의배양에적합한배지라면이에제한되지않는다. 또한, 본발명은상기방법에의해생산된마이코바이러스가제거된진균을제공한다. 상기마이코바이러스가제거된진균은크리포넥트리아니츠케이 (Cryphonectria nitschkei) 균주또는표고버섯 (Lentinula edodes) 균주일수있으나, 이에제한되지않는다. 또한, 본발명은 1) 크리소바이러스 (chrysovirus) 에감염된크리포넥트리아니츠케이 (Cryphonectria nitschkei) 균주를배양하는단계 ; 2) 상기크리포넥트리아니츠케이균주배양플레이트에멸균수를첨가하여균사를현탁한후균사액을수집하는단계 ; 3) 상기균사액을분자체 (molecular sieve) 를이용하여여과한후여과액을희석하여진균배양배지에도말하는단계 ; 및 4) 상기진균배양배지에형성된콜로니중바이러스에감염되지않은크리포넥트리아니츠케이균주를선발하는단계를포함하는크리소바이러스가제거된크리포넥트리아니츠케이균주의제조방법을제공한다. 상기크리소바이러스가제거된크리포넥트리아니츠케이균주의제조는전술한상기마이코바이러스에감염된진균류의마이코바이러스제거방법을이용하여수행될수있다. 본발명의크리포넥트리아니츠케이균주의배양에는 ph 5.5~6.5의 PDAmb 배지, PDA 배지, EP 완전배지, PDBmb 배지또는 PDB 배지가이용될수있으며, 바람직하게는 ph 5.6의 PDAmb 배지가이용될수있으나, 크리포넥트리아니츠케이균주의배양에적합한배지라면이에제한되지않는다. 또한, 본발명은상기방법에의해제조된마이코바이러스가제거된크리포넥트리아니츠케이균주를제공한다. 또한, 본발명은 1) 마이코바이러스에감염된표고버섯균주를배양하는단계 ; 2) 상기표고버섯균주배양플레이트에멸균수를첨가하여균사를현탁한후균사액을수집하는단계 ; 3) 상기균사액을분자체 (molecular sieve) 를이용하여여과한후여과액을희석하여진균배양배지에도말하는단계 ; 및 4) 상기진균배양배지에형성된콜로니중바이러스에감염되지않은표고버섯균주를선발하는단계를포함하는마이코바이러스가제거된표고버섯균주의제조방법을제공한다. 상기마이코바이러스가제거된표고버섯균주의제조는전술한상기마이코바이러스에감염된진균류의마이코바이러스제거방법을이용하여수행될수있다. 본발명의표고버섯균주의배양에는 ph 5.5~6.5의 PDAmb 배지, PDA 배지, EP 완전배지, PDBmb 배지또는 PDB 배지가이용될수있으며, 바람직하게는 ph 5.6의 PDA 배지가이용될수있으나, 표고버섯균주의배양에적합한배지라면이에제한되지않는다. 또한, 본발명은상기방법에의해제조된마이코바이러스가제거된표고버섯균주를제공한다. 본발명의일구현예에있어서, 상기마이코바이러스가제거된표고버섯균주는한국생명공학연구원에 2013년 2 월 15일자로기탁하였다 ( 기탁번호 : KCTC12368BP). 본발명의일구현예에있어서, 상기마이코바이러스가제거된표고버섯균주는한국생명공학연구원에 2013년 2 월 15일자로기탁하였다 ( 기탁번호 : KCTC12369BP). [0050] 이하, 본발명을실시예에의해상세히설명한다. 단, 하기실시예는본발명을예시하는것일뿐, 본발명의 내용이하기실시예에한정되는것은아니다. - 7 -
[0051] [0052] [0053] 재료및방법 1) 효소및시약각종제한효소및 DNA 변형 (modifying) 효소는 Enzynomics, KOSCO CHEM, Promega, TaKaRa 제품을이용하였다. 또한 E. coli 및균주배양을위한배지는 DIFCO와 Bacto 제품을사용하였다. 이외의시약은 Sigma 제품을사용하였다. [0054] [0055] [0056] [0057] 2) 사용벡터및균주플라스미드증식을위한숙주로 E. coli TOP10F' [mcraδ(mrr-hsdrms-mcr BC) Φ80lacZM15 ΔlacX74 deor reca1 arad139 Δ(ara-leu)7697 galk rpsl(strp) enda1 nupg] 을이용하였고, 유전자재조합을위한플라스미드벡터는 MCS가다양한 pbssk 및 pgem T-easy 벡터를사용했다. 곰팡이균주는 CHV1-713-하이포바이러스감염 (CHV1-713-containing hypovirulent) 크리포넥트리아파라시티카 (C. parasitica) 균주 UEP1, 선행연구에서분리된크리포넥트리아니츠케이 (Cryphonectria nitschkei) 균주 KACC44426 (BS122) (Park et al., Mycol. Res. 112, 1220-1226 (2008)), KACC44425 (bs131), KACC44424 (bs132) 및 KACC44423 (BS321) 을사용했다 (Kim et al., J. Microbiol. 47, 441-447 (2009)). 표고버섯균주는국내농가에보급되는표고버섯종균중가장보급률이높은표고버섯산조701을사용하였다. [0058] [0059] [0060] [0061] 3) 배지및배양방법 E. coli는 LB 배지 ( 트립톤 1%, 효모추출물 0.5% 및 NaCl 1%) 를사용하여 37 에서 200 rpm으로배양했다. 형질전환균주선발을위해서는 50 μg / ml의앰피실린이첨가된 LB 배지를이용하였다. 진균고체배양배지는일반적으로 PDAmb 배지 ( 감자덱스트로스브로스 24 g/l, 메티오닌 0.1 g/l, 비오틴 1 mg/l 및 1.5% 아가 ) 또는 PDA 배지 ( 감자덱스트로스브로스 24 g/l 및 1.5% 아가 ) 를사용하였고, 액체배양배지는 PDBmb 배지 ( 감자덱스트로스브로스 24 g/l, 메티오닌 0.1 g/l 및비오틴 1 mg/l), EP 완전배지 (EP 염용액 62.5 ml /l, 효모추출물 2.5 g/l, 맥아추출물 7.5 g/l, 티아민 2 mg /l, 비오틴 2 mg /l, 포타슘 L-아스파테이트 17.2 g/l, 메티오닌 0.1 g/l 및아르기닌 0.1 g/l) 또는 PDB 배지 ( 감자덱스트로스 24 g/l) 를사용하였다. 균주는 PDAmb 배지에서는 25 및 2000 lux 빛조건으로배양하였고, PDA 배지에서는 25 및빛차단조건으로배양하였고, EP 완전배지에서는 25, 120 rpm으로교반배양하였으며, PDBmb 배지또는 PDB 배지에서는 25, 190 rpm으로교반배양하였다 (Park et al., Mycol. Res. 112, 1220-1226 (2008)). 진균이크리포넥트리아니츠케이균주인경우에는 PDAmb 배지에서 25 및 2000 lux 빛조건으로배양하였고, 표고버섯균주인경우에는 PDA 배지에서 25 및빛차단조건으로배양하였다. [0062] [0063] 4) 균주로부터 dsrna의추출균주로부터 dsrna 추출은 Morris 등의 CC41 mini-prep phenol 방법을이용하였다 (Plant Molecular Biology Reporter 1 (1): 27-30 (1983)). 크리포넥트리아니츠케이균주는셀로판지에서 5일이상배양하고, 표고버섯균주는셀로판지에서 10일이상배양하여, 각각의균사체 (mycelium) 를얻었고, 이를동결건조하여분쇄한후 2.0 ml 튜브에 150 μl부피까지담았다. 추출버퍼 (2 STE 및 2% SDS) 에 1% 소듐바이설페이트 (sodium bisulfate) 를첨가한후각각의튜브에 1 ml씩분주하여균사체와충분히섞어주었다. 이어서 900 μl의 PCI (phenol/chlorform/isoamy alcohol = 25 : 24 : 1) 를넣고층이분리되지않을때까지 20초이상볼텍싱 (vortexing) 하였다. 13,000 rpm으로 15분간원심분리하여얻어진상층액을새로운 1.5 ml 튜브에옮긴후, 최종부피를 1 ml까지 1 STE 버퍼 (0.1 M NaCl, 0.05 M Tris (ph 8.0) 및 1 mm EDTA) 를첨가하고 200 μl의 100% EtOH를분주하였다. 그리고 0.1 g의 CC41 (Duchfa) 을첨가한후완전히섞일수있게 10분이상섞어주었다. 12,200 rpm에서 10분동안원심분리한후, 상층액을제거하고 1 ml의세척버퍼 (100 ml 10 STE, 170 ml EtOH 및 730 ml dh 2 0) 를첨가하여세척하는과정은 2번반복하였다. 세척후얻어진펠렛에 600 μl의 1 STE를첨가 하고펠렛을재현탁하고, 12,200 rpm 으로 10 분동안원심분리하여상층액을얻었다. 상층액에 60 μl의 3 M - 8 -
NaOAc 와 100% EtOH 를첨가한후흔들어섞어주고상온에서 12 시간이상유지했다. 12,200 rpm 으로 30 분동안원 심분리하여펠렛을얻었고 70% EtOH 로세척한후건조하였다. 건조된펠렛은 40 μl의 DEPC 처리된증류수에녹 인후 1% 아가로스겔전기영동으로확인했다. [0064] [0065] 5) 바이러스감염균주에서의바이러스제거 (virus curing) 크리포넥트리아니츠케이균주는 PDAmb 배지에서 25 의빛조건으로 4주이상배양하고, 표고버섯균주는 PDA 배지에서 25 의빛차단조건으로 6주이상배양한후, 멸균수 10 ml을플레이트에각각첨가하였다. 멸균한스프레더 (spreader) 로플레이트상의균사를긁어서현탁한후, 균사액을나일론막 (40 μm ; Millipore), 멸균 한거즈또는무명천을이용하여각각의균사액을여과시켰다. 여과액은약 10-2 배희석하여새로운 PDAmb 배지 ( 크리포넥트리아니츠케이균주 ) 또는 PDA 배지 ( 표고버섯균주 ) 에도말하고, 25 에서배양했다. 크리포넥트리아니츠케이균주는빛조건하에서 5일동안배양한후에형성된콜로니를선발하여새로운 PDAmb 배지에옮겼고, 표고버섯균주는빛차단조건하에서 10일동안배양한이후에형성된콜로니를선발하여새로운 PDA 배지에옮겼다. [0066] 선발한각각의콜로니는바이러스제거 (virus curing) 여부를확인하기위한실험에이용하였다. [0067] [0068] 6) ITS (Internal Transcribed Spacer) 영역의클로닝및서열분석균주의게놈 DNA를확보한후 ITS 프라이머 (ITS-1: 5'-TCC GTA GGT GAA CCT GCG G-3'; 서열번호 1, ITS-4: 5'-TCC TCC GCT TAT TGA TAT GC-3'; 서열번호 2) 를이용하여 PCR을수행하였다. ITS 영역의 PCR을통해확보한유전자는 pgem-t easy 벡터에클로닝한후서열분석을수행했다. [0069] [0070] 7) RT-PCR RT-PCR은 PDAmb 배지에서 5일이상또는 PDBmb 배지에서 14일이상배양한크리포넥트리아니츠케이균주또는 PDA 배지에서 10일이상또는 PDB 배지에서 3주이상배양한표고버섯균주에서추출한 dsrna를주형으로사용하였다. 총반응부피 25 μl의반응혼합물에는 2 μl의 dsrna, 1 μl의랜덤프라이머, 0.5 μl의 RNase 억제제, 5 μl의 5 버퍼, 1 μl의 dntp, 0.5 μl의역전사효소및 DEPC 처리된증류수가포함된다. 상기반응으로 DNA 주형을제작하였고, 이를이용하여다시 PCR을수행하여바이러스유전자의존재여부를확인하였다. 크리포넥트리아니츠케이균주에감염된크리소바이러스유전자는 BS122의외피단백질을코딩하는 2번째부분 (segment) 의 600bp 정도를증폭할수있는프라이머세트 (dsrna bs122 #b15 정방향 : 5'-GAA AGT TTC ATC CAC TAA-3'; 서열번호 3 및 dsrna bs122 #b15 역방향 : 5'-GTG GCT TTT GAG ATT TCC-3'; 서열번호 4) 를이용한 PCR로확인하였다. 또한, 표고버섯에감염된마이코바이러스유전자를확인하기위한프라이머세트 (dsrna FMRI0339 LeV 정방향 : 5'-TTA CGA GGG TTA TGG TCT GGA TGG-3'; 서열번호 5 및 dsrna FMRI0339 LeV 역방향 5'-CCC TTT GTT TGC GAG CGT ATT CCA-3'; 서열번호 6) 를이용하여 PCR을수행했다. PCR은 94 에서 5분, 30회반복의 94 에서 30초, 55 에서 30초및 72 에서 1분 30초조건으로수행하였다. PCR 증폭산물은 1% 아가로스겔전기영동으로확인하였다. [0071] [0072] 8) dsrna 노던블럿분석추출된 dsrna는 0.7% 아가로스겔에서 80V로전기영동한후 UV 하에서밴드를확인하였고, 모세관이동법 (capillary transfer) 을이용하여나일론막으로옮겼다. 막은 UV를조사한후 80 오븐에서 2시간동안베이킹 (baking) 하였고, MCB 버퍼내에서랜덤프라이머표지방법 (prime-a-gene Labeling system, Promega) 을이 용하여 α 32 P-dCTP로표지한탐침 (BS122 균주외피단백질의전장 cdna 클론 ) 으로 65 에서 16시간동안혼성화되었다. 막은 65 에서각각 15분동안 1% SDS가첨가된 2 SSC 버퍼및 1% SDS가첨가된 0.2 SSC 버퍼로 2 회세척하였다. 혼성화된밴드는 X-선필름 (Fuji Photo Film Co. HR-G30) 을사용하여자기방사법 (autoradiography) 으로검출되었다. - 9 -
[0073] [0074] [0075] 실시예 1. 크리포넥트리아니츠케이 (C. nitschkei) 균주의표현형관찰및 dsrna 양상확인균주의표현형적인특성을확인하기위해, KACC에서받은야생형크리포넥트리아니츠케이균주 KACC44972, KACC44973 및 KACC44974를대조구로이용하여, 크리소바이러스 (chrysovirus) 에감염된한국크리포넥트리아니츠케이균주 BS122, bs131, bs132 및 BS321의표현형을관찰하였다. 상기균주들은 PDAmb 배지에서 25 로 11 일동안배양하였다 ( 도 1A). 배양결과, KACC44972 및 KACC44973 균주는다른균주들보다균사생장 (hyphal growth) 이빠르고색소형성 (pigmentation) 도잘되는것으로확인되었다. 그리고각균주들의 dsrna를추출한결과, KACC44972 및 KACC44973 균주는바이러스에감염되지않은것이확인되었으나, KACC44974에서는하이포바이러스 (hyphovirus) 로추정되는크기의 dsrna 밴드가나타났다. 또한크리소바이러스 (chrysovirus) 에감염된한국크리포넥트리아니츠케이균주 BS122, bs131, bs132 및 BS321에서도다양한바이러스 dsrna 밴드양상이나타났다. 이때양성대조구로는약 12.7 kb의게놈을갖는하이포바이러스감염크리포넥트리아파라시티카 UEP (CHV1-EP713) 를사용하였다 ( 도 1B). 이처럼, dsrna 추출결과에서도빠른균사생장및색소형성이나타난 KACC44972 및 KACC44973 균주는바이러스에감염되지않은것으로나타났다. [0076] [0077] 실시예 2. 바이러스가없는 (virus-free) 균주의확보본발명의바이러스제거 (virus curing) 방법을이용하여 CnV1-BS122에감염된 BS122 균주에서바이러스가없는분리주 (virus-free isolate) 를얻고자하였다. 나일론막 (40 μm ; Millipore) 으로여과한균사액을현미경으로관찰한결과, 작은균사단편들이확인되었고 ( 도 2A), 상기균사단편이확인된균사액은희석하여 PDAmb 배지에서배양했다. 배양 4일이후에형성된콜로니를선발하여각각새로운 PDAmb 배지에서배양하고, dsrna를추출하였다. 그결과, 20개의분리주중에서 1개를제외한모든균주에서 CnV1-BS122 바이러스가존재하지않는것으로확인되었다 ( 도 2B). 바이러스제거실험은 3 반복 (triplicate) 으로 5회이상반복수행되었으며, 각실험에서유사한결과를얻을수있었다. [0078] [0079] 실시예 3. ITS 영역분석바이러스가제거된균주가한국크리포넥트리아니츠케이 BS122 균주인지확인하기위해, ITS 영역분석을수행하였다. 도 2B에서확인된바이러스감염균주 1개및바이러스제거균주 4개를임의로선발한후 ITS 영역을클로닝하여서열분석하였다. 서열분석결과를 NCBI BLAST에서확인한결과모두 BS122 균주인것으로확인되었다 ( 도 3). [0080] [0081] [0082] 실시예 4. RT-PCR 및 dsrna 노던블럿분석을통한 CnV1-BS122 바이러스확인 CnV1-BS122가감염된균주 BS122(V+) 및 CnV1-BS122 바이러스가제거된균주 (T2, T3, TL 및 TG) 에서추출한 dsrna는 BS122의외피단백질의일부영역을증폭할수있는프라이머를이용하여 RT-PCR을수행하였다. 그결과, BS122(V+) 균주에서만약 600 bp의밴드가확인되었고나머지균주 (T2, T3, TL 및 TG) 에서는밴드가나타나지않았다 ( 도 4). 상기분리주에서추출된 dsrna를이용하여노던블럿을수행한결과에서도, BS122(V+) 균주에서만밴드가확인되었고나머지균주 (T2, T3, TL 및 TG) 에서는밴드가나타나지않았다 ( 도 5). 이를통해 T2, T3, TL 및 TG 분리주는확실하게바이러스가제거되었다는것을확인할수있었다. [0083] [0084] 실시예 5. 표고버섯산조701의균사로부터추출한 dsrna의양상확인본발명의바이러스제거 (virus curing) 방법을이용하여표고버섯마이코바이러스 (FMRI 0399-LeV) 에감염된표고버섯산조701 균주에서바이러스가없는분리주 (virus-free isolate) 를얻고자하였다. 나일론막 (40 μm ; Millipore) 으로여과한균사액을현미경으로관찰한결과, 작은균사단편들이확인되었고, 상기균사단편이확인된균사액은희석하여 PDA 배지에서배양했다. 배양 10일이후에형성된콜로니를선발하여각각새로운 PDA 배지에서배양하고, dsrna를추출하였다. 그결과, 도 6의레인 3 (FMRI 0339/Sanjo701-vf1), 레인 4 (FMRI 0339/Sanjo701-vf2), 레인 7 (FMRI 0339/Sanjo701-vf3), 레인 9 (FMRI 0339/Sanjo701-vf4) 및레인 17-10 -
(FMRI 0339/Sanjo701-vf5) 에나타난것처럼, 16 개의분리주중에서 5 개의바이러스제거균주를확보하였다. 바 이러스제거실험은 3 반복 (triplicate) 으로 5 회이상반복수행되었으며, 각실험에서유사한결과를얻을수 있었다. [0085] 수탁번호 기탁기관명 : 한국생명공학연구원 수탁번호 : KCTC12368BP 수탁일자 : 20130215 기탁기관명 : 한국생명공학연구원 수탁번호 : KCTC12369BP 수탁일자 : 20130215 도면 도면 1-11 -
도면 2 도면 3 도면 4-12 -
도면 5 도면 6 서열목록 <110> INDUSTRIAL COOPERATION FOUNDATION CHONBUK NATIONAL UNIVERSITY <120> Method for curing mycovirus from mycovirus-infected fungus <130> PN15054 <160> 6 <170> KopatentIn 2.0 <210> 1 <211> 19 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220><223> Primer <400> 1 tccgtaggtg aacctgcgg 19-13 -
<210> 2 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220><223> Primer <400> 2 tcctccgctt attgatatgc 20 <210> 3 <211> 18 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220><223> Primer <400> 3 gaaagtttca tccactaa 18 <210> 4 <211> 18 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220><223> Primer <400> 4 gtggcttttg agatttcc 18 <210> 5 <211> 24 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220><223> Primer <400> 5 ttacgagggt tatggtctgg atgg 24 <210> 6 <211> 24 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220><223> Primer - 14 -
<400> 6 ccctttgttt gcgagcgtat tcca 24-15 -