Cover title Subhead GeneArt CRISPR GeneArt Precision TALENs 게놈편집이펼치는과학원더랜드 만화로만나는게놈편집의원리
sirna 실험은잘됐는데... 그러면이제유전자의기능을완전히억제하고싶은데... 1 화 : CRISPR 은손쉽다 CRISPR 에게맡겨봐! 내게염기서열만알려주면 knock out 을시켜버릴게! Gene editing( 게놈편집 ) 을이용하면특정유전자의기능을완전히 knock-out 이가능합니다. 이방법은세포나동물등에모두손쉽게사용할수있습니다. 2 Life Technologies Gene Editing
CRISPR CRISPR 은염기서열을인식하는 gdna 와실제절단을수행하는 Cas9 으로이루어져있어요. CRISPR 이란? 정식명칭은 CRISPR/CAS9 시스템으로특정염기서열에특이적으로결합하는 RNA(gRNA) 와특정한염기서열을자르는가위역할인 Cas9 nuclease 로구성되어있다 ( 그림 1). 세포나동물에 plasmid DNA 를도입하여특정유전자의기능을완전히억제할수있는 knock-out 이가능하다. CRISPR 이란? Genomic DNA 가절단된경우세포내에서는이를회복하기위해재조합및다양한기작들이발생하게된다. 이때한번절단된부위의염기서열중에서몇몇염기서열이소실되는현상이발생하게되며이를통해돌연변이가발생하게된다. 그결과로 DNA 코딩부위의프레임변화 (Frame Shift) 가발생하게되고발현되는단백질의아미노산염기서열에영향을미치게된다. 이렇게아미노산의염기서열이변하게되면단백질의기능을하지못하고이것을 Knock-out 이라고부른다 ( 그림 2). 만일 single-stranded DNA 외 CRISPR plasmid vector 를함께세포내에도입하게되면 homologous recombination 이일어나게되고새로운염기서열이도입된다 ( 그림 2). grna PAM Target sequence 그림 1. CRIPR 은크게 2 가지로구성되어있다. 염기서열을인식하는 grna 와실제로유전자를절단하는 Cas9 Nuclease 로구성되어있다. Genomic DNA PAM 절단 Cas9 손쉽게 CRISPR 을이용해볼수있습니다. GeneArt CRISPR Nuclease Vector Kit 는모든것들이하나에들어있는시스템이다. 디자인한 grna 를목표로하는염기서열에상보적이며이를세포내에도입만하면된다. Orange Fluorescent Protein(ORF) 혹은 CD4 유전자를 report gene 으로사용하고있으며 ( 그림 3) 이는도입효율을확인하고발현여부를확인하기쉽게되어있다. CD4 의경우 magnetic anti- CD4 항체를이용하여손쉽게분리해낼수있다. ORF 를발현하는경우 FACs 를이용하여발현되는세포를쉽게분리해내어원하는 clone 을얻는데많은도움을줄수있다 ( 그림 4). lifetechnologies.com/crispr 에서확인해보세요. NHEJ (non-homologous end joining) HT(Homologous recombination) Donor DNA 그림 2. 절단된염기서열은크게 2 가지형태로나타낼수있다. 잘린염기서열은 NHEJ(non-homologous end joining) 을통해복구되는과정에서 frame shift 가일어나 Knock-out 이가능하며혹은 donor DNA 를함께도입하여 homologous recombination 을이용하여새로운염기서열을도입할수있다. CD4 혹은 OFP enrichment 혹은 GeneArt CRISPR / Cas9 플라스미드가도입된세포 CD4 혹은 OFP 를발현한다 그림 3. GeneArt CRISPR Nuclease Vector map. 잘린염기서열은 NHEJ(non-homologous end joining) 을통해복구되는과정에서 frame shift 가일어나 Knock-out 이가능하며혹은 donor DNA 를함께도입하여 homologous recombination 을이용하여새로운염기서열을도입할수있다 그림 4. GeneArt CRISPR Nuclease Vector map. GeneArt CRISPR / Cas9 플라스미드를도입하게되면세포는 gene editing 이일어나게되며이러한세포들은 OFP 혹은 CD4 를발현하게된다. 이를 Enrichment 하여세포의선별이더욱쉽게할수있다. Life Technologies Gene Editing 3
Genome editing 이재미있는거구나. 근데 CRISPR 과 TALENs 는뭐가다른거야? 2 화 : TALENs 는정확하다 TALENs 등장! CRISPR 과는다르게단백질이특정염기서열을인지하죠! Knock-out 할때에 TALENs 는두개의단백질이필요하답니다! TAL 의단백질은가이드역할만하죠. 만일 TAL effector 를이용하며다른기능을가진단백질을융합시켜다양한기능을구현할수있답니다. 4 Life Technologies Gene Editing
TALENs TALEN 란? 정식명칭은 TAL effector nuclease 라고하며 FokI 이라는절단을유도하는 nuclease 와그리고특정염기서열을인지하는단백질로이루어진다. CRISPR 과는다르게 Reverse 와 Foward, 2 개가쌍으로있어야지만작동이가능하다. TALENs 는 DNA 절단시더높은특이성을보여준다. 라이프테크놀로지스에서는 entry vector 형태로제공이되며이를 gateway cloning 시스템을이용하여손쉽게클로닝이가능하다. TALENs 는특정염기서열을인지하는단백질에절단을수행하는 FokI 과결합한단백질입니다. 손쉽게 TALENs 를디자인해볼수있습니다지금 lifetechnologies.com/geneart 에접속하시면손쉽게 TALENs 디자인하고주문하실수있다. 다양한기능들을추가하여사용할수있습니다 TAL effector nuclease 와같이 FokI 을이용한 knock-out 뿐만아니라다양한작용기를융합시켜다양한기능을구현할수있다. TALENs 을이용시에는 2 개쌍의염기서열을인식하는유전자가필요합니다. 그림 5. TALENs 의작용. TALENs 는유전체의염기서열을인식하는도메인과 FokI 이쌍을이루어작동하게된다. lifetechnologies.com/tal 에서확인해보세요. 그림 6. TALENs 의작용. TAL effoector 는다양한기능을부여하여다양한작용을유도할수있다. DNA binding domain Functional domain Fok1 Fok1 (A) TALENs, FokI 을이용하여특정유전체염기서열을잘라내어 knock-out 을유도한다. (B) TAL effector 에는 VP64, VP16 을추가하여유전자를활성시키거나 KRAB 를선택하여유전자의활성을억제할수있다. (C) TAL effector 에 MCS(Multi cloning site) 를넣어내가원하는유전자를넣어그기능을연구할수있다. Genetic editing 관련제품및서비스소개 Product GeneArt CRISPR Nuclease Vector with CD4 Enrichment Kit (with competent cells) GeneArt CRISPR Nuclease Vector with CD4 Enrichment Kit GeneArt CRISPR Nuclease Vector with OFP Reporter Kit GeneArt CRISPR Nuclease Vector with OFP Reporter Kit (with competent cells) Native TAL Fok1 Truncated TAL Fok1 Native TAL VP16 activator Native TAL VP64 activator TAL repressor Native TAL MCS Truncated TAL MCS Cat. No. A21177 A21175 A21174 A21178 서비스문의서비스문의서비스문의서비스문의서비스문의서비스문의서비스문의 Life Technologies Gene Editing 5
TALENs 와 CRISPR 은어떻게사용해야할까요? TALENs 의경우 CRISPR 보다는 off-target effcet 가낮으므로특이적인반응을원하고자하실때사용하는게좋습니다. 또한, TAL 의경우융합단백질의기능에따라다양한기능을시도해볼수있습니다. 하지만하나가아닌다양한유전자에 gene editing 을하거나아니면손쉬운 gene editing 을원하시고자하면간편하고사용하기쉬운 CRISPR 을이용하는것이좋습니다. CIRSPR 은 20bo 의 RNA 로이루어졌으며 3' 말단의 NGG - "PAM site" 를가지고있습니다. 이러한 RNA 가특정염기서열을인식하고 CRISPR 의기능을유도하게할수있습니다. 또한 CRISPR 은클로닝하기쉽고사용하기쉬우면다양한실험에적용할수있습니다. 그러나 TALENs 보다 off-target effct 라불리는비특이적반응을일으킬위험이높습니다. TALENs 는 CRISPR 보다는좀더특이적반응을하는것으로알려져있습니다. 그이유는 TALENs 가작동하기위해서는쌍으로작동하기때문입니다. 또한 genome editing 이후에다양한기능을가진도메인을이용하여다양한실험도가능합니다. 여러분들은 GeneArt Precision TALs 의무료디자인도구를이용하여이를쉽게디자인할수있습니다. 나머진클로닝등의일은라이프테크놀로지스가해결해드립니다. 연구자 ( 직업 : 연구원, 27 세?) Genetic editing 이제일쉬웠어요 ~~ Mutation 이되었다면그걸어떻게확인할수있나요? 돌연변이효율을확인하기위해서는 double strand DNA mismatch 를확인하게됩니다. 이경우 mismatch 된 DNA 를인직하여제한하는효소를사용합니다. 이러한방법은대상 DNA 부의의 genome 에대한 PCR 을수행하게됩니다. 만일유전자의염기서열이추가되거나혹은제거되었다면 annealing 과정에서 mismatched doublestranded heteroduplex 가형성됩니다. 이러한 mismatch 가얼마나이루어졌는가는이러한 mismatch 를특이적으로인지하여제한하는효소를처리하여이를전기영동하여확인해볼수있습니다. 여러분들은 GeneArt Genomic Cleavage Detection kit 를이용하면 PCR 이후의정제과정을줄이고더욱쉽게 mutation 된 clone 이나혹은효율을확인해보실수있습니다. 자세한내용은옆에서박사님이설명해줄거에요! 성공적인 Knock-out 혹은 Knock-in 은어떻게확인할수있나요? 직접모든염기서열을확인해볼수있습니다. 다양한돌연변이형태나염기서열형태가나타날수있습니다. 대상 genome 부위를 PCR 을이용하여증폭하여이를 cloning 하여직접염기서열이어떻게바뀌었는지를확인해볼수있습니다. 또한발현패턴을분석해볼수도있으며최신기술을이용한다면차세대염기서열분석 (Next Generation Sequencing, NGS) 를이용해볼수도있답니다. 라이프테크놀로지스에서는이러한실험에 IonTorrent PGM 을추천합니다. Knock 은어떻게할까요? 유전자합성서비스를이용하면 donor DNA Plasmid 를만드는건어려운일도아니랍니다. 일반적으로 Knock 을위해서는 500-600bp 정도의상보적인염기서열 (arm) 을가진 donor plasmid DNA 가필요합니다. 이러한 double stranded DNA 절편은 GeneArt 의유전자합성서비스를이용할수있습니다. GeneArt Strings DNA Fragment 는단순히염기서열정보만알고있으며이를합성하여간편하게이용할수있답니다. 6 Life Technologies Gene Editing
Genetic editing 에서일반적으로 transfection 과 clone 선별이중요한데 mismatch PCR 방식은아주간단하지. 옆에만봐도쉬워보이잖아 Transfection 은 Lipofectamione 3000 을이용하면높은효율을보여줄수있어. 또한모든서비스는맞춤형으로디자인부터 transfection 이가능한플라스미드형태로도구매도가능해. CRISPR 과 TALENs 모두원하는대로제작도가능하지. 지금한번시작해봐. 어렵지않아! 1 세포용해 ( 정제과정이필요없다 ) 2 PCR 증폭 (PCR 산물의정제불필요 ) Indel Transfected cells with GeneArt Precision TAL or GeneArt CRISPR nuclease vector Indel in genomic DNA 세상참좋아졌어 ~ 3 Denature 이후 reannealing Mismatch 4 Mismatch 확인과절단 5 아가로즈전기영동으로밴드확인 Enzyme: Target 1 Target 2 Negative Positive control control + - + - + - + - Gene modification (%) 10.8 21.1 38.9 그림 6.Mismatch 를이용한 mutation 탐색. GeneArt Genomic Cleavage Detection Kit 워크플로우 Lipofectamine 3000 으로향상된결과를만나보세요 Lipofectamine 3000 은최근에출시된양이온지질의기반의유전자전달방식입니다. 기존제품보다더높은유전자도입효율을보여주며유전자도입이어려운세포에서도높은효율을보여줍니다. CRISPR 과 TALENs 를사용할때에도 Lipofectamine 3000 을이용하면더높은 knock-out 효율및 gene editing 효과를얻을수있습니다. 주문정보 Product GeneArt Genomic Cleavage Detection Kit Lipofectamine 3000 Transfection Reagent Cat. No. A24372 L3000015 Life Technologies Gene Editing 7
Genome editing 을지금시작해보세요 lifetechnologies.com/geneeditingcomics 에서확인해보세요. For Research Use Only. Not for use in diagnostic procedures. 2014 Thermo Fisher Scientific Inc. All rights reserved. All trademarks are the property of Thermo Fisher Scientific and its subsidiaries unless otherwise specified.