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대한임상검사학회지 : 38 권제 1 호, 38-44, 2006 포도구균의 Erythromycin 유도성 Clindamycin 내성검출을위한간편한디스크확산법의유용성 서울대학교병원진단검사의학과 1, 서울대학교의과대학검사의학교실 2 주세익 1 이현 1 임규상 1 김의종 1, 2 An Easy Method of Disk Diffusion Antibiotic Susceptibility Test for Detection of Erythromycin-induced Resistance to Clindamycin in Staphylococci Sae-Ick Joo 1, Hyun Lee 1, Kyu-Sang Lim 1, and Eui-Chong Kim 1, 2 Department of Labolatory Medicine, Seoul National University Hospital, Seoul 110-744, Korea 1 Department of Labolatory Medicine, Seoul National University College of Medicine, Seoul 110-744, Korea 2 A simple and easy modification of AST by disk diffusion was tested for the detection of induced clindamycin resistant Staphylococci and their antimicrobial susceptibility at the same time. The incidence of inducible clindamycin resistant staphylococci in blood culture and their MIC characterization at Seoul National University Hospital was analyzed by an AST contained disk approximation test (D-zone test) and Etest, respectively. Of the total 309 staphylococcal isolates, 139 (45%) isolates presented constitutive resistance to ERY and CLI (ERY-R, CLI-R phenotype), and 59 were ERY-I/R and CLI-S phenotypes. Of the 59 isolates, 19 (32%) isolates were inducible resistant to CLI. The incidence was higher in S. aureus (66.7%) than coagulase-negative staphylococci (CNS, 26.0%). Especially, methicillin-resistant staphylococci (MRSA, 100%; MRCNS, 45.5%) presented higher inducibility than methicillin susceptible (MSSA, 50%; MSCNS, 20%). For most of the inducible clindamycin resistant staphylococci (15 of 19 isolates), their ERY MIC were high (>128 μg/ml) and were methicillin resistant. The remaining 4 isolates were methicillin susceptible and their ERY MIC were of intermediate concentrations (1-4 μg/ml). We concluded that suscetibility testing of staphylococci, especially methicillin resistant, should include the D-zone test. Key Words : D-zone test, Inducible clindamycin resistant staphylococci, Incidence of inducible MLS B, Methicillin resistant staphylococci 1)I. 서 론 Macrolide, lincosamide 와 streptogramin B 계 (MLSB 계 ) 항생제는 23S rrna 에작용하여세균의단백질합성 교신저자 : 주세익, ( 우 )110-744, 서울시종로구연건동 28, 서울대학교병원, 진단검사의학과. Tel : 02-2072-2797, 019-443-2937 E-mail : sijoo@paran.com 을저해함으로써살균하는항균제이다. Staphylococcus aureus(s. aureus) 와 coagulase-negative staphylococci (CNS) 에서 erythromycin으로대표되는 macrolide 항균제에대한내성기전은, erm 유전자에의한항균제작용부위를메틸화함으로써항균제가결합하지못하게하는작용부위변형기전과 (Rose 등, 1990), msra 유전자에의한항균제강제방출기전이있다 (Rose 등, 1989). erm 유전자에의한 23S rrna의메틸화는 MLS계모든항균제의작용부 38

위결합능력을감소시키며이로인하여 MLS계항균제내성이유도될수있다 (Robert 등, 1999). MLS 항균제는 staphylococci 감염치료에서사용되는항균제이며특히 lincosamid계의 clindamycin은창상감염이나 penicillin 예민성환자에게선택되는항균제이다 (Fiebelkorn 등, 2003). 그러나많은보고서에서유도성 clindamycin 내성 staphylococci 감염환자의일부에서 clindamycin 처치를통한치료가실패하였다고보고하였으며 (Watanakunakorn, 1976; Drinkovic 등, 2001; Siberry 등, 2003), 2004 년에 National Committee for Clinical Laboratory Standards (NCCLS, 2004) 는 erythromycin에의해유도되는 clindamycin 내성을모든 staphylococci에서검사하도록명기하였다. 유도성 clindamycin 내성을검출하는방법은 Fiebelkorn 등 (2003) 에의하여제안된후 CLSI/NCCLS multi-center 연구 (Zelazny 등, 2005) 를통하여표준화되고, 2005년 CLSI M100-S15에서는 S. aureus, CNS, Streprococcus pneumoniae(s. pneumoniae) 와베타용혈성연쇄상구균의디스크확산법을이용한항균제감수성검사에모두적용하도록하였다. 통칭 D-zone test 라고알려진이디스크근접시험검사 (disk approximation test) 는디스크확산법으로검사시매우간단하고도효율적으로유도성 clindamycin 내성을검출할수있다. 우리나라에서도 2002년도에세브란스병원에서분리된포도구균의유도성 clindamycin 내성이 10.2% 의빈도로나타난다고보고된바있으며 (Lim 등, 2002), S. pneumoniae에서는 0.9% 라고보고되기도하였다 (Kim 등, 2005). 본연구는 2005년도 1월부터 10월까지서울대학교병원의혈액배양에서분리된모든그람양성균을대상으로, 통상적인디스크확산법을시행하면서 erythromycin (ERY) 과 clindamycin(cli) 디스크근접시험검사가동시에수행될수있도록고안하여유도성 clindamycin 내성빈도를조사하였고, 그시험법의효율성을알아보았다. 유도성 clindamycin 내성을보이는균들의표현형적특성을알아보기위하여 Etest 항균제시험지 (AB BIODISK, Solna, Sweden) 를이용한최소억제농도검사를실시하여그분포를조사하였다. II. 재료및방법 대상균주 : 서울대학교병원에서 2005 년 1 월부터 10 월 까지분리된혈액배양분리균주를대상으로하였다. 각균주는한환자에서처음에분리된균주만을시험하였으며, 시험전까지 10% skim milk broth에혼탁한후 -70 에보관하였다. 보관된균주는시험전에면양혈액한천배지에재접종하여 36, 5% CO 2 배양기에하룻밤배양하였다. 균동정및항생제감수성검사 : 각균주의균동정은 VITEK(bioMeriux Inc., NC, USA) 을이용하여검사하였다. 항생제감수성검사는 CLSI M2-A8의표준지침 (2005) 에따라디스크확산법으로실시하였으며 CLSI M100-S15의기준에따라판독하였다. Methicillin에대한감수성여부는 cefoxitin-30 μg 디스크 (Oxoid Ltd., Hampshire, UK) 를사용하였다. 디스크근접시험검사 (disk approximation test, D-zone test) : 항생제감수성검사를실시할때디스크분주기 (12 디스크용, Oxoid Ltd., Hampshire, UK) 에서 CLI disk를제거하고 11개의디스크만분주하고, CLI-2 μg 디스크는 ERY-15 μg disk(oxoid Ltd., Hampshire, UK) 끝에서 20 mm가떨어지도록설치하였다. 35, 대기상태로 18시간배양하였다. 두항생제의균성장억제대가위축됨이없이나타나면 D-zone 음성, CLI의억제대가 ERY disk 방향으로위축되어 D 자모양으로나타나면 D-zone 양성 으로판독하였다 (Fig. 1). ERY CLI 20 mm A 38 mm ERY CLI B Fig. 1. Disk approximation test (D-zone test). (A) When ERY-15 μg disk and CLI-2 μg disk were placed 20 mm apart (edge to edge), inhibition zone of CLI disk was presented D form. (B) But these disks were placed at routine disk diffusion position (38 mm apart), CLI disk was viewed well inhibited round zone. 39

Etest를이용한최소억제농도검사 : 대상균주중 ERY 내성, CLI 감수성인모든포도구균 59균주가시험되었으며, 각균주의 ERY와 CLI의최소억제농도를검사하기위하여 Etest strip(ab BIODISK, Solna, Sweden) 을사용하였다. 시험방법은디스크근접시험과동일한방법으로 MH agar plate에균을접종하고두가지항생제의 Etest strip, CM(clindamycin, 0.016~256 μg/ml) 과 EM (erythromycin, 0.016~256 μg/ml) 을서로마주보게설치하였다. 균의억제대가 strip과만나는지점을최소억제농도로판독하고 CLSI M100-S15의기준에따라평가하였다. III. 결과 혈액배양에서분리된모든그람양성구균 ( 포도구균속, 연쇄구균속, 장구균속 ) 에대하여디스크근접검사를포함한항생제감수성검사를실시하였으나포도구균에대해서만 D-zone 양성을나타내었다 ( 결과보이지않음 ). 조사기간에혈액배양에서분리된포도구균은총 309균주였으며 ( 각환자당중복균주제외 ), ERY와 CLI 모두감수성이거나내성인균주가각각 111 균주 (35.9%), 136 균주 (44%) 이었다. ERY 내성, CLI 감수성인균주는 59균주로전체의 19.1% 를차지하였다 (Table 1). D-zone test의대상이되는이 59균주는 S. aureus 9균주와 CNS 50균주였다. CNS 내에서는 S. epidermidis, S. hominis, S. capitis, S. intermedius, S. haemolyticus, 그리고 S. warneri 가각각동정되었다 (Table 2). 각균종의 methicillin 감수성에따른 D-zone test 결과는 Table 2와같다. 3균주의 methicillin-resistant S. aureus(mrsa) 는모두 D-zone test 에서양성으로보인반면, 6균주의 methicillin-susceptible S. aureus(mssa) 중, 3균주는양성결과를, 나머지 3균주는음성결과를나타냈다. 50균주의 CNS 중 MRCNS 32 균주는 10균주 (31.3%) 가양성, 22균주 (68.8%) 가음성결과를보였다. 또한 MSCNS 18균주에서는 3균주 (16.7%) 만이양성결과를, 나머지는모두음성결과를보였다. 균종별로는 S. aureus(66.7%) 가 CNS(26.0%) 에비하여유도성 CLI 내성률이높았다. 전체적으로는 59균주중 19균주 (32%) 가높은 D-zone 양성을보였다. 각균종별 D-zone test 결과별로 Etest를이용한 ERY와 CLI에대한최소억제농도검사결과는 Table 2와 3에각각나타내었다. S. aureus 1균주. CNS 1균주와 S. epidermidis 2균주는 MIC 시험결과가두항생제모두감수성이거나내성으로판독되어최소억제농도분석에서제외하였다. CLI MIC는, D-zone 양성인 CNS 균종에서 0.25 μg/ml 이하의분포를보였으며 (Table 2), D-zone 음성인균주와차이가없었다. ERY MIC는 methicillin에내성이면서 D-zone 양성인균주는모두 128 μg/ml이상의고도내성을나타낸반면, methicillin에감수성이면서 D-zone 양성인 4 균주는모두중간내성 (intermediate) 을나타내었다. D-zone 음성의균주에서는 8 μg/ml이상의다양한내성분포를나타내었다 (Table 3). ERY의 MIC가한균주의 MRSA는 ERY MIC가 256 μg/ml 이상으로고도내성을나타내었고 CLI MIC가 1 μg/ml로중증도내성을보였음에도불구하고 D-zone test 양성을나타내었다. IV. 고찰 Macrolide, lincosamide와 streptogramin B계 (MLSB 계 ) 항생제의내성양상은구조적혹은유도성내성으로발 Table 1. Incidence of resistance phenotypes of staphylococci, blood isolates from SNUH from Jan. to Oct. 2005 No. (%) of methicillin resistant isolates** No. (%) of methicillin susceptible isolates Phenotype* (No. of isolate) S. aureus CNS S. aureus CNS ERY-S, CLI-S (111) 1 (4.5) 35 (19.3) 18 (64.3) 57 (73.1) ERY-S, CLI-I/R (3) 0 (0.0) 1 (0.6) 1 (3.6) 1 (1.3) ERY-I/R, CLI-S (59) 3 (13.6) 32 (17.7) 6 (21.4) 18 (23.1) ERY-I/R, CLI-I/R (136) 18 (81.8) 113 (62.4) 3 (10.7) 2 (2.6) Total (309) 22 181 28 78 * ERY, erythromycin; CLI, clindamycin; S, susceptible; I, intermediate; R, resistant. ** CNS, coagulase-negative Staphylococcus sp. 40

Table 2. Incidence of erythromycin-induced clindamycin resistant staphylococci, ERY-I/R, CLI-S phenotype isolate from Table 1 Organisms No. (%) of isolates with D-zone test result Positive Negative S. aureus 6 (66.7) 3 (33.3) Methicillin resistant 3 0 Methicillin susceptible 3 3 Coagulase-negative Staphylococcus sp. 13 (26.0) 37 (74.0) Methicillin resistant 10 22 Staphylococcus species 7 7 S. epidermidis 0 9 S. hominis 1 3 S. haemolyticus 0 3 S. intermedius 1 0 S. capitis 1 0 Methicillin susceptible 3 15 Staphylococcus species 1 5 S. epidermidis 1 8 S. hominis 0 1 S. intermedius 1 0 S. warneri 0 1 Total 19 40 Table 3. Distribution of clindamycin MIC (μg/ml) among D-zone test positive and negative staphylococci isolates D-zone Organisms* No. of isolates in each clindamycin MIC (μg/ml) 0.032 0.064 0.125 0.25 0.5 1 2 Positive MRCNS - 5 4 1 - - - MSCNS - - 1 - - - - MRSA - - 1 1-1 - MSSA - 1 2 - - - - Negative MRCNS 1 4 12 3 1 - - MSCNS - 8 7 - - - - MSSA - - 1 - - - 1 Total 1 18 28 5 1 1 1 * MRCNS, methicillin-resistant coagulase-negative Staphylococcus sp. MSCNS, methicillin-susceptible coagulase-negative Staphylococcus sp. MRSA, methicillin-resistant Staphylococcus aureus MSSA, methicillin-susceptible Staphylococcus aureus 생할수있다. Macrolides에속하는 ERY과 lincosamide에속하는 CLI은이들항생제중가장널리사용되는항생제로써, 세균의이들항생제에대한내성률은한국가내에서도지역에따라, 혹은병원에따라서도많은차이가있다고보고되어있다 (Schreckenberger 등, 2004). 우리나라에서도 Lim 등 (2002) 은포도구균의유도성 MLSB 내성이 10.2% 로보고하였으나, 본연구에서는 6.1% 로나타났다. 유도성 MLSB 내성은포도구균이외에 S. pneumoniae (Zhong 등, 1999; Kim 등, 2005), Enterococcus(Lim 등, 2002) 등의그람양성구균과혐기성세균 (Reig 등, 1992) 에서보고되었다. 서울대학교병원에서는 2005년 1년간분리된모든그람양성균에대하여유도성 MLSB 내성을조사하였으나포도구균이외의균종에서는유도성내성이관찰되지않았다. Table 5에 2005년 1년간분리된포도구균중 ERY-R, CLI-S의표현형을지닌균주를대상으로디스크근접검사로유도성내성결과를나타내었다. MRSA는 MSSA보다높은유도성 MLSB 내성률을보였 41

Table 4. Distribution of erythromycin MIC (μg/ml) among D-zone test positive and negative staphylococci isolates No. of isolates in each erythromycin MIC (μg/ml) D-zone Organisms* 1 2 4 8 16 32 64 128 >256 Positive MRCNS - - - - - - - 1 9 MSCNS - - 1 - - - - - - MRSA - - - - - - - - 3 MSSA 1 1 1 - - - - - - Negative MRCNS - - - - 1 2 5 4 9 MSCNS - - - - 2-2 2 9 MSSA - - - 1 - - - - 1 Total 1 1 2 1 3 2 7 7 31 * See Table 3. Table 5. Positive ratio of D-zone test for erythromycin resistant, clindamycin susceptible staphylococci isolated from SNUH in 2005 Organisms* Positive D-zone test Negative Total MRSA 57 (78.1%) 16 (21.9%) 73 MSSA 44 (57.9%) 32 (42.1%) 76 MRCNS 33 (14.1%) 201 (85.9%) 234 MSCNS 7 ( 8.3%) 77 (91.7%) 84 Total 141 (30.2%) 326 (69.8%) 467 * See Table 3. 으며, S. aureus보다전체적인양성률은낮지만 CNS에서도동일한경향을보이고있어, methicillin 내성포도구균은감수성인균보다는 ERY 내성에유도되는유도성 MLSB 내성률이높다는것을알수있었다. 이러한특징은미국내두개병원의포도구균을대상으로한연구 (Schreckenberger 등, 2004) 에서도같은결과를보였다. Steward 등 (2005) 은 D-zone test 결과가다양한형태로나타나는것을정리하여각양태와내성유전자의보유여부와의관계를분석하였으며, 결과판독의유의사항을보고하였다. 모두 3 가지양상의양성결과형태 (D, D+, Hazy-D) 를보인다고하였으며이중 Hazy-D 형태는비록희미한 D자형태의억제대가나타나지만모두구조적내성으로평가해야한다고하였다. Table 5의 D-zone 양성의결과는이러한 Hazy-D 형태의결과는배제되었다. 유도성 MLSB 내성균들의 MIC 특성은 Steward 등 (2005) 의결과와차이가없었으나, methicillin 감수성인포도구균 에서는 ERY에저도내성일지라도 CLI 내성을유도할수있다는근거를본연구에서 4균주찾을수있었다 (Table 4). 자동화장비를이용한최소억제농도검사법에의한감수성검사에서는유도성 MLSB 내성을감별할수있는정확한지침이없었다. 유도성 MLSB 내성을보이는균주를이용하여각항균제의최소억제농도간의분석을통하여선별기준을정하려는시도가있었으나실패하였으며 (Steward 등, 2005), 이경우에도간편한디스크근접시험검사를순수배양시에실시하여보고하는것이좋다고보고하였다 (Jorgensen 등, 2004). 본연구에서는비록분석균주가너무적기는하지만 ERY MIC가고도내성 (>128 μg/ml) 이면서 CLI MIC가감수성 (<0.25 μg/ml) 이면 MRSA에서는 100%, MRCNS에서는약 50% 가유도성 MLSB 내성을보였다. CLSI collaborative study(zelazny 등, 2005) 는 ERY와 CLI, 두디스크사이의거리가 15 mm와 26 mm인두방법에대한연구에서 26 mm인경우위음성의결과가나타날수있음을보여주고있으며균접종이많은부위에서는 15 mm 간격법을사용하는것이좋다고권장하였다. 그러나 15 mm 혹은 26 mm 간격법은, 전자는너무가깝게디스크를설치하는오류가쉬워각항생제의실제억제대의형태를확인할수없는경우가생기고, 후자는너무멀리디스크를설치하는오류가쉬워위음성의결과를초래하기때문에본연구에서는 20 mm 간격법을사용하였다. 또한검사업무의효율적인측면을고려하여디스크분주기에서 CLI 디스크를제거하여분주한후 CLI 디스크만인위적으로 ERY 디스크에근접하여설치하는방법을사용하였으며매우효율적으로판독이가능하다 42

는것을알수있었다. 전체포도구균의약 10% 내외의적은균주만이유도성 MLSB 내성을보이지만 ERY-I/R, CLI-S인감수성표현형을가진포도구균에서는 30% 대의높은양성률을보일뿐만아니라, 이러한세균의감염질환에 CLI 치료를받는환자의경우에는치료에실패할수있고, 특히 S. aureus의경우그독성이강해위험해질수있기때문에, D-zone test를이용한 CLI 유도내성검출은반드시실시되어야할것이다. 기존의디스크분주기를사용하는경우에는디스크배열을조절하여별도의시간과배지의소모없이쉽게검사할수있으므로매우유용하다고판단된다. 최소억제농도법을실시하는검사실에서도적절한기준을설정하고이들에대한디스크근접검사를실시하여유도성 MLSB 내성을보고할것을권장한다. 참고문헌 1. CLSI/NCCLS. Performance standards for antimicrobial susceptibility testing: Fifteenth informational supplement. CLSI Document M100-S15. CLSI, Wayne, Pa., 2005. 2. Drinkovic D, Fuller ER, Shore KP, Holland DJ, Ellis-Pegler R. Clindamycin treatment of Staphylococcus aureus expressing inducible clindamycin resistance. J Antimicrob Chemother 48:315-329, 2001. 3. Fiebelkorn KR, Crawford SA, McElmeel ML, Jorgrnsen JH. Practical disk diffusion method for detection of inducible clindamycin resistance in Staphylococcus aureus and coagulase-negative staphylococci. J Clin Microbiol 41(10):4740-4744, 2003. 4. Jorgensen JH, Crawford SA, McElmeel ML, Fiebelkorn KR. Detection of inducible resistance of staphylococci in cojunction with performance of automated broth susceptibility testing. J Clin Microbiol 42(4):1800-1802, 2004. 5. Kim NJ, Park SJ, Choi SH, Lee MS, Choo EJ, Kwak YG, Woo JH, Ryu J, Jeong JY, Kim YS. Characterization of erythromycin-resistant Streptococcus pneumoniae in Korea, and in vitro activity of telithromycin against erythromycin-resistant Streptococcus pneumoniae. Microb Drug Resist 11(3):260-265, 2005. 6. Lim JA, Kwon AR, Kim SK, Chong YS, Lee KW, Choi EC, Prevalence of resistance to macrolide, lincosamide and streptogramin antibiotics in Grampositive cocci isolated in a Korean hospital. J Antimicrob Chemother 49:489-495, 2002. 7. NCCLS. Performance standards for antimicrobial susceptibility testing: 12th informational supplement. NCCLS Document M100-S14. NCCLS, Wayne, Pa., 2004. 8. Reig M, Fernandez C, Ballesta JPG, Baquero F. Inducible expression of ribosomal clindamycin resistance in Bacteroides vulgatus. Antimicrob Agents Chemother 36(3):639-642, 1992. 9. Robert MC, Sutcliffe J, Courvalin P, Jensen LB, Rood J, Seppala H. Nomenclature for macrolidelincosamide-streptogramin B resistance determinants. Antimicrob Agents Chemother 43:2823-2830, 1999. 10. Rose JI, Eady EA, Cove JH, Cunliffe WJ, Baumberg S, Wootton JC. Inducible erythromycin resistance in staphylococci is encoded by a member of te ATPbinding transport super-gene family. Mol microbiol 4:1207-1214, 1990. 11. Rose JI, Farrell AM, Eady EA, Cove JH, Cunliffe WJ. Characterization an molecular cloning of the novel macrolide-streptogramin B resistance determinant from Staphylococcus epidermidis. J Antimicrob Chemother 24:851-862, 1989. 12. Schreckenberger PC, Ilendo E, Ristow KL. Incudence of consitutive and inducible cjindamycin resisyance in Staphylococcus aureus and coagulase-negative staphylococci in a community and a tertiary care hospital. J Clin Microbiol 42(6):2777-2779, 2004. 13. Siberry GK, Tekle T, Carroll K, Dick J. Failure of clindamycin treatment of methicillin-resistant Staphylococcus aureus expressing inducible clidamycin resistance in vitro. Clin Infect Dis 37:1257-1260, 2003. 14. Steward CD, Raney PM, Morrell AK, Williams PP, McDougal LK, Jevitt L, McGowan Jr JE, Tenover FC. Testing for induction of clindamycin resistance in erythromycin-resistant of Staphylococcus aureus. J 43

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