구절초 ( 九折草 ) 의감별자료집 Discrimination of Chrysanthemi Zawadskii Herba

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1 구절초 ( 九折草 ) 의감별자료집 Discrimination of Chrysanthemi Zawadskii Herba

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3 구절초 ( 九折草 ) 의감별자료집 CONTENTS 1. 기원및배경 / 5 2. 유전학적연구 / 8 3. 이화학적연구 / 참고문헌 / 43

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5 1 기원및배경 1) 기원 구절초 ( 九折草 ) 는국화과 (compositae) 생약으로서 대한민국약전외한약( 생약 ) 규격집 (KHP) 1) 에등재된품목으로, 그기원을 구절초 Chrysanthemum zawadskii Herbich var. latilobum (Maxim.) Kitamura 또는산구절초 Chrysanthemum zawadskii var. coreanum (Nakai) ( 국화과 Compositae) 의전초 로규정하고있다. 중화인민공화국 약전 (ChP), 일본약국방 (JP), 대만중약전 (THP), 홍콩중약재표준 (HKCMMS), 베트남 약전 (VP) 및조선민주주의인민공화국약전 (DP) 에는본생약이등재되어있지않다. 구절초 (Chrysanthemum zawadskii complex) 는동유럽에서아시아에걸쳐속내에서 가장넓게분포하는분류군으로다양한형태학적변이를가지는종내분류군들로 구성되어있다. 2) 국내에분포하는구절초무리에대해서는 Palibin이최초로 Chrysanthemum sibiricum Fisch. 를보고한이래로, 3) Nakai는새롭게 4종 2변종을 인식했다. 4-7) Kitamura는이전의분류체계와달리 C. sibiricum을 C. zawadskii Herbich로변경하고 Nakai가인식한 C. lucidum Nakai와 C. coreanum (H. Lév.) Nakai를 C. zawadskii의이명으로처리했다. 8) 그후 Kitamura는광의의국화속에서 삭과의횡단면이원주형으로물에젖으면점성을띄는특징을가지는식물들을협의의 국화속 (Dendranthema) 로구별하는견해를보이면서구절초무리역시 D. zawadskii (Her.) DC. 로학명을변경하였다. 9) 그러나최근에는다시 Chrysanthemum 으로속명이 변경되었다. 10,11) 대한민국약전외한약 ( 생약 ) 규격집에등재된구절초의학명은 C. zawadskii Herbich var. latilobum (Maxim.) Kitamura으로, 일본식물지에서도이와동일한학명을사용 하고있으나, 12) 국가표준식물목록과 13) 속식물지 (The Genera of Vascular Plants of Korea) 에서는 14) Kitamura가세분한속명인 Dendranthema를채용하고있으며, 중국 식물지에서는 15) 구절초를 C. naktongense Nakai로기재하여, 산구절초와별개의종으로 인식하고있다. Discrimination of Chrysanthemi Zawadskii Herba 5

6 대한민국약전외한약 ( 생약 ) 규격집에등재된산구절초의학명은 C. zawadskii var. coreanum (Nakai) 로, 정확한명명자를기재하지않아그출처가불분명하여확인할수없었다. 다만이와유사한학명으로는 C. zawadskii Nakai subsp. coreanum Y.N.Lee이있었으며, 16) 이는기존 Nakai가발표한한라구절초 C. coreanum를 C. zawadskii의아종으로인식한견해로, 산구절초의학명으로사용하기에적절하지못하다. 현재산구절초로인식되고있는분류군의학명은국가표준식물목록과속식물지, 일본식물지에서구절초무리의본종인 D. zawadskii var. zawadskii (Herb.) Tzvelev로인식되고있고, 중국식물지에서는구절초 C. naktongense Nakai와별개의종인 C. zawadskii Herbich로기재하고있다. 2) 배경및규정 (1) 국내산지및생산량 구절초 ( 九折草 ) 의기원인구절초 Chrysanthemum zawadskii Herbich var. latilobum (Maxim.) Kitamura 또는산구절초 Chrysanthemum zawadskii var. coreanum (Nakai) 는국내전역에흔히자생하는식물로도매유통단가에대한통계는있으나, 재배에관련된통계는제공되지않는것으로보아, 채집품또는수입에의존하는것으로보인다. (2) 공정서성상 1 구절초 ( 九折草 : Chrysanthemi Zawadskii Herba) 구절초 ( 九折草 ) 는대한민국약전외한약 ( 생약 ) 규격집에등재되어있으며, 구절초 Chrysanthemum zawadskii Herbich var. latilobum (Maxim.) Kitamura 또는산구절초 Chrysanthemum zawadskii var. coreanum (Nakai) ( 국화과 Compositae) 의전초를기원으로하며, 그성상을다음과같이규정하고있다. 이약은전초로줄기는둥글고길이 20 ~ 40 cm이며회록색 ~ 회갈색이다. 잎은달걀모양 ~ 넓은달걀모양으로줄기에어긋나게달려있고, 길이 3 ~ 4 cm, 너비 2 6 구절초 ( 九折草 ) 의감별자료집

7 ~ 3 cm로깊게갈라졌으며, 잎자루는길이 1 ~ 2 cm이다. 꽃은두상화로지름 2 ~ 6 cm이고, 설상화는흰색이고, 관상화는노란색이다. 이약은특유한향기가있고맛은약간쓰다. 2 함량기준 대한민국약전외한약 ( 생약 ) 규격집 (KHP 4) 에서는함량기준이설정되어있지않다. Discrimination of Chrysanthemi Zawadskii Herba 7

8 2 유전학적연구 1) 실험방법 (1) DNA 추출 DNA 추출은건조한검체약 100 mg을막자사발에넣고액체질소를사용하여미세분말상태가되도록분쇄한다. 분말시료를 2 ml 튜브에옮겨담고, 500 µl의 lysis buffer(20 mm Tris-cl ph 8.0, 2 mm Sodium EDTA, 1.2 % Triton X-100, lysome 20 mg/ml) 에넣고 proteinase K 용액 (600 mau/ml 이상 ) 10 µl를첨가한후, 37 항온기에서 1시간반응시킨다음, 400 µl의 CTAB (Cetyl-trimethylammonium Bromide) 완충용액 (0.1 M Tris, ph 8.0; 1.4 M NaCl M EDTA, ph 8.0; 2% hexadecyltrimethylammonium bromide; 0.2 % 2-mercaptoethanol) 을첨가하고 65 항온기에서 30 분간처리한다. 이반응물에 Phenol : Chloroform : Isoamylalcohol (25 : 24 : 1) 600 µl와정제수 300 µl를첨가하여완전히섞이도록흔들어준다음 rpm으로 20 에서 10 분간원심분리한다. 상층액 600 µl를취하여새로운 1.5 ml 튜브에넣고이소프로판올 600 µl을첨가한다음수차례교반한뒤 10 분간상온에서반응시킨후 14,000 rpm으로 20 에서 10 분간원심분리한다. 침전된 DNA를 70% 에탄올 500 µl로 2 3회세척하고상온에서자연건조시킨다. 건조된 DNA를 µl 멸균된 3차정제수에녹여 4 에서 1 시간동안방치한후 RNase(100 mg/ml, 7,000 units/ml) 2 µl를넣고, 37 조건에서 30분동안반응시킨다. 추출된 DNA를 1% agarose 겔에서전기영동하여확인한후 DNA 순도및농도를측정한다음증류수로희석하여정량한다. 8 구절초 ( 九折草 ) 의감별자료집

9 (2) PCR * 본연구에이용된바코드프라이머는아래의 < 표 2> 와같이문헌조사를통해얻어진바코드프라이머중 CBOL (Consortium for the Barcode of Life) 에서제안한 7개엽록체 DNA 부위의바코드프라이머와중국의과학연구원에서제안한핵내 45s rdna의 ITS2 부위의바코드프라이머를이용하였다. 이들 9개의프라이머세트로분석한결과에서종감별에이용할수있는종간차이점이없을시에는 trnl-trnf 구간의 intron과 spacer 구간의프라이머를이용하여추가적인분석을진행하였다. 바코드프라이머를이용한 PCR의조성은상용화된 PCR premix에 Forward primer(10 pmole) 1 µl, Reverse primer(10 pmole) 1 µl와정량한주형 DNA 20 ng/µl를혼합하고, 정제수를첨가하여최종반응용량을총 20 µl로한다. 반응조건은 94 에서 3 분간예비변성 (predenaturation) 한후 94 에서 30 초변성 (denaturation), 52 에서 30 초간결합 (annealing), 72 에서 30 초간증폭 (extension) 하고변성부터증폭까지의과정을 35 회반복한다음, 72 에서 5 분간최종증폭 (final extension) 을시켜 DNA 증폭산물을얻는다. PCR 결과물의상태에따라결합온도는 의범위에서조절한다. DNA 증폭산물은 2 % agarose 겔에점적하여전기영동한다음 Ethidium bromide 염색법이나, 형광염료 (Fluorescence Dye) 로처리하여증폭산물을확인하고, 다형성이확인되면종감별에이용한다. * Polymerase Chain reaction Discrimination of Chrysanthemi Zawadskii Herba 9

10 < 표 >. 구절초의기원확인에이용된 DNA 바코드프라이머 Target region Primer Primer Sequence rpoc1* rpoc1_2f rpoc1_4r GGCAAAGAGGGAAGATTTCG CCATAAGCATATCTTGAGTTGG Coding region matk* matk* matk_2f matk_3r 3F_KIM f 1R_KIM r ATGCAACGTCAAGCAGTTCC CCGTATGTGAAAAGAAGTATA CGTACAGTACTTTTGTGTTTACGAG ACCCAGTCCATCTGGAAATCTTGGTTC rbcl* rbcla_r rbcla_f GTAAAATCAAGTCCACCRCG ATGTCACCACAAACAGAGACTAAAGC cpdna atpf-atph* trnh-psba* atpf f atph r psba3 F trnhf_05 ACTCGCACACACTCCCTTTCC GCTTTTATGGAAGCTTTAACAAT GTTATGCATGAACGTAATGCTC CGCGCATGGTGGATTCACAATCC Non-coding region psbk-psbi* trnt-trnl** psbk f psbi r trn a trn b TTAGCCTTTGTTTGGCAAG AGAGTTTGAGAGTAAGCAT CATTACAAATGCGATGCTCT TCTACCGATTTCGCCATATC trnl-intron** trn c trn d CGAAATCGGTAGACGCTACG GGGGATAGAGGGACTTGAAC trnl-trnf** trn e trn f GGTTCAAGTCCCTCTATCCC ATTTGAACTGGTGACACGAG nrdna ITS2_1*** ITS2_2*** ITS2F ITS3R ITS3 ITS4 ATGCGATACTTGGTGTGAAT GACGCTTCTCCAGACTACAAT GCATCGATGAAGAACGCAGC TCCTCCGCTTATTGATATGC *, CBOL; A CBOL Plant working group (2009) A DNA barcode for land plants. Proc Nati Acad Sci USA. 106(31): **, trnt-trnl; trnl-intron, trnl-trnf; Taberlet P et al. (1991) Universal primers for amplification of three non-coding regions of chloroplast DNA. Plant Molecular Biology 17: ***, ITS2, Chen S. et al. (2010) Validation of the ITS2 Region as a Novel DNA Barcode for Identifying Medicinal Plant Species PLOS one. 7;5(1) e 구절초 ( 九折草 ) 의감별자료집

11 (3) 염기서열분석염기서열분석은바코드프라이머를통해얻어진 PCR 산물을정제하여염기서열분석전문업체에의뢰하여진행하였고, 분석된결과는 Bioedit 및 MEGA 5.1 프로그램을사용하여정렬하였다. 각기원식물에대한염기서열분석결과를바탕으로 SNP (Single Nucleotide Polymorphism), SSR (Simple Sequence Repeat) 및 indel(insertion and Deletion) 등의염기서열차이를분석하여종간의차이점을확인하였다. 또한본연구에사용된바코드프라이머에서 PCR 결과물의다형성이없는품목에대해서는종감별프라이머를제작하기위해얻어진염기서열분석결과에서반복염기서열 (repetitive sequence) 이나, 단일반복염기서열 (poly-sequence) 이있는부분을피해서종감별을위한프라이머를제작하고자하였다. (4) 계통수작성 염기서열분석결과는 MEGA 5.1 프로그램을사용하여계통수를작성하고종감별및종간의유연관계를분석한다. 1 쌍거리비교법 (pairwise distance) 개체별, 종별염기서열의쌍거리비교 (pairwise distance) 는 MEGA 5.1 을사용하여 Kimura 2-parameter 모델로계산한다. 2 이웃연결계통수 (Neighbor joining tree, NJ) 이웃연결분석법 (NJ) 은각염기서열간의유사도를이용하여분석하는방법으로 MEGA 5.1 또는 PAUP version 4.0b을이용하여구한다. Kimura 2-parameter 모델을이용하며, 염기전환 (transversion) 과염기전이 (transition) 의치환을포함한다. Gap이나 missing data는무시하고 codon position은첫번째, 두번째, 세번째및비암호서열부분 (non-coding site) 을포함한다. Discrimination of Chrysanthemi Zawadskii Herba 11

12 (5) 차세대염기서열분석 (NGS) 연구방법 < 그림 >. 엽록체분석을위한흐름도 1 Miseq 용라이브러리제작 llumina Miseq용 Library construction: Covaris (S220) 를이용하여 peak power (175), duty factor (7.0), cycles/burst (200), time (50초), volume (50 ul) 조건하에 200 ng의 DNA를 550 bp 크기로 shearing 한다. 이후 Fragmented DNA를 Illumina TruSeq Nano DNA Sample Prep Kits의매뉴얼에따라 library로제작한다. 간단히요약하면, DNA를 magnetic bead를이용하여 clean up 한후 end repair 및 size selection 을수행한다. Size selection은 magnetic bead를이용하여 DNA의평균 size가 550bp가되게한다. DNA 3 쪽에 adenylation 시킨후 adapter를 12 구절초 ( 九折草 ) 의감별자료집

13 ligation 한다. 잔여 adapter를제거하기위해 magnetic bead를사용하고, 바로 DNA를증폭하기위해 PCR (8 cycles) 를수행한다. PCR 산물을 magnetic bead로 clean up 한후 library가정상적으로제작되었는지 bioanalyzer (Agilent) 로확인한다. 2 대용량염기서열분석가 Quantitative PCR - Phix (standard) 이용한 library 정량나 Sequencing - Instrument : Illumina Miseq - Kit : MiSeq Reagent Kit v3 (600 cycle) - Miseq run : 2x300 paired end read 다방법 : 5ul의 library와동량의 0.2N NaOH를섞어실온에 5분방치하여 DNA를 denature 시킨다. MiSeq Reagent Kit v3 에들어있는 1 ml의 pre-chilled HT1을 denature 된 DNA에첨가한다. 1 ml 중 600 ul를 reagent kit에넣은후기기를작동시켜 sequencing을수행한다. 3 시퀀스서열품질확인 4 Chloroplast genome de novo assemble 식물의엽록체를조립하는방법으로 shotgun sequencing 서열의초기조립을통해조립된 contigs로부터엽록체와관련된 contigs만을수집하여메꿔지지않는 gap을 closing하는과정을수행하는방법이있으며, metagenome에서관심있는미생물의유전체를조립하듯관련서열만을추출하여 subsets을만들고이들만을가지고 assemble을수행하는방법이있다. 본조립은후자의방법을통하여빠르게진행한후, 조립된염기서열에 raw data 서열을 mapping하여확인하는방법으로진행한다. 생산된서열데이터를 de novo assembly하기위해품질이좋은서열만을선별하고아답터를제거하기위한품질및 trimming 분석을진행한다. Discrimination of Chrysanthemi Zawadskii Herba 13

14 5 레퍼런스 Gap closing 조립하고메꿔지지않은 gap을 closing하기위하여 IMAGE (Tsai et. al., Genome Biology, 2010) 프로그램을이용하여 gap을 closing한다. 또한, manual curation을통하여 mate 정보가깨지는지역을강제로끊어 contig를나눈다. 이후, contig end에존재하는 single reads의 mate reads를 in house scripts를이용하여추출하여 assemble하고 end를확장하여 gap을 closing한다. 최종적으로, 조립된유전체정보에서열을다시 mapping하여 mate 정보가문제없이 alignment 되는지확인한다. < 그림 >. IMAGE 프로그램의진행개요도 6 Chloroplast genome 유전자지도작성 (Bioinformatic tool 을이용한 Chloroplast 특이성분석 ) 차세대유전자염기서열기법으로생산되어어셈블이완료된서열에대해 CpGAVAS (Chloroplast Genome Annotation, Visualization, Analysis and GenBank Submission 14 구절초 ( 九折草 ) 의감별자료집

15 Tool) 소프트웨어를이용하여해당엽록체에대한지도를작성하고 annotation 작업을수행한다. 7 완성된유전체비교분석및바코딩마커개발 8 분석식물의유전체비교분석가기원식물엽록체유전체서열을바탕으로각종과근연종간에유전조성의차이를비교분석함나염기서열과유전자정보를바탕으로다양한비교분석프로그램을이용하여 pair-wise alignment, multi-alignment 수행다엽록체염기서열 divergence를분석하여각각고유종의특이적인염기서열변이를동정하고유전자정보의차이를비교분석 9 유전자변이탐색을통한바코드후보지역발굴가종간엽록체유전체서열간다양성 (SSR, SNP, Indel) 정보의비교분석을통한마커개발나대표식물과근연종간에다양성분석을통한유연관계확인다식물엽록체유전체, rdna 정보분석방법을통한각종별엽록체, rdna 서열의완전해독을이루고동시에다양한변이를공통으로보이는지역을판별하여이를이용한종구분방법개발 10 종특이적마커선발가유전체정보를바탕으로종간차이를보이는바코딩마커중다양한근연종을포함하여동시에기원종을식별할수있는바코딩마커선발나각각의생약별로근연종혹은속식물 10개를비교분석하여기원종을식별할수있는바코드선발 11 선발된마커를사용한적용성테스트선발된마커를직접샘플에적용하여기원종감별정도를확인하고최종적으로마커를선별해낸다. Discrimination of Chrysanthemi Zawadskii Herba 15

16 2) 실험결과분석 (1) 구절초 ( 九折草, Chrysanthemi Zawadskii Herba) 의유전자분석가구절초 (Chrysanthemum zawadskii var. latilobum) 구절초에서 5개바코드구간의염기서열을분석한결과 matk와 atpf-atph, trnh-psba에서각각 2 가지 haplotype의종내변이가확인되었다. matk의 haplotype은 398 bp에서 G / T의염기전환 (transversion), atpf-atph의경우 246 bp와 769 bp에서각각 C / T, T / A의염기전환 (transversion) 및염기전위 (transition) 을보였고, trnh-psba는 65-71bp 사이의 AGTTACT 염기삽입및손실 (indel) 과 162 bp에서 A / C의염기전환인종내변이를보였다. < 그림 >. 구절초 matk 와 atpf-atph, trnh-psba 구간에서보이는 2 가지 haplotype 나산구절초 (Chrysanthemum zawadskii Herbich) 산구절초에서 5개바코드구간의염기서열을분석한결과 matk에서는 3가지의 haplotype, atpf-atph와 trnh-psba는종내변이에의해 2가지의 haplotype 확인하였다. matk 구간은 256, 398, 690 bp에서각각 G / G / A, T / G / G, A / G / A의염기서열변이를보이며 3가지의 haplotype으로나뉘었다. atpf-atph의 haplotype은각각 bp에서 AAAA / TTTT 염기서열을가지고, trnh-psba는 166 bp에서 16 구절초 ( 九折草 ) 의감별자료집

17 A / T 의염기전위를보이며 2 가지의 haplotype 을보였다. < 그림 >. 산구절초 matk 구간 (A) 와 atpf-atph(b), trnh-psba(c) 에서보이는각각의 haplotype 3) DNA 바코드를이용한구절초의기원종감별 (1) 구절초와산구절초의바코드구간분자유전학적분석 구절초의기원식물인구절초, 산구절초를구별하기위해엽록체 DNA와핵리보솜 DNA의 ITS 구간에대한바코드분석을진행하였다. 실험결과가장긴염기서열을가진구간은 matk (755 bp) 이고가장짧은구간은 ITS2 (472 bp) 이었다. 가장큰변이 (variable site) 를보이는구간은 atpf-atph (1.07%) 이고유전적거리 (P-distance) 가큰구간은 matk (0.002) 와 atpf-atph이었다. < 표 >. 구절초의염기서열분석결과 matk rbcl atpf-atph psba-trnh ITS2 Aligned (bp) Conserved Variable (%) 8 (1.06) 0 (0) 6 (1.07) 1 (0.2) 2 (0.42) P-distance (mean) (0.002) (0.002) (0.001) 0 Discrimination of Chrysanthemi Zawadskii Herba 17

18 그러나분석한 5개구간모두에서거의동일한염기서열을보여구절초와산구절초, 두기원종을구별할수없었다. rbcl을제외한 4개구간 (matk, atpf-atph, psbatrnh 및 ITS2) 에서변이가나타났지만두종을구별할수있는종특이적인변이는아님을확인하였다. 그리고 matk와 atpf-atph는다른구간에비해유전적거리가크게나타났지만이역시종을구별할수없었다. (2) 구절초와산구절초의 DNA 바코드구간유연관계분석 18 구절초 ( 九折草 ) 의감별자료집

19 < 그림 >. 구절초와산구절초의 NJ 분석결과. (A) matk, (B) rbcl, (C) atpf-atph, (D) trnh-psba 및 (E) ITS2 구절초의 NJ 분석결과, matk, atpf-atph, psba-trnh, 3 구간은구절초와산구절초각분류군별로그룹이나누어지지않는결과를보였다. rbcl과 ITS2의경우구절초와산구절초의염기서열이모두동일하여구별할수없었다. 즉, 구절초는분석된 5개의모든구간에서구별할수없음을확인하였다. 본과제는 DNA 바코드를사용하여명확히동정된샘플을이용해차세대염기서열분석 (NGS) 을진행하고자하였다. 4) 구절초의차세대염기서열분석결과 (1) 구절초와산구절초의차세대염기서열분석결과 DNA 바코드로구별하기어려웠던구절초기원종의명확한분류기준을설정하기위하여엽록체유전체에대한차세대염기서열분석 (NGS) 을수행하였다. 차세대염기서열분석 (NGS) 은강원대학교식물자원보존연구센터에서대여한표본중구절초 ( 샘플번호 15D45) 와산구절초 (15D59) 를대상으로분석진행하였다. 1 구절초 (Chrysanthemum zawadskii var. latilobum) 구절초는평균길이 251 bp로추출된엽록체서열에해당하는엽록체 read의개수가 1,109,736으로총 278,543,736 bp 염기서열이엽록체서열로추출되었다. 이렇게일차적으로추출된엽록체염기서열을 de novo assembly 한결과 3개의 contig로구분되었으며, gap closing을통해서열을 mapping 하여최종 150,991 bp의엽록체유전체를완성하였다. Discrimination of Chrysanthemi Zawadskii Herba 19

20 2 산구절초 (Chrysanthemum zawadskii Herbich) 산구절초는평균길이 251 bp로추출된엽록체서열에해당하는엽록체 read의개수가 1,308,839로총 328,518,589 bp 염기서열이엽록체서열로추출되었다. 이렇게일차적으로추출된엽록체염기서열을 de novo assembly 한결과 1개의 contig로구분되었으며, gap closing을통해서열을 mapping 하여최종 150,043 bp의엽록체유전체를완성하였다. 구절초와산구절초두분류군의엽록체유전체는원형이고 Large single copy (LSC), small single copy (SSC) 와한쌍의 inverted region (IRa, IRb) 로구성되어있었다. 먼저구절초의각구조의길이는 LSC 82,771 bp, SSC 18,309 bp, IR 24,954 bp이었다. 총유전자수는 107개이고 protein coding gene 80개, trna 23개, rrna 4개로구성되어있었다. 산구절초는 LSC 82,826 bp, SSC 18,310,bp, IR 24,952 bp이었다. 총유전자수는 107개이고 protein coding gene 80개, trna 23개, rrna 4개로구절초와동일하게구성되어있었다. 가샘플품질확인 Trinean을이용하여 1차로 DNA의양과질을조사한후 Picogreen assay를통해보다정밀히 DNA양을측정하였다. 이후 Gel electrophoresis를통해 DNA를최종선택하였다. 최종선택된 DNA를 library 제작에사용하였다. < 그림 >. DNA 확인을위한전기영동 (F. 구절초, I. 산구절초 ) 20 구절초 ( 九折草 ) 의감별자료집

21 나라이브러리구축 (Library prep. 및 QC) Covaris (S220) 를이용하여 peak power (175), duty factor (7.0), cycles/burst (200), time (50초), volume (50 ul) 조건하에 200 ng의 DNA를 550 bp 크기로 shearing 하였다. 이후 Fragmented DNA를 Illumina TruSeq Nano DNA Sample Prep Kits의매뉴얼에따라 library로제작하였다. Size selection은 magnetic bead를이용하여 DNA의평균 size가 550bp가되게하였다. DNA 3 쪽에 adenylation 시킨후 adapter를 ligation 하였다. 잔여 adapter를제거하기위해 magnetic bead를사용하였고, 바로 DNA를증폭하기위해 PCR (8 cycles) 를수행하였다. PCR 산물을 magnetic bead로 clean up 한후 library가정상적으로제작되었는지 bioanalyzer (Agilent) 로확인하였다. < 그림 >. Bioanalyzer results(agilent 2100 Bioanalyzer) 다시퀀싱결과 (NGS 서열품질확인 ) 차세대염기서열분석기, miseq 을통해생산된서열은아래와같다. < 표 >. 시퀀스생산현황 샘플명 # Reads Yield(Bases) GC rate (%) %of>=q30 Bases(PF) 구절초 89,119,380 22,368,964, 산구절초 92,484,042 23,213,494, Discrimination of Chrysanthemi Zawadskii Herba 21

22 < 표 >. Base sequence quality Read 1 Read 2 구절초 산구절초 라엽록체 de novo assembly 식물의엽록체를조립하는방법으로는 shotgun sequencing 서열의초기조립을통해조립된 contigs로부터엽록체와관련된 contigs만을수집하여메꿔지지않는 gap을 closing하는과정을수행하는방법이있으며, metagenome에서관심있는미생물의유전체를조립하듯관련서열만을추출하여 subsets을만들고이들만을가지고 assemble을수행하는방법이있다. 본조립은후자의방법을통하여빠르게진행한후, 조립된염기서열에 raw data 서열을 mapping하여확인하는방법으로진행하였다. 생산된서열데이터를 de novo assembly 하기위해품질이좋은서열만을선별하고아답터를제거하기위한품질및 trimming 분석을진행하였다. < 표 >. 엽록체로추출된서열 샘플명 엽록체 read 개수 평균길이 총사이즈 (bp) 구절초 1,109, ,543,736 산구절초 1,308, ,518, 구절초 ( 九折草 ) 의감별자료집

23 선별된서열데이터는 CLCgenomics Workbench 소프트웨어를사용하여조립되었으며, 어셈블조건은아래와같다. - Ambiguous base = 0 - Quality limit = Min. number of nucleotides in reads = Similarity fraction: minimum size: 500-bp - minimum depth: 10 위결과를기반으로약하게 (Quality limit=0.01, Min. number of nucleotides in reads=150) trimming한서열을이용하여조립한결과와레퍼런스서열에 mapping 되어나온 contigs 결과를이용하여 contig ordering을수행하고 merge하였다. < 표 >. de novo assembly 결과 샘플명 contig 개수 총길이 (bp) 평균 depth 총 matched bases 구절초 3 127,009 2, ,232,256 산구절초 1 116,161 2, ,145,606 마레퍼런스 Gap-closing 메꿔지지않은 gap을 closing하기위하여 IMAGE (Tsai et. al., Genome Biology, 2010) 프로그램을이용하여 gap을 closing하였다. 또한, manual curation을통하여 mate 정보가깨지는지역을강제로끊어 contig를나누었다. 이후, contig end에존재하는 single reads의 mate reads를 in house scripts를이용하여추출하여 assemble하고 end를확장하여 gap을 closing하였다. 최종적으로, 조립된유전체정보에서열을다시 mapping하여 mate 정보가문제없이 alignment 되는지확인하였다. < 표 >. in silico gap closing 샘플명 contig 개수 평균 depth(x) 총길이 (bp) 비고 구절초 1 1, ,991 Circular (finished) 산구절초 1 2, ,043 Circular (finished) Discrimination of Chrysanthemi Zawadskii Herba 23

24 바유전자지도 < 그림 >. 구절초의엽록체유전체지도 사엽록체유전체의유전자위치 < 표 >. 산구절초의엽록체유전체의유전자위치 Gene Name class start end strand trnh-gtg trna_primary_transcript psba protein coding gene matk protein coding gene rps16 protein coding gene trnq-ttg trna_primary_transcript psbk protein coding gene psbi protein coding gene trns-gct trna_primary_transcript 구절초 ( 九折草 ) 의감별자료집

25 Gene Name class start end strand trnc-gca trna_primary_transcript petn protein coding gene psbm protein coding gene trnd-gtc trna_primary_transcript trny-gta trna_primary_transcript trne-ttc trna_primary_transcript rpob protein coding gene rpoc1 protein coding gene rpoc2 protein coding gene rps2 protein coding gene atpi protein coding gene atph protein coding gene atpf protein coding gene atpa protein coding gene trnr-tct trna_primary_transcript trnt-ggt trna_primary_transcript psbd protein coding gene psbc protein coding gene trns-tga trna_primary_transcript psbz protein coding gene trng-gcc trna_primary_transcript trnm-cat trna_primary_transcript rps14 protein coding gene psab protein coding gene psaa protein coding gene ycf3 protein coding gene trns-gga trna_primary_transcript rps4 protein coding gene trnt-tgt trna_primary_transcript trnf-gaa trna_primary_transcript ndhj protein coding gene ndhk protein coding gene ndhk protein coding gene Discrimination of Chrysanthemi Zawadskii Herba 25

26 Gene Name class start end strand ndhc protein coding gene trnm-cat trna_primary_transcript atpe protein coding gene atpb protein coding gene rbcl protein coding gene accd protein coding gene psai protein coding gene ycf4 protein coding gene cema protein coding gene peta protein coding gene psbj protein coding gene psbl protein coding gene psbf protein coding gene psbe protein coding gene petl protein coding gene petg protein coding gene trnw-cca trna_primary_transcript trnp-tgg trna_primary_transcript psaj protein coding gene rpl33 protein coding gene rps18 protein coding gene rpl20 protein coding gene rps12 protein coding gene clpp protein coding gene psbb protein coding gene psbt protein coding gene psbn protein coding gene psbh protein coding gene petb protein coding gene petd protein coding gene rpoa protein coding gene rps11 protein coding gene rpl36 protein coding gene 구절초 ( 九折草 ) 의감별자료집

27 Gene Name class start end strand infa protein coding gene rps8 protein coding gene rpl14 protein coding gene rpl16 protein coding gene rps3 protein coding gene rpl22 protein coding gene rps19 protein coding gene rpl2 protein coding gene rpl23 protein coding gene trni-cat trna_primary_transcript ycf2 protein coding gene ycf15 protein coding gene trnl-caa trna_primary_transcript ndhb protein coding gene rps7 protein coding gene rps12 protein coding gene ycf15 protein coding gene trnv-gac trna_primary_transcript rrn16s rrna_primary_transcript rrn23s rrna_primary_transcript rrn4.5s rrna_primary_transcript rrn5s rrna_primary_transcript trnr-acg trna_primary_transcript trnn-gtt trna_primary_transcript ycf1 protein coding gene rps15 protein coding gene ndhh protein coding gene ndha protein coding gene ndhi protein coding gene ndhg protein coding gene ndhe protein coding gene psac protein coding gene ndhd protein coding gene Discrimination of Chrysanthemi Zawadskii Herba 27

28 Gene Name class start end strand ccsa protein coding gene ccsa protein coding gene trnl-tag trna_primary_transcript rpl32 protein coding gene ndhf protein coding gene ycf1 protein coding gene trnn-gtt trna_primary_transcript trnr-acg trna_primary_transcript rrn5s rrna_primary_transcript rrn4.5s rrna_primary_transcript rrn23s rrna_primary_transcript trnv-gac trna_primary_transcript ycf15 protein coding gene rps12 protein coding gene rps7 protein coding gene ndhb protein coding gene trnl-caa trna_primary_transcript ycf15 protein coding gene ycf2 protein coding gene trni-cat trna_primary_transcript rpl23 protein coding gene rpl2 protein coding gene < 표 >. 구절초의엽록체유전체의유전자위치 Gene Name class start end strand trnh-gtg trna_primary_transcript psba protein coding gene matk protein coding gene rps16 protein coding gene trnq-ttg trna_primary_transcript psbk protein coding gene psbi protein coding gene 구절초 ( 九折草 ) 의감별자료집

29 Gene Name class start end strand trns-gct trna_primary_transcript trnc-gca trna_primary_transcript petn protein coding gene psbm protein coding gene trnd-gtc trna_primary_transcript trny-gta trna_primary_transcript trne-ttc trna_primary_transcript rpob protein coding gene rpoc1 protein coding gene rpoc2 protein coding gene rps2 protein coding gene atpi protein coding gene atph protein coding gene atpf protein coding gene atpa protein coding gene trnr-tct trna_primary_transcript trnt-ggt trna_primary_transcript psbd protein coding gene psbc protein coding gene trns-tga trna_primary_transcript psbz protein coding gene trng-gcc trna_primary_transcript trnm-cat trna_primary_transcript rps14 protein coding gene psab protein coding gene psaa protein coding gene ycf3 protein coding gene trns-gga trna_primary_transcript rps4 protein coding gene trnt-tgt trna_primary_transcript trnf-gaa trna_primary_transcript ndhj protein coding gene ndhk protein coding gene Discrimination of Chrysanthemi Zawadskii Herba 29

30 Gene Name class start end strand ndhk protein coding gene ndhc protein coding gene trnm-cat trna_primary_transcript atpe protein coding gene atpb protein coding gene rbcl protein coding gene accd protein coding gene psai protein coding gene ycf4 protein coding gene cema protein coding gene peta protein coding gene psbj protein coding gene psbl protein coding gene psbf protein coding gene psbe protein coding gene petl protein coding gene petg protein coding gene trnw-cca trna_primary_transcript trnp-tgg trna_primary_transcript psaj protein coding gene rpl33 protein coding gene rps18 protein coding gene rpl20 protein coding gene rps12 protein coding gene clpp protein coding gene psbb protein coding gene psbt protein coding gene psbn protein coding gene psbh protein coding gene petb protein coding gene petd protein coding gene rpoa protein coding gene rps11 protein coding gene 구절초 ( 九折草 ) 의감별자료집

31 Gene Name class start end strand rpl36 protein coding gene infa protein coding gene rps8 protein coding gene rpl14 protein coding gene rpl16 protein coding gene rps3 protein coding gene rpl22 protein coding gene rps19 protein coding gene rpl2 protein coding gene rpl23 protein coding gene trni-cat trna_primary_transcript ycf2 protein coding gene ycf15 protein coding gene trnl-caa trna_primary_transcript ndhb protein coding gene rps7 protein coding gene rps12 protein coding gene ycf15 protein coding gene trnv-gac trna_primary_transcript rrn16s rrna_primary_transcript rrn23s rrna_primary_transcript rrn4.5s rrna_primary_transcript rrn5s rrna_primary_transcript trnr-acg trna_primary_transcript trnn-gtt trna_primary_transcript ycf1 protein coding gene rps15 protein coding gene ndhh protein coding gene ndha protein coding gene ndhi protein coding gene ndhg protein coding gene ndhe protein coding gene psac protein coding gene Discrimination of Chrysanthemi Zawadskii Herba 31

32 Gene Name class start end strand ndhd protein coding gene ccsa protein coding gene ccsa protein coding gene trnl-tag trna_primary_transcript rpl32 protein coding gene ndhf protein coding gene ycf1 protein coding gene trnn-gtt trna_primary_transcript trnr-acg trna_primary_transcript rrn5s rrna_primary_transcript rrn4.5s rrna_primary_transcript rrn23s rrna_primary_transcript trnv-gac trna_primary_transcript ycf15 protein coding gene rps12 protein coding gene rps7 protein coding gene ndhb protein coding gene trnl-caa trna_primary_transcript ycf15 protein coding gene ycf2 protein coding gene trni-cat trna_primary_transcript rpl23 protein coding gene rpl2 protein coding gene 구절초 ( 九折草 ) 의감별자료집

33 (2) 구절초와산구절초의엽록체유전체비교 (synteny) 완성된엽록체에대해유전자의순서및구조를검증하기위한 synteny 분석을수행하여근연종내또는종간비교를통해유전체의특성 (Rearrangement: Fusion/ Duplication/ insertion/ inversion) 을확인하였다. < 그림 >. 산구절초및구절초 synteny map 구절초와산구절초의엽록체유전체를비교하여두분류군간의 SNP(142개 ) 과 Indel(64개 ) 을확인하였다. < 표 >. 구절초의엽록체유전체의유전자위치구절초와산구절초엽록체사이의 SNP 형태와각각의개수 SNP 형태 개수 SNP 형태 개수 AC 20 GA 16 AG 16 GC 5 AT 8 GT 12 CA 17 TA 4 CG 3 TC 18 CT 11 TG 12 합계 142 Discrimination of Chrysanthemi Zawadskii Herba 33

34 (3) 차세대염기서열분석결과에따른구절초와산구절초의종감별마커 NGS로분석된구절초와산구절초의엽록체유전체염기서열을비교하였고, 총 4개의구간에서 indel을바탕으로두분류군을구별할수있는마커를개발하였다. < 그림 >. 구절초와산구절초의종감별마커모식도 34 구절초 ( 九折草 ) 의감별자료집

35 < 표 >. 구절초와산구절초종감별마커후보군 No. Marker name Position Location Direction Primer seq.(5-3 ) 1 Chr01 matk Chr02 psba-ycf Chr03 psbe-petl Chr04 rps12-ycf F R F R F R F R GTTTGGTCCATTTATACCAT ATTTCGTTTGGTCAATCGTTG GGAAGTCGATCCGGGGCAAGTGTTC GCTAATGCCTACTCGCGTGATTTGG CTAGTCTTAGAATATAGTTGAACC CATTATAGACAGCACTAACAAGG GAGCGAAGGGTACGAAATAAATC TCACGGTACAATCCTC (4) 구절초, 산구절초의종감별마커의적용성테스트 NGS 분석결과확보한엽록체유전체의염기서열을활용하여구절초와산구절초의엽록체변이지역을바탕으로 2종을구분할수있는엽록체기반분자마커를개발한결과 InDel에기반한마커를개발하였고, matk 지역기반마커와 psaa-ycf3 구간에대한적용성테스트결과는다음과같다. < 그림 > 구절초와산구절초의종감별마커 2종에대한적용성테스트결과 (1: 구절초, 2: 산구절초 3-10: 시료 ) Discrimination of Chrysanthemi Zawadskii Herba 35

36 matk와 psaa-ycf3 구간은모두구절초와산구절초를 indel에따른증폭사이즈차이로구분할수있도록제작하였다. 적용성테스트를위해구절초 (15D45), 산구절초 (15D59) 와유통품 8개시료를대상으로하였다. 두구간에서모두 NGS분석시료의예상증폭결과와일치하게나왔으며, 유통품에서도각시료별로두기원종내의결과가분포하였다. 5) 결론및고찰 구절초는 대한약전외한약( 생약 ) 규격집 (2014) 에구절초 (Chrysanthemum zawadskii var. latilobum) 또는산구절초 (C. zawadskii) 의전초로수재되어있다. 유전적거리분석결과, DNA 바코드로분석한 5개구간모두에서구절초와산구절초는거의동일한염기서열을보여두기원종을구별할수없었다. rbcl을제외한 4개구간 (matk, atpf-atph, trnh-psba 및 ITS2) 에서변이를확인하였지만, 종내변이로두종 ( 구절초와산구절초 ) 을확인하기위한마커로는사용할수없었다. 또한 matk와 atpf-atph는다른구간에비해유전적거리가크게나타났지만이역시종을구별할수없었다. NJ 계통분석결과, matk, atpf-atph, trnh-psba rbcl 및 ITS2의경우구절초와산구절초의염기서열이모두동일하여구별할수없었다. 즉, 품목구절초는분석된 5개의모든구간에서구별할수없음을확인하였다. 국화과 2,315 종을대상으로 DNA 바코드구간분석을한연구결과에서보편성 (universality), 염기서열변이 (sequence variation), 및종해상력 (identification capability) 의관점에서 ITS2가가장유용했다고보고하고있으나 17), 이결과는국화과전체의분류군을대상으로분석된것으로변종 (variety) 수준에서는맞지않는것을확인하였다. 본과제는 DNA 바코드를사용하여명확히확인된샘플을이용해차세대염기서열분석 (NGS) 을진행하고자하였으나, 구절초의경우 DNA 바코드만으로는분류가어려워형태학적감별방법을통해동정하였다. 형태학적으로구절초와산구절초는잎의형태에따라구별할수있다. 구절초의잎은난형으로가장자리가 1회우상으로갈라지지만산구절초는 2회우상으로갈라지는것이차이점이다. 샘플은분류학자가종동정한식물표본으로써강원대학교식물자원보존연구센터 ( 구절초 ) 와국립원예특장과학원 ( 산구절초 ) 에서대여및분양한것을사용하였다. 36 구절초 ( 九折草 ) 의감별자료집

37 NGS 분석결과구절초의엽록체유전체는원형이고, 길이는 150,991 bp 이며, 산구절초는 150,043 bp 이었다. 두엽록체유전체염기서열을비교하였고, SNP(142 개 ) 과 Indel(64개 ) 을확인하였다. 그중 Indel을기반으로두분류군을구별할수있는마커를개발하였다. 그중 matk와 psaa-ycf3의 2개구간을이용하여적용성테스트를수행한결과유통품내에서 2개의기원종내의결과가분포함을확인할수있었으며, 정확한감별확인을위해서는보다많은시료의테스트가필요하다. 두분류군을유전학적인방법으로구별하는것은본연구가처음이고기존의 DNA 바코드구간외에새로운구간을제시할수있게되다. 이번연구의결과를이용하여구절초의기원이되는구절초, 산구절초를구별하는것은한약재의올바른유통뿐만아니라식물계통분류학적으로도도움이될것으로사료된다. Discrimination of Chrysanthemi Zawadskii Herba 37

38 3 이화학적연구 대한민국약전외한약 ( 생약 ) 규격집에서아래 < 표 10> 와같이규정하고있다. < 표 >. 각국공정서의구절초 ( 九折草 ) 기원및확인시험 공정서기원확인시험함량시험 KHP 구절초 : Chrysanthemum zawadskii Herbich var. latilobum (Maxim.) Kitamura 산구절초 : Chrysanthemum zawadskii var. coreanum (Nakai) 정색반응 - 외국공정서에는수재되어있지않음 1) 시료처리 구절초 1 g을 50% MeOH 20 ml을넣고초음파추출방법으로 60분간추출하였다. 이후추출액을 membrane filter (0.45 μm) 에통과시킨후그중 10 μl를 HPLC 분석시의검액으로사용하였다. 지표성분의농도는 chlorogenic acid (1), apigenin- 7-O-β-D-glucuronide (4) 은 100 µg/ml 이며, 3,4-di-O-caffeoylquinic acid (2), 4,5-di-O-caffeoylquinic acid (5) 은 25 µg/ml, 3,5-di-O-caffeoylquinic acid (3), linarin (6) 은 200 µg/ml 로하였다. 38 구절초 ( 九折草 ) 의감별자료집

39 2) 대상성분 < 그림 >. 성분명및구조 3) 분석조건 < 표 >. HPLC analytical condition Time (min) 0.1 % FA in DW (%) 0.1 % FA in AcCN (%) Mobile phase Detector UV (310 nm) Column X select C18 ( mm, 5 μm) Flow rate 1 ml/min Injection volume 10 μl Temperature 30 Device Agilent 1260 series - DAD *formic acid **distiled water ***acetonitrile Discrimination of Chrysanthemi Zawadskii Herba 39

40 4) HPLC-UV 크로마토그램 구절초 (C. zawadskii var. latilobum) 및산구절초 (C. zawadskii var. coreamum) 는 chlorogenic acid (1), 3,4-di-O-caffeoylquinic acid (2), 3,5-di-O-caffeoylquinic acid (3), apigenin-7-o-β-d-glucuronide (4), 4,5-di-O-caffeoylquinic acid (5), linarin (6) 의성분확인으로생약명구절초의확인이가능함을확인하였다. < 그림 >. HPLC chromatogram 지표성분, 구절초, 산구절초 chlorogenic acid (1) 3,4-di-O-caffeoylquinic acid (2) 3,5-di-O-caffeoylquinic acid (3), apigenin-7-o-β-d-glucuronide (4), 4,5-di-O-caffeoylquinic acid (5), linarin (6) 40 구절초 ( 九折草 ) 의감별자료집

41 5) 특이성 chlorogenic acid (1) 3,4-di-O-caffeoylquinic acid (2) 3,5-di-O-caffeoylquinic acid (3) apigenin-7-o-β-d-glucuronide (4) 4,5-di-O-caffeoylquinic acid (5) linarin (6) < 그림 >. 구절초의 UV spectrum Discrimination of Chrysanthemi Zawadskii Herba 41

42 6) 결론및고찰 구절초 ( 九折草 ) 는 대한민국약전외한약( 생약 ) 규격집 에등재되어있는품목으로국화과 (Compositae) 에속하는구절초 Chrysanthemum zawadskii Herbich var. latilobum (Maxim.) Kitamura 또는산구절초 Chrysanthemum zawadskii var. coreanum(nakai) 의전초로국외공정서에는수재되어있지않다. 구절초의감별에있어 chlorogenic acid (1), 3,4-di-O-caffeoylquinic acid (2), 3,5-di-O-caffeoylquinic acid (3), apigenin-7-o-β-d-glucuronide (4), 4,5-di-O-caffeoylquinic acid (5), linarin (6) 6종의지표성분으로동시분석법을개발하여특이성및반복성등을검토한결과구절초의분석법으로적합하다고판단하였다. 하지만구절초와산구절초에서지표성분의유무와함량의차이는정확하게구분이되지않았다. 위의결과는 [NGS를활용한 구절초 2품목의유전학적감별연구 ] 에서구절초의연구결과와동일한것으로확인되었다. 하지만이화학적감별결과와유전학적감별결과를토대로관능적감별결과를제시한다면생약명인구절초의감별이가능할것으로예상된다. 결과적으로구절초와산구절초가같은생약명으로유통되는데있어서같은지표성분을가지고있기때문에구분하여유통하지않아도적절하게품질관리가가능할것으로보인다. 42 구절초 ( 九折草 ) 의감별자료집

43 4 참고문헌 1) 식품의약품안전처 대한민국약전외한약 ( 생약 ) 규격집 4개정. 의약품각조 2부. Pp ) Kim, J. S., J. H. Pak, B. B. Seo and H. Tobe Karyotypes of metaphase chromosomes in diploid populations of Dendranthema zawadskii and related species (Asteraceae) from Korea: diversity and evolutionary implications. J. Plant Res. 116: ) Palibin, J Conspectus florae Koreae (pars 1). Petropoli. Pp ) Nakai, T Flora Koreana II. J. Coll. Sci. Imp. Univ. Tokyo Univ. Japan. Pp ) Nakai, T Notulae ad Plantas Japoniae et Koreae. XIV. Bot. Mag. (Tokyo) 31: ) Nakai, T Notulae ad Plantas Japoniae et Koreae. XVII. Bot. Mag. (Tokyo) 32: ) Nakai, T Notulae ad Plantas Japoniae et Koreae. XXV. Bot. Mag. (Tokyo) 35: ) Kitamura, S Compositae Japonicae. Mem. Coll. Sci. Kyoto Emper. Univ. Ser. B, 15: ) Kitamura, S Dendranthema et Nipponanthemum. Acta Phytotax. Geobot. 24: ) Trehane, P Proposal to conseve Chrysanthemum L., with a conserved type (Compositae). Taxon 44: ) Nicolson, D. H Report of the general committee: 8. Taxon 48: ) H. Koyama Asteraceae(Compositae). In Flora of Japan, Vol. IIIb. K. Iwatsuki, T. Yamazaki, E. B. David, H. Ohba (eds.), Kodansha, Tokyo. Pp. Discrimination of Chrysanthemi Zawadskii Herba 43

44 ) 국립수목원 국가표준식물목록. Pp ) Park, J. H Dendranthema. In The Genera of Vascular Plants of Korea. Flora of Korea Editorial Committee (eds.), Academy Publishing Co., Seoul. Pp ) Lin, Y. R., Shi, Z., Humphries, C. J. & Gilbert, M. G Anthemideae. In Flora of China, Vol (Asteraceae). Wu, Z. Y., Raven, P. H. & Hong, D. Y. (eds.), Science Press (Beijing) & Missouri Botanical Garden Press, St. Louis. Pp ) Lee, Y. N A cytotaxonomic study on Chrysanthemum zawadskii Herbich in Korea (2) Polyploidy. Korean J. Bot. 12: ) Gao T, Yao H, Song J, Zhu J, Liu C, Chen S Evaluating the feasibility of using candidate DNA barcodes in discriminating species of the large Asteraceae family. BMC Evolutionary Biology 10: ) Kim, M.H., Nugroho, Agung, Lim, S.C., Moon, H.E., Choi, J.S., Park, H.J. Phytochemical Analysis of Phenolic Compounds in 30% Ethanolic Extracts from the Compositae Plants and Peroxynitrite-scavenging Effect 생약학회지. 42(2): Pp ) Ayumi Uehara, Masashi Nakata, Junichi Kitajima, Tsukasa Iwashina, Internal and external flavonoids from the leaves of Japanese Chrysanthemum species (Asteraceae) Biochemical Systematics and Ecology. 41 p 구절초 ( 九折草 ) 의감별자료집

45 감별자료집 발행처 : 식품의약품안전평가원 발행일 : 2017 년 4 월 발행인 : 식품의약품안전평가원손여원 편집위원장 : 식품의약품안전평가원의료제품연구부서경원 편집위원 : 식품의약품안전평가원의료제품연구부생약연구과성락선, 심영훈, 김종환, 강일현, 현성예, 이규하, 이재준, 황대선, 김규엽, 김선혜 자문위원 : 국립생물자원관이병윤과장, 서울대학교성상현교수, 서울대학교양태진교수 문 의 처 : 충청북도청주시흥덕구오송읍오송생명2로 187 오송보건의료행정타운식품의약품안전평가원생약연구과 전화 : 043) 팩스 : 043)