RT-PCR 법 II. 역전사효소반응 ( 주 ) 다인바이오연구소 현재분자생물학분야에서 RNA 수준의 gene expression ( 유전자발현 ) 과 cdna (complementary DNA) cloning에널리이용되고있는 RT-PCR (Reverse transcription ploymerase chain reaction) 은생명정보가 DNA에서 RNA로전달된다는분자생물학분야의 Central Dogma의예외를증명하는 reverse transcriptase ( 역전사효소, RT) 의발견에서부터기원한다 1). 1960년대, Howard Temin 은 positive strand RNA retrovirus가세포에감염된후 transform되는현상을설명하기위해서 RNA retrovirus가세포에감염되면이 RNA 바이러스를주형 (template) 으로하여 RNA virus와상보적인 DNA (cdna) 가만들어지고, 이 DNA를 template로하여 RNA virus가증식을한다는 provirus 가설 을처음으로주장하였다. 이가설에서 Temin은 RNA에서 DNA가합성되기위해서는 RNA염기서열에의존적인 DNA polymerase ( 중합효소 ) 인 RT의존재를예언하였다. 이후, Temin은감히당대의 Central Dogma 를거스른대가로동료과학자들로부터엄청난비난을받았지만, 1970년에 David Boltimore와각각독립적으로 retrovirus내에 RT가존재함을보여줌으로써 provirus hypothesis 를입증하였고이발견으로둘은 1975년노벨생리의학상까지수상하였다. 이중요한발견이실제분자생물학실험분야에기여하게된한계기는이 RT에 ribonuclease H 활성 (reverse transcription이종료된후생긴 RNA-cDNA hybrid 상태에서 RNA만을분해하여결국 cdna만남게함 ) 이있음이알려지면서부터이발견을기반으로 RT가 RNA를 template로하여 cdna를 cloning 할수있는방법으로쓰일수있는가능성이제시되었다. PCR이발견되기전까지는 cdna library 라는방법으로 cdna를 cloning 했고, PCR 이후로는 RT와 PCR이결합된방법인 RT-PCR이 cdna cloning에널리이용되고있다. RT-PCR은 cdna의 cloning 이외에도특정유전자의 expression 수준을연구할때에도중요하게쓰일수있다. 특히, 최근들어서는 Real time RT-PCR 이라는새로운기술이일반화되어상당히정밀하게 differential gene expression 수준을연구할수있게되었다. 이 Real time RT- PCR은유전자들의 differential expression 수준을보기위한 cdna microarray 실험에서나온결과를다시한번확인할때쓰일수있다. 보통 cdna microarray 실험에쓰이는 chip ( 또는 slide) 에는 10,000개이상의유전자들이심어지는데, 이실험에서결과로얻어진 differentially expressed된유전자들의 false positive 여부를확인할때쓰인다. 1. 역전사효소반응 (1) 역전사효소 (Reverse Transcriptase; RTase) mrna 자체는 PCR의기질이될수없다. 따라서 RT반응으로 mrna로부터 cdna를합성할필요가있다. RTase 는 RNA-dependent DNA polymerase 활성을가져 mrna를주형으로상보적인 cdna를합성 (1st strand 합성 ) 하고동시에 DNA-dependent DNA polymerase 활성을가져합성된 cdna의 complementary strand를합성할수있다 (2nd strand 합성 ). RT반응에는통상 avian myeloblastosis virus (AMV) 유래와 molony murine leukemia virus (MoMLV) 유래의 2종류 RTase 가이용된다. AMV 유래 RTase 는상기의 2개활성뿐만아니라 mrna: cdna hybrid를강력하게분해하는 RNase H 활성을가지므로, 1st strand 합성이저해되어긴 cdna를합성할수없다는단점을가진다. 한편 MoMLV 유래 RTase 는 RNase H 활성이비교적약하므로이론적으로는긴 DNA 합성이가능하지만, 반응의최적온도가 37 로 AMV 유래 RTase 의 42 보다낮으므로주형 mrna가복잡한고차구조를가지는경우에는
cdna의신장반응이저해된다. 이와같이 AMV 유래 RTase 와 MoMLV 유래 RTase 는모두일장일단을가지나필자는 MoMLV 유래 RTase 를선호한다. 또두효소는최적 ph, 최적염농도등에서도차이가있으므로주의해야한다. 최근 Myers 등은 RTase 활성과 PCR 활성모두를가지는 Tth polymerase를보고하였다 2). RT-PCR 반응을 1개의효소로수행하면 RT반응을고온에서할수있으므로주형 mrna의고차구조의영향을줄일수있다는점등의장점이있으며종래의방법보다감도가약 100배더증가한다는보고도있다. 그러나 RT반응에 Mn 2+ 이온을필요로함에따라반응의정확도 (fidelity) 가낮아지는것이단점이다. (2) RT반응에사용하는 Primer RT반응의 primer는목적에따라 1 oligo(dt)12~18 primer, 2 특정염기서열에대한상보적인 primer, 3 random 6 mer primer 등의 3종류를이용할수있다. Full-length cdna를얻고자하는경우는 oligo(dt) 12~18 primer가유용하다. Target mrna의양이극히적을것으로예상되는경우에도 oligo(dt) 12~18 primer는동일 mrna분자의 poly(a)+ 의다양한부위와결합하여복수의신장반응을개시할수있다. 또 RT-PCR법에기초한 DDA (differential display analysis) 를할때는 RT 산물을일차정제분획하는목적으로 oligo(dt) 12~18 primer의 3 말단에 A, G, C, (T) 를다양한조합으로 2염기정도붙인 primer를이용한다. 이에반해임상진단이나정량적 RT-PCR법등의경우에는보다선택적으로특정의염기서열을증폭할필요가있으므로특정염기서열에대한상보적인 primer를이용한다. 필자등은 20염기정도의길이를가진 primer를이용하여양호한결과를얻었다. 또 random 6 mer primer는 mrna의 5 말단등과같이 oligo(dt) 12~18 primer를이용한 RT 반응으로신장되기힘든영역의해석이나임상진단에있어 target 으로하는염기서열이짧아야좋은경우등에자주이용된다. (3) DNA의혼입에대한대책미량의 mrna를검출하는경우또는정량적인해석을하는경우에가장큰문제점은시료에 genome DNA가혼입되는것이다. 일반적으로 2개의 primer를다른 exon상의염기서열과상보적으로설정하면설사혼입한 genome DNA가 cdna와함께 PCR의주형으로작용하더라도 genome DNA의경우는 intron도동시에증폭되므로단편의길이가다른 mrna 유래의 RT-PCR 산물과구별할수있고, genome DNA 유래의 intron을함유하는단편은 cdna 유래의단편보다길기때문에증폭효율이낮을것으로예상한다. 그러나 genome DNA 유래의단편이원하는 cdna 유래의단편과길항적으로증폭하므로반응의정량성에장애가된다. 한편 intron을결실한유전자나 pseudo 유전자가존재하는경우에는혼입한 genome DNA 유래의단편과 mrna 유래단편의길이차이를구별할수없다. 따라서 RNA 용액에 DNase 처리하여혼입한 genome DNA를완전히제거할필요가있다.
(4) 방법 A. 준비 Reverse Transcriptase 10 RT buffer RNase Inhibitor 750 mm KCl 500 mm Tris-HCl(pH8.3) 30 mm MgCl 2 B. RNA 시료의 deoxyribonuclease(dnase) 처리 3) RNA(20 μg ) 16.0 μl 10X DNase buffer 2.0 μl RNase Inhibitor 1.0 μl DNase(RNase free) 1.0 μl 20.0 μl 2 37 에서 1시간반응시킨다. 3 90 에서 5분간가열한다. 4 원심분리하여얼음위에놓는다. 이용액은직접 RT 반응에이용할수있으나, phenol/chloroform 추출, ethanol 침전으로 RNA를회수해도좋다. C. 역전사효소반응 (a) Annealing : 특정염기서열에대한상보적 primer를이용하는경우 RNA 용액 (1 μg / μl ) 1.0 μl RT Primer(50 nm) 1.0 μl 10 RT buffer 1.4 μl 6.6 μl 10.0 μl 2 혼합액을 95 에서 2분간가열한다. 3 55 에서 1시간반응한다. 4 원심분리한다. Oligo(dT) 12~18 primer를이용하는경우에는동일한반응계에 40~100 pmol 첨가한다. (b) Primer 신장반응
Primer와 annealing한 RNA 혼합액 10.0 μl Dithiothreitol(100 mm) 1.4 μl dntps mixture( 각 5 mm) 1.4 μl RNase Inhibitor 0.7 μl Reverse transcriptase(200 units/ μl ) 0.5 μl 14.0 μl 2 37 에서 1시간반응시킨다. 3 80 에서 5분간가열한다. 4 원심분리하여얼음위에놓는다. 2. PCR RT반응으로얻은 cdna를주형으로 PCR을실시함으로써 mrna를검출할수있다. mrna를고감도로검출하고자하는경우는방사성동위원소를이용한 PCR을한다. 여기에는표식 primer를이용하는경우와표식 nucleotide를이용하는경우의 2가지방법이있다. 일반적으로방사성동위원소를이용한 PCR은검출감도가높으므로반응을아주소량으로도할수있어방사성동위원소나효소, 기질을최소량으로할수있다. 필자등은 5 μl용량의 PCR로도양호한결과를얻었다 4, 5). mrna 검출을목적으로하는경우는통상 30 cycle의 PCR을이용한다. 한편 mrna의정량을목적으로하는경우에는 PCR 산물이지수함수적으로증가하는 cycle수를단편별로예비실험으로결정할필요가있으나통상 21~25 cycle이적당하다. (1) 준비 T4 polynucleotide kinase Taq polymerase 10X polynucleotide kinase buffer 10X Taq polymerase buffer 500 mm Tris-HCl(pH8.3) 500 mm KCl 100 mm MgCl 2 100 mm Tris-HCl(pH8.3) 50 mm Dithiothreitol 15 mm MgCl 2 0.1%(w/v) gelatin [γ- 32 P] ATP(7,000 Ci/nmol, 160 mci/ml, ICN Biochemi-cals) [α- 32 P] dctp(3,000 Ci/mmol, 10 mci/ml, Amersham) dntp Mixture( 각 1.25 mm) 합성 oligonucleotide
(2) 방사성동위원소 (RI) 를이용한 PCR법 mrna를고감도로검출할필요가있는경우, 특히염기서열의이상을검출하기위해 SSCP 해석을하고자하는경우는 primer를방사선표식하여 PCR에이용한다. 이경우는 32 P를기질로하여 T4 polynucleotide kinase로 primer의 5 말단을표식한다. RT-PCR 산물을 SSCP로해석하는경우에는양측의 primer를표식하는것이 mrna 구조의이상을검출하기위해반드시필요하지만양 primer를동등한강도로방사성표식을하기위해서는좌우 primer 각각에대하여별개의 kinase 반응을해줄필요가있다. 특히표식한 primer는정제할필요가없고, T4 polynucleotide kinase 반응액의일부를직접 PCR 반응액에첨가한다. 단 kinase 반응액의성분이 PCR을저해하지않도록 kinase 반응은 PCR의최적 ph인 8.3에서수행하고, 반응후가능한한소량의 로희석한다. SSCP 해석에서명료한 signal을얻기위해서는최소량의 PCR 산물을비변성 polyacrylamide gel로분리하는것이가장바람직하다. 이를위해 PCR에이용하는 primer가높은방사활성을갖도록표식해야한다. A, B에소개하는것은 PCR 산물을 SSCP 해석하는것을염두에둔 protocol이다. A. Primer 5 말단의 RI 표식 (30시료동시분석의경우 ) 1 다음의용액을첨가한다. Sense 또는 antisense primer (150 μm) 1.0 μl 10X kinase 완충액 (ph8.3) 0.3 μl [γ- 32 P] ATP 1.3 μl 1.1 μl T4 polynucleotide kinase (10 unit/ μl ) 0.3 μl 4.0 μl 2 37, 30분간반응한다. 3 80, 2분간가열한다. 4 원심분리하여얼음위에놓는다. 5 12.0 μl를첨가하여 primer 농도를 10 μm로조정한다. B. RI 표식 primer를이용한 PCR (1시료해석의경우 ) Primer 신장반응으로얻은 cdna 용액의일부 (1 μl ) 를 PCR 주형으로직접이용한다. Primer 신장반응용액의일부 1.0 μl 10X Taq polymerase buffer 0.5 μl dntp Mixture ( 각 1.25 mm) 0.4 μl RI 표식 sense primer (10 μm) 0.5 μl
RI 표식 antisense primer (10 μm) 0.5 μl 1.6 μl Taq polymerase (0.25 unit/ μl *) 0.5 μl 5.0 μl * Taq polymerase는 1 PCR buffer로희석한다. 2 PCR thermal cycler로증폭반응을실시한다. 초기열변성 : 94, 1분 cycle 반응 : 94, 30초 ; 55, 30초 ; 72, 1분 cycle 수 : 30 cycles( 검출을목적으로하는경우 ), 21~25 cycles( 정량을목적으로하는경우 ) 최종신장반응 : 72, 7분편법으로 94, 20초 ; 60, 1분의 2단계를 1 cycle로해도좋다. 또 annealing 온도는 primer에따라차이가나므로최적조건을검토해야한다. C. RI 표식 nucleotide를이용한 PCR (1시료해석의경우 ) Primer 신장반응액의일부 1.0 μl 10X Taq polymerase buffer 0.5 μl dntp Mixture( 각 1.25 mm) 0.4 μl Sense primer (10 μm) 0.5 μl Antisense primer (10 μm) 0.5 μl [α- 32 P dctp] 0.2 μl 1.4 μl Taq polymerase (0.25 unit/ μl * ) 0.5 μl 5.0 μl 2 Cycle 반응은 B-2와동일하게실시한다. D. Polyacrylamide gel 전기영동에의한분리 1 PCR 반응액의일부 (1 μl ) 를 9 μl의 10% glycerol, 20 mm EDTA, 0.05% bromophenol blue, 0.05% xylene cyanol 혼합액으로희석한다. 2 5~6% polyacrylamide gel (90 mm Trisborate ph8.3, 4 mm EDTA) 에 1 lane 당 1 μl씩 loading하고실온에서전기영동한다. 3 Gel을여과지상에서건조한후실온에서 X-ray film에 30~60분간감광하여 signal을얻는다.
(3) Primer를방사성표식하지않은 (non-ri) PCR법 PCR 산물을 RI 표식할필요가없는경우에는아래의 protocol에따른다. RI 표식의경우와비교하면검출감도가떨어지나간편한조작으로다양한목적에이용할수있다. Primer 신장반응액의일부 1.0 μl 10X Taq polymerase buffer 1.0 μl dntp Mixture ( 각 1.25 mm) 1.6 μl Sense primer (10 μm) 1.0 μl Antisense primer (10 μm) 1.0 μl 3.9 μl Taq polymerase (0.25 unit/ μl * ) 0.5 μl 10.0 μl * Taq polymerase는 1X PCR 완충액으로희석한다. 2 B-2와동일한 cycle로 PCR 한다. 3 PCR 반응액을 2 μl의 25% glycerol, 50 mm EDTA, 0.5% SDS, 0.2% bromophenol blue, 0.2% xylene cyanol 혼합액으로희석한다. 4 3~4% Nusieve:SeaKem (3:1) agarose gel에서전기영동하고 EtBr로염색하여증폭단편을검출한다. 3. References 1) Temin, Science, 192, (1975, 1976). 2) Myers, T. W., Gelfand, D. H. : Biochemistry, 30, 7661-7666 (1991). 3) Makino, R., Sekiya, T., Hayashi, K. : Technique, 2, 295-301 (1990). 4) Murakami, Y., Katahira, M., Makino, R., Hayashi, K., Hirohashi, S., Sekiya, T. : Oncogene, 6, 37-42 (1991). 5) Murakami, Y., Hayashi, K., Sekiya, T. : Cancer Res., 51, 3356-3361 (1991). 6) http://terms.naver.com/entry.nhn?docid=435554&mobile&categoryid=577 7) PCR 기초강좌, 백전백승 PCR가이드 /Takara 8) Saiki, R. K., Gelfand, D. H., Stoffel, S., Scharf, S. J., Higuchi, R., Horn, G. T., Mullis, K. B., Erlich, H. A. : Science, 239, 487-491 (1988). 9) http://www.appliedbiosystems.com/support/tutorials/ 10) http://www.scieng.net/zero/view.php?id=tech&page=1&page_num=20&category=&sn=&ss=&sc=&keyw ord=&prev_no=&select_arrange=&desc=&no=1024