EZ TM 5 /3 RACE PCR Kit Instruction Manual Korean Ver. Kit for 10 reactions Cat.# EZ025
EZ TM 5 /3 RACE PCR Kit Table of Contents I. 제품설명... 3 II. 원리... 4 III. 제품구성... 7 IV. 염기서열정보... 8 V. 주의사항... 8 VI. 3 /5 Primer 제작... 8 VII. 실험방법... 9 VIII. Troubleshooting guide...13 www.enzynomics.com 2
제품설명 RACE(Rapid Amplification of cdna Ends) 란 cdna 의염기서열을부분적으로알고있는경우알고있는영역의염기서열정보를바탕으로 cdna 말단까지알고있지않은영역을 cloning 하는 PCR 방법입니다. 모르는영역이 mrna 의 5 인경우를 5 -RACE, 3 의경우를 3 -RACE 라고합니다. 이실험기법은 one-sided PCR 또는 anchored PCR 이라고도불립니다. EZ TM 5 /3 RACE PCR Kit는 mrna 의 3 또는 5 end 의염기서열을알고있는영역부분과모르는영역부분사이의 mrna 로부터 DNA 염기를증폭하도록개발되었으며, RACE 의필수요소인 TOPscript TM RT DryMix, TOPsimple PreMIX Forte, PCR Anchor primer, Oligo d[t]-anchor primer, Terminal Deoxynucleotidyl Transferase (TdT) 로구성되었습니다. 반응은먼저, 5 말단에 adaptor 서열이연결된 oligo(dt) primer 를사용하여역전사반응을통해첫번째 cdna 가닥을합성합니다. 완성된첫번째 cdna 가닥말단은 adaptor 서열을포함하고있으며, 알고있는부분의서열과 adaptor 서열사이에몰랐던부위의서열이위치하게됩니다. 첫번째 cdna 로부터알고있는서열의일부를 sense primer 로사용하여 adaptor primer 와함께 PCR 함으로서모르는영역을증폭할수있게됩니다. 이제품은별도의클로닝절차없이고효율의 full-length cdna 합성을가능하게합니다. www.enzynomics.com 3
원리 1) 5 RACE 원리 Step 1. 첫번째 cdna 가닥합성 첫번째 cdna 가닥은 gene-specific SP1 primer, TOPscript TM RT DryMix 를사용하여 total RNA 또는 poly(a)+ RNA 로부터합성됩니다. TOPscript TM RT DryMix 가사용되는이유는 다른역전사효소에비하여열안정성이뛰어나며 14 kb 까지의 mrna 를역전사할수있 기때문입니다. 따라서, 반응온도를 55 C 까지높일수있습니다. Step 2. cdna 정제 EZ-Pure TM PCR Purification Kit 로합성에참여하지않은 dntp 와 primer 를제거하여 첫번째 cdna 가닥을정제합니다. Step 3. Poly A-tail 추가 Terminal Deoxynucleotidyl Transferase 를이용하여 cdna 의 3 end 에 Poly A-tail 을붙입니다. 5 의번역되지않는 RNA 에서 G/C 염기비율이높은경향이있기때문에 Poly A- tail 을이용하여 Oligo dt-anchor Primer 에의한부적절한염기탈락가능성을낮춰야합니다. 또한, A/T 결합이 G/C 결합보다약하기때문에 Poly A-tail은 Oligo dt-anchor Primer 가 cdna 가닥에결합하기전에붙여야합니다. Step 4. 첫번째 PCR 증폭 Poly A-tail 이연결된 cdna 에서 gene-specific SP2 primer 와 Oligo dt-anchor Primer 를사용하여 PCR 증폭을합니다. Oligo(dT)-Anchor Primer 는 dt-stretch 의 3 end 에붙는 T nucleotide 가제외된 A, C, G nucleotide mixture 입니다. 이는 Oligo(dT)-Anchor Primer 가 poly(a)-tail 의 5 시작지점에결합하게하며, 따라서실제 poly(a)-tail 길이는 primer annealing 에영향을미치지않는다는것을의미합니다. Step 5. 두번째 PCR 증폭전단계에서얻은 cdna 는 nested, gene-specific primer SP3 을이용하여두번째 PCR 을통해증폭합니다. 결과적으로얻어진 5 RACE 의생성물은염기서열분석이나제한효소지도제작등의다음실험단계에필요한적절한 vector 에클로닝될수있습니다. www.enzynomics.com 4
V= A, C or G Figure 1. 5 RACE overview www.enzynomics.com 5
2) 3 RACE 원리 Step 1. 첫번째 cdna 가닥합성 첫번째 cdna 가닥은 Oligo(dT)-Anchor Primer 를이용하여 mrna 의 poly(a)-tail 에서부 터합성을시작합니다. 정제과정없이바로다음단계를진행합니다. Step 2. PCR 증폭 Gene specific SP5 primer 와 PCR anchor primer 를이용하여 PCR 증폭을수행합니다. V= A, C or G Figure 2. 3 RACE overview www.enzynomics.com 6
제품구성 EZ TM 5 /3 RACE PCR Kit Catalog # EZ025 Vial Components Quantity (10 rxn) 1 2 3 TOPscript RT DryMIX 10 tube TOPsimple PreMIX Forte 500 μl datp (2 mm) 25 μl 4 10X CoCl 2 100 μl 5 10X Terminal Deoxynucleotidyl Transferase buffer 100 μl 6 Terminal Deoxynucleotidyl Transferase (20 U/μl) 25 μl 7 Oligo d[t]-anchor primer (40 μm, 40 pmol/λ) 40 μl 8 PCR Anchor primer (10 μm, 10 pmol/λ) 40 μl 9 Sterile water (RNase free) 1 ml 보관조건 모든구성품 : -20 추가로필요한구성 - EZ-Pure TM PCR purification kit - Thermal block cycler www.enzynomics.com 7
염기서열정보 Component Oligo d[t]-anchor primer Sequence 5'-GACCACGCGTATCGATGTCGACTTTTTTTTTTTTTTTTV-3'..Mlu I, Cla I, Sal I site. PCR Anchor primer 5'-GACCACGCGTATCGATGTCGAC-3' 주의사항 1) cdna 합성에사용될모든실험기구를멸균하십시오. 2) RNA 를다루는실험단계에서는항상실험용장갑을착용하십시오. 3) 역전사반응에쓰이는모든시약은반드시완전히녹여사용하십시오. 4) 반응액은잘섞어주어야하며, 원심분리를짧게하십시오. 5) 얼음위에서실험을수행하십시오. Primer 제작 1) 5 RACE Primer 제작 ㆍ첫번째 cdna 합성을위해 SP1 을제작합니다. ㆍ첫번째 PCR 증폭을위해 SP2 를제작하며, SP1 보다상부에위치하도록해야합니다. ㆍ두번째 PCR 증폭을위해 SP3 를제작합니다. 2) 3 RACE Primer 제작 ㆍ Forward primer 인 SP5 를제작합니다. ㆍ 20-25 bp 의길이로제작하고 GC 염기함량이 50~60% 로구성되도록합니다. www.enzynomics.com 8
실험방법 1-1. 5 RACE 실험방법 주의사항 단일가닥 DNA 는이중가닥 DNA 에비해훨씬변질되기쉽기때문에, cdna 를실험에 곧바로사용하지않고보관하거나도중에실험을중단하지마십시오. 1) 첫번째 cdna 합성 이단계에서는 total RNA 나 poly(a)+ RNA 를시료로사용하여원하는 mrna 염기서열을 cdna 로합성합니다. 일반적으로, 실험을시작할때 total RNA 가시료로사용되지만 poly(a)+ RNA 를사용하면극소량의발현부위를얻는경우나 background 를감소시키는데이점이있습니다. 제공된구성품을정확히사용한다면높은 cdna 합성결과를얻을수있습니다. 1 아래의조성표대로구성성분을혼합하고원심분리를짧게합니다. Component TOPscript RT DryMIX cdna synthesis primer SP1 (10 μm, 10 pmol/λ) Total RNA 1 μg Sterile water Total volume Sample 1 tube 1 μl (10 pmol) x μl x μl 20 μl 2 55 에서 60 분간반응합니다. 3 85 C 에서 5 분간반응합니다. 4 짧게원심분리합니다. 5 EZ-Pure TM PCR purification kit 를이용하여 PCR 생성물을정제합니다 www.enzynomics.com 9
2) 첫번째 cdna 가닥의 poly(a) tailing 1 아래의조성표대로구성성분을혼합하고원심분리를짧게합니다. Component Volume 정제된 cdna 15 μl 10X TdT buffer 2.5 μl 10X CoCl 2 (Optional) 2.5 μl (Optional) 2 mm datp 2.5 μl Sterile water x μl Total 23 μl 2 94 C 에서 3 분간반응하고얼음위에곧바로올려놓습니다. 3 짧게원심분리합니다. 4 Terminal Deoxynucleotidyl Transferase (20 U/μl) 를 2 μl 넣습니다. 5 잘섞은다음 37 C 에서 20 분간반응합니다. 6 70 C 에서 10 분간반응하여 Terminal Deoxynucleotidyl Transferase 를비활성화시킵니다. 7 원심분리를짧게한다음얼음위에올려놓습니다. 3) da-tail 된 cdna 의증폭단계 1 아래의조성표대로구성성분을혼합하고원심분리를짧게합니다. Component da-tailed cdna TOPsimple PreMIX Forte Oligo d[t]-anchor primer (40 μm, 40 pmol/λ) Specific primer SP2 Sterile water Total volume Volume 5 μl 10 μl 1 μl (40 pmol) x μl (10 pmol) x μl 20 μl www.enzynomics.com 10
2 아래의조성표대로 PCR 을수행합니다. 최적의 PCR 조건은 DNA 와 primer 에따라결정됩니다. annealing 단계의온도를 primer 의 Tm 값에근접하게설정하십시오. Stage Temperature Time Cycles Initial denaturation 95 2 min 1 Denaturation 95 30 sec Annealing 55 30 sec 30 Elongation 72 30 sec Final elongation 72 5 min 1 3 PCR 생성물의 1 μl 를 PCR Anchor Primer 와 gene-specific primer SP3 를이용하여 두번째 PCR 을수행합니다. 4 필요에따라두번째 PCR (nested PCR) 을진행합니다. Gene-specific primer SP3 의 Tm 값에따라 annealing 단계의온도를 60 C 에서 65 C 까지올리십시오. Component PCR product TOPsimple PreMIX Forte PCR Anchor Primer (10 μm, 10 pmol/λ) Specific primer SP3 (10 μm, 10 pmol/λ) Sterile water Total volume Volume 1 μl 10 μl 1 μl (10 pmol) 1 μl (10 pmol) x μl 20 μl 5 첫번째와두번째 PCR 생성물의 20 μl 를 1% ethidium-bromide 에 staining 한 agarose gel 에서분석하십시오. 분석시, 일반적으로밴드하나만보여지나, 경우에따라서희미한다른밴드들이 보일수도있습니다. www.enzynomics.com 11
Figure 3. PCR products of 5'-RACE from HeLa total RNA 2-1. 3 RACE 실험방법 1) 첫번째 cdna 합성 1 아래의조성표대로구성성분을혼합하고원심분리를짧게합니다. Component TOPscript RT DryMIX Oligo dt Anchor Primer (40 μm, 40 pmol/λ) Total RNA 1 μg DEPC D.W Total volume Sample 1 tube 1 μl (40 pmol) x μl x μl 20 μl 2 55 C 에서 60 분간반응합니다. 3 85 C 에서 5 분간반응합니다. 4 원심분리를짧게합니다. 2) cdna 의 PCR 증폭 3 RACE 실험에서는별도의 cdna 정제과정없이곧바로증폭합니다. 반응액의 1 μl 를 PCR Anchor Primer 와 gene-specific primer SP5 를사용하여증폭합니다. 최적의 PCR 조건은 DNA 와 primer 에따라결정됩니다. Annealing 단계의온도를 60 에서 65 C 온도로설정하십시오. www.enzynomics.com 12
1 아래의조성표대로구성성분을혼합하고원심분리를짧게합니다. Component cdna product TOPsimple PreMIX Forte PCR Anchor Primer (10 μm, 10 mol/λ) Specific primer SP5 (10 μm, 10 pmol/λ) Sterile water Total volume Volume 1 μl 10 μl 1 μl (10 pmol) 1 μl (10 pmol) x μl 20 μl 2 첫번째와두번째 PCR 생성물의 20 μl 를 1% ethidium-bromide 에 staining 한 agarose gel 에서분석하십시오. Troubleshooting guide 원하는결과를얻지못한경우아래의문제해결방안을참고하십시오. 5 RACE 문제현상 생성물농도가 낮거나없는경우 문제원인과해결방안 1. 반응액오염반응구성성분의오염이있었는지확인하기위해 DNA template 과 primer 로일반적인 PCR 을시도하여 PCR 시스템은정상적으로갖 추어졌음을확인하십시오. 2. RNA 가변질되었거나순도가낮은경우 1% formaldehyde mini gel 에 RNA 를전기영동하여 18S, 28S 의 ribosomal band가정확히나오는지확인하십시오. 만약 RNA가변질되었거나순도가낮을경우 RNA를새로분리하십시오. 3. RNase 오염성공적인 DNA 합성은모든과정에서 RNase-free handling 이제대로갖추어져야가능합니다. RNase 오염이의심된다면 DNA 합성과정동안 RNase Inhibitor 를처리하십시오. 4. 오염에의해역전사반응이제대로일어나지않음. RNA 준비과정중에 phenol, lithium chloride, SDS 와같은역전사반응을방해하는요소가있었는지확인하십시오. www.enzynomics.com 13
5. Genomic DNA 에의해 RNA 가오염됨. RNA 준비과정중에 genomic DNA 오염이있었는지확인하십시오. 6. 정제조건이충분하지않음. 정제된 cdna 가제대로정제되지않았다면, 정제과정에이상이있는지확인하십시오. - 좀더많은양을얻기위해 agarose gel 정제된 PCR 생성물을 template 로사용하십시오. - 첫번째와두번째 PCR 사이에 EZ-Pure TM PCR Purification Kit Ver.2 (EP201-50N) 를사용하십시오. 7. 특정생성물농도가낮음특정생성물 band를확인하기위해내부염기서열을 Probe로이용하여 PCR 생성물을 Southern blot 분석하십시오 SP4 primer 와 PCR Anchor Primer 를이용하여두번째 PCR을시도하십시오. 8. 비특이적생성물이증폭됨. 비특이적밴드가안보일때까지 annealing temperature 를점차적으로올려보십시오. 9. 부적절한 cdna 변성이일어남 da-tailing 반응을진행하기전에 denaturation step 이제대로수행되었는지확인하십시오 (+94 C 에서 3분 ) 10. Poly(A) tailing 에불충분한반응시간 da-tailing 반응시간을 30 분까지증가시키십시오. 11. 부적절한 cdna 정제방법 EZ-Pure TM PCR Purification Kit 제품의실험방법을정확히따르십시오. 마지막 elution 전 washing 단계에서원심분리를 ~17900 x g 으로 1분간수행한후 flow-through 용액을버리고추가적으로 1분간원심분리를해야합니다. Filter tube 를완벽하게건조한후에 elution 하십시오. 그렇지않게되면남은 ethanol 에의해 da-tailing 반응이방해됩니다. www.enzynomics.com 14
A260nm 정량값이 너무높게나옴. 1. Filter tube 안의유리섬유일부가 DNA 와같이 elution 됨 1 Elution 된시료를담은 tube 를 1 분간초고속원심분리합니다. 2 상층액을분리합니다. 바닥에가라앉은유리섬유와섞이지않도 록주의하십시오. 3 260 nm 파장측정값에 320 nm 파장측정값을빼면정확하게알 수있습니다. 1. 잘못된 annealing 조건첫번째 PCR 증폭단계에서 annealing 조건이적합하지않았고 (i.e., anchor primer가불완전하게 annealing 되고, 5 poly(a) tail에붙지않았을경우 ), proofreading 기능이있는 polymerase가사용되었다면, 3 5 exonuclease 활성이 annealing 되지않은 3 의 non-t anchor 염 최종 PCR 생성물 5 부분에 dt 가붙음 기를제거했을가능성이있습니다. 2. 불충분한 cdna 정제 정확한 cdna 정제는합성되지못한염기를제거하기때문에매우중요한과정입니다. 이과정이제대로이루어지지않으면, 5 tailing 반응에서, A 염기보다는다른염기가 cdna 로합성되기쉽기때문에 Oligo-d(T) Anchor Primer가 5 poly(a) tail 내부에붙게되는것을야기합니다. 3 RACE 문제현상 문제원인과해결방안 1. 반응액오염 반응구성품들의오염이있었는지확인하기위해 DNA template 와 primer 로일반적인 PCR 을시도하여 PCR 시스템은정상적으로갖 RNA 시료의증폭이 추어졌음을확인하십시오. 되지않음. 2. RNA 가변질되었거나순도가낮은경우 1% formaldehyde minigel 에 RNA 를전기영동하여 18S, 28S 의 ribosomal band 가정확히나오는지확인하십시오. 만약 RNA 가변질되었거나순도가낮을경우 RNA 를새로분리하십시오. www.enzynomics.com 15
3. RNase 오염성공적인 DNA 합성은모든과정에서 RNase-free handling 이제대로갖추어져야가능합니다. RNase 오염이의심된다면 DNA 합성과정동안 RNase Inhibitor 를처리하십시오. 4. 오염에의해역전사반응이제대로일어나지않음. RNA 준비과정중에 Phenol, Lithium chloride, SDS 와같은역전사반 응을방해하는요소가있었는지확인하십시오. 5. Genomic DNA 에의해 RNA 가오염됨. RNA 준비과정중에 genomic DNA 오염이있었는지확인하십시오. 1. 특정생성물농도가낮음 특정생성물 band 를확인하기위해내부염기서열을 probe 로이용 하여 PCR 생성물을 Southern blot 분석하십시오 생성물의순도가 낮음. SP6 primer 와 PCR Anchor Primer 를이용하여두번째 PCR 을 시도하십시오. 2. 비특이적생성물이증폭됨. 비특이적밴드가안보일때까지 annealing temperature 를 점차적으로올려보십시오. www.enzynomics.com 16