구절초 ( 九折草 ) 의감별자료집 Discrimination of Chrysanthemi Zawadskii Herba

구절초 ( 九折草 ) 의감별자료집 Discrimination of Chrysanthemi Zawadskii Herba

구절초 ( 九折草 ) 의감별자료집 CONTENTS 1. 기원및배경 / 5 2. 유전학적연구 / 8 3. 이화학적연구 / 38 4. 참고문헌 / 43

1 기원및배경 1) 기원 구절초 ( 九折草 ) 는국화과 (compositae) 생약으로서 대한민국약전외한약( 생약 ) 규격집 (KHP) 1) 에등재된품목으로, 그기원을 구절초 Chrysanthemum zawadskii Herbich var. latilobum (Maxim.) Kitamura 또는산구절초 Chrysanthemum zawadskii var. coreanum (Nakai) ( 국화과 Compositae) 의전초 로규정하고있다. 중화인민공화국 약전 (ChP), 일본약국방 (JP), 대만중약전 (THP), 홍콩중약재표준 (HKCMMS), 베트남 약전 (VP) 및조선민주주의인민공화국약전 (DP) 에는본생약이등재되어있지않다. 구절초 (Chrysanthemum zawadskii complex) 는동유럽에서아시아에걸쳐속내에서 가장넓게분포하는분류군으로다양한형태학적변이를가지는종내분류군들로 구성되어있다. 2) 국내에분포하는구절초무리에대해서는 Palibin이최초로 Chrysanthemum sibiricum Fisch. 를보고한이래로, 3) Nakai는새롭게 4종 2변종을 인식했다. 4-7) Kitamura는이전의분류체계와달리 C. sibiricum을 C. zawadskii Herbich로변경하고 Nakai가인식한 C. lucidum Nakai와 C. coreanum (H. Lév.) Nakai를 C. zawadskii의이명으로처리했다. 8) 그후 Kitamura는광의의국화속에서 삭과의횡단면이원주형으로물에젖으면점성을띄는특징을가지는식물들을협의의 국화속 (Dendranthema) 로구별하는견해를보이면서구절초무리역시 D. zawadskii (Her.) DC. 로학명을변경하였다. 9) 그러나최근에는다시 Chrysanthemum 으로속명이 변경되었다. 10,11) 대한민국약전외한약 ( 생약 ) 규격집에등재된구절초의학명은 C. zawadskii Herbich var. latilobum (Maxim.) Kitamura으로, 일본식물지에서도이와동일한학명을사용 하고있으나, 12) 국가표준식물목록과 13) 속식물지 (The Genera of Vascular Plants of Korea) 에서는 14) Kitamura가세분한속명인 Dendranthema를채용하고있으며, 중국 식물지에서는 15) 구절초를 C. naktongense Nakai로기재하여, 산구절초와별개의종으로 인식하고있다. Discrimination of Chrysanthemi Zawadskii Herba 5

대한민국약전외한약 ( 생약 ) 규격집에등재된산구절초의학명은 C. zawadskii var. coreanum (Nakai) 로, 정확한명명자를기재하지않아그출처가불분명하여확인할수없었다. 다만이와유사한학명으로는 C. zawadskii Nakai subsp. coreanum Y.N.Lee이있었으며, 16) 이는기존 Nakai가발표한한라구절초 C. coreanum를 C. zawadskii의아종으로인식한견해로, 산구절초의학명으로사용하기에적절하지못하다. 현재산구절초로인식되고있는분류군의학명은국가표준식물목록과속식물지, 일본식물지에서구절초무리의본종인 D. zawadskii var. zawadskii (Herb.) Tzvelev로인식되고있고, 중국식물지에서는구절초 C. naktongense Nakai와별개의종인 C. zawadskii Herbich로기재하고있다. 2) 배경및규정 (1) 국내산지및생산량 구절초 ( 九折草 ) 의기원인구절초 Chrysanthemum zawadskii Herbich var. latilobum (Maxim.) Kitamura 또는산구절초 Chrysanthemum zawadskii var. coreanum (Nakai) 는국내전역에흔히자생하는식물로도매유통단가에대한통계는있으나, 재배에관련된통계는제공되지않는것으로보아, 채집품또는수입에의존하는것으로보인다. (2) 공정서성상 1 구절초 ( 九折草 : Chrysanthemi Zawadskii Herba) 구절초 ( 九折草 ) 는대한민국약전외한약 ( 생약 ) 규격집에등재되어있으며, 구절초 Chrysanthemum zawadskii Herbich var. latilobum (Maxim.) Kitamura 또는산구절초 Chrysanthemum zawadskii var. coreanum (Nakai) ( 국화과 Compositae) 의전초를기원으로하며, 그성상을다음과같이규정하고있다. 이약은전초로줄기는둥글고길이 20 ~ 40 cm이며회록색 ~ 회갈색이다. 잎은달걀모양 ~ 넓은달걀모양으로줄기에어긋나게달려있고, 길이 3 ~ 4 cm, 너비 2 6 구절초 ( 九折草 ) 의감별자료집

~ 3 cm로깊게갈라졌으며, 잎자루는길이 1 ~ 2 cm이다. 꽃은두상화로지름 2 ~ 6 cm이고, 설상화는흰색이고, 관상화는노란색이다. 이약은특유한향기가있고맛은약간쓰다. 2 함량기준 대한민국약전외한약 ( 생약 ) 규격집 (KHP 4) 에서는함량기준이설정되어있지않다. Discrimination of Chrysanthemi Zawadskii Herba 7

2 유전학적연구 1) 실험방법 (1) DNA 추출 DNA 추출은건조한검체약 100 mg을막자사발에넣고액체질소를사용하여미세분말상태가되도록분쇄한다. 분말시료를 2 ml 튜브에옮겨담고, 500 µl의 lysis buffer(20 mm Tris-cl ph 8.0, 2 mm Sodium EDTA, 1.2 % Triton X-100, lysome 20 mg/ml) 에넣고 proteinase K 용액 (600 mau/ml 이상 ) 10 µl를첨가한후, 37 항온기에서 1시간반응시킨다음, 400 µl의 CTAB (Cetyl-trimethylammonium Bromide) 완충용액 (0.1 M Tris, ph 8.0; 1.4 M NaCl. 0.02 M EDTA, ph 8.0; 2% hexadecyltrimethylammonium bromide; 0.2 % 2-mercaptoethanol) 을첨가하고 65 항온기에서 30 분간처리한다. 이반응물에 Phenol : Chloroform : Isoamylalcohol (25 : 24 : 1) 600 µl와정제수 300 µl를첨가하여완전히섞이도록흔들어준다음 14000 rpm으로 20 에서 10 분간원심분리한다. 상층액 600 µl를취하여새로운 1.5 ml 튜브에넣고이소프로판올 600 µl을첨가한다음수차례교반한뒤 10 분간상온에서반응시킨후 14,000 rpm으로 20 에서 10 분간원심분리한다. 침전된 DNA를 70% 에탄올 500 µl로 2 3회세척하고상온에서자연건조시킨다. 건조된 DNA를 20 30 µl 멸균된 3차정제수에녹여 4 에서 1 시간동안방치한후 RNase(100 mg/ml, 7,000 units/ml) 2 µl를넣고, 37 조건에서 30분동안반응시킨다. 추출된 DNA를 1% agarose 겔에서전기영동하여확인한후 DNA 순도및농도를측정한다음증류수로희석하여정량한다. 8 구절초 ( 九折草 ) 의감별자료집

(2) PCR * 본연구에이용된바코드프라이머는아래의 < 표 2> 와같이문헌조사를통해얻어진바코드프라이머중 CBOL (Consortium for the Barcode of Life) 에서제안한 7개엽록체 DNA 부위의바코드프라이머와중국의과학연구원에서제안한핵내 45s rdna의 ITS2 부위의바코드프라이머를이용하였다. 이들 9개의프라이머세트로분석한결과에서종감별에이용할수있는종간차이점이없을시에는 trnl-trnf 구간의 intron과 spacer 구간의프라이머를이용하여추가적인분석을진행하였다. 바코드프라이머를이용한 PCR의조성은상용화된 PCR premix에 Forward primer(10 pmole) 1 µl, Reverse primer(10 pmole) 1 µl와정량한주형 DNA 20 ng/µl를혼합하고, 정제수를첨가하여최종반응용량을총 20 µl로한다. 반응조건은 94 에서 3 분간예비변성 (predenaturation) 한후 94 에서 30 초변성 (denaturation), 52 에서 30 초간결합 (annealing), 72 에서 30 초간증폭 (extension) 하고변성부터증폭까지의과정을 35 회반복한다음, 72 에서 5 분간최종증폭 (final extension) 을시켜 DNA 증폭산물을얻는다. PCR 결과물의상태에따라결합온도는 47 55 의범위에서조절한다. DNA 증폭산물은 2 % agarose 겔에점적하여전기영동한다음 Ethidium bromide 염색법이나, 형광염료 (Fluorescence Dye) 로처리하여증폭산물을확인하고, 다형성이확인되면종감별에이용한다. * Polymerase Chain reaction Discrimination of Chrysanthemi Zawadskii Herba 9

< 표 >. 구절초의기원확인에이용된 DNA 바코드프라이머 Target region Primer Primer Sequence rpoc1* rpoc1_2f rpoc1_4r GGCAAAGAGGGAAGATTTCG CCATAAGCATATCTTGAGTTGG Coding region matk* matk* matk_2f matk_3r 3F_KIM f 1R_KIM r ATGCAACGTCAAGCAGTTCC CCGTATGTGAAAAGAAGTATA CGTACAGTACTTTTGTGTTTACGAG ACCCAGTCCATCTGGAAATCTTGGTTC rbcl* rbcla_r rbcla_f GTAAAATCAAGTCCACCRCG ATGTCACCACAAACAGAGACTAAAGC cpdna atpf-atph* trnh-psba* atpf f atph r psba3 F trnhf_05 ACTCGCACACACTCCCTTTCC GCTTTTATGGAAGCTTTAACAAT GTTATGCATGAACGTAATGCTC CGCGCATGGTGGATTCACAATCC Non-coding region psbk-psbi* trnt-trnl** psbk f psbi r trn a trn b TTAGCCTTTGTTTGGCAAG AGAGTTTGAGAGTAAGCAT CATTACAAATGCGATGCTCT TCTACCGATTTCGCCATATC trnl-intron** trn c trn d CGAAATCGGTAGACGCTACG GGGGATAGAGGGACTTGAAC trnl-trnf** trn e trn f GGTTCAAGTCCCTCTATCCC ATTTGAACTGGTGACACGAG nrdna ITS2_1*** ITS2_2*** ITS2F ITS3R ITS3 ITS4 ATGCGATACTTGGTGTGAAT GACGCTTCTCCAGACTACAAT GCATCGATGAAGAACGCAGC TCCTCCGCTTATTGATATGC *, CBOL; A CBOL Plant working group (2009) A DNA barcode for land plants. Proc Nati Acad Sci USA. 106(31): 12794-12797. **, trnt-trnl; trnl-intron, trnl-trnf; Taberlet P et al. (1991) Universal primers for amplification of three non-coding regions of chloroplast DNA. Plant Molecular Biology 17: 1105-1109. ***, ITS2, Chen S. et al. (2010) Validation of the ITS2 Region as a Novel DNA Barcode for Identifying Medicinal Plant Species PLOS one. 7;5(1) e8613. 10 구절초 ( 九折草 ) 의감별자료집

(3) 염기서열분석염기서열분석은바코드프라이머를통해얻어진 PCR 산물을정제하여염기서열분석전문업체에의뢰하여진행하였고, 분석된결과는 Bioedit 7.0.9.0 및 MEGA 5.1 프로그램을사용하여정렬하였다. 각기원식물에대한염기서열분석결과를바탕으로 SNP (Single Nucleotide Polymorphism), SSR (Simple Sequence Repeat) 및 indel(insertion and Deletion) 등의염기서열차이를분석하여종간의차이점을확인하였다. 또한본연구에사용된바코드프라이머에서 PCR 결과물의다형성이없는품목에대해서는종감별프라이머를제작하기위해얻어진염기서열분석결과에서반복염기서열 (repetitive sequence) 이나, 단일반복염기서열 (poly-sequence) 이있는부분을피해서종감별을위한프라이머를제작하고자하였다. (4) 계통수작성 염기서열분석결과는 MEGA 5.1 프로그램을사용하여계통수를작성하고종감별및종간의유연관계를분석한다. 1 쌍거리비교법 (pairwise distance) 개체별, 종별염기서열의쌍거리비교 (pairwise distance) 는 MEGA 5.1 을사용하여 Kimura 2-parameter 모델로계산한다. 2 이웃연결계통수 (Neighbor joining tree, NJ) 이웃연결분석법 (NJ) 은각염기서열간의유사도를이용하여분석하는방법으로 MEGA 5.1 또는 PAUP version 4.0b을이용하여구한다. Kimura 2-parameter 모델을이용하며, 염기전환 (transversion) 과염기전이 (transition) 의치환을포함한다. Gap이나 missing data는무시하고 codon position은첫번째, 두번째, 세번째및비암호서열부분 (non-coding site) 을포함한다. Discrimination of Chrysanthemi Zawadskii Herba 11

(5) 차세대염기서열분석 (NGS) 연구방법 < 그림 >. 엽록체분석을위한흐름도 1 Miseq 용라이브러리제작 llumina Miseq용 Library construction: Covaris (S220) 를이용하여 peak power (175), duty factor (7.0), cycles/burst (200), time (50초), volume (50 ul) 조건하에 200 ng의 DNA를 550 bp 크기로 shearing 한다. 이후 Fragmented DNA를 Illumina TruSeq Nano DNA Sample Prep Kits의매뉴얼에따라 library로제작한다. 간단히요약하면, DNA를 magnetic bead를이용하여 clean up 한후 end repair 및 size selection 을수행한다. Size selection은 magnetic bead를이용하여 DNA의평균 size가 550bp가되게한다. DNA 3 쪽에 adenylation 시킨후 adapter를 12 구절초 ( 九折草 ) 의감별자료집

ligation 한다. 잔여 adapter를제거하기위해 magnetic bead를사용하고, 바로 DNA를증폭하기위해 PCR (8 cycles) 를수행한다. PCR 산물을 magnetic bead로 clean up 한후 library가정상적으로제작되었는지 bioanalyzer (Agilent) 로확인한다. 2 대용량염기서열분석가 Quantitative PCR - Phix (standard) 이용한 library 정량나 Sequencing - Instrument : Illumina Miseq - Kit : MiSeq Reagent Kit v3 (600 cycle) - Miseq run : 2x300 paired end read 다방법 : 5ul의 library와동량의 0.2N NaOH를섞어실온에 5분방치하여 DNA를 denature 시킨다. MiSeq Reagent Kit v3 에들어있는 1 ml의 pre-chilled HT1을 denature 된 DNA에첨가한다. 1 ml 중 600 ul를 reagent kit에넣은후기기를작동시켜 sequencing을수행한다. 3 시퀀스서열품질확인 4 Chloroplast genome de novo assemble 식물의엽록체를조립하는방법으로 shotgun sequencing 서열의초기조립을통해조립된 contigs로부터엽록체와관련된 contigs만을수집하여메꿔지지않는 gap을 closing하는과정을수행하는방법이있으며, metagenome에서관심있는미생물의유전체를조립하듯관련서열만을추출하여 subsets을만들고이들만을가지고 assemble을수행하는방법이있다. 본조립은후자의방법을통하여빠르게진행한후, 조립된염기서열에 raw data 서열을 mapping하여확인하는방법으로진행한다. 생산된서열데이터를 de novo assembly하기위해품질이좋은서열만을선별하고아답터를제거하기위한품질및 trimming 분석을진행한다. Discrimination of Chrysanthemi Zawadskii Herba 13

5 레퍼런스 Gap closing 조립하고메꿔지지않은 gap을 closing하기위하여 IMAGE (Tsai et. al., Genome Biology, 2010) 프로그램을이용하여 gap을 closing한다. 또한, manual curation을통하여 mate 정보가깨지는지역을강제로끊어 contig를나눈다. 이후, contig end에존재하는 single reads의 mate reads를 in house scripts를이용하여추출하여 assemble하고 end를확장하여 gap을 closing한다. 최종적으로, 조립된유전체정보에서열을다시 mapping하여 mate 정보가문제없이 alignment 되는지확인한다. < 그림 >. IMAGE 프로그램의진행개요도 6 Chloroplast genome 유전자지도작성 (Bioinformatic tool 을이용한 Chloroplast 특이성분석 ) 차세대유전자염기서열기법으로생산되어어셈블이완료된서열에대해 CpGAVAS (Chloroplast Genome Annotation, Visualization, Analysis and GenBank Submission 14 구절초 ( 九折草 ) 의감별자료집

Tool) 소프트웨어를이용하여해당엽록체에대한지도를작성하고 annotation 작업을수행한다. 7 완성된유전체비교분석및바코딩마커개발 8 분석식물의유전체비교분석가기원식물엽록체유전체서열을바탕으로각종과근연종간에유전조성의차이를비교분석함나염기서열과유전자정보를바탕으로다양한비교분석프로그램을이용하여 pair-wise alignment, multi-alignment 수행다엽록체염기서열 divergence를분석하여각각고유종의특이적인염기서열변이를동정하고유전자정보의차이를비교분석 9 유전자변이탐색을통한바코드후보지역발굴가종간엽록체유전체서열간다양성 (SSR, SNP, Indel) 정보의비교분석을통한마커개발나대표식물과근연종간에다양성분석을통한유연관계확인다식물엽록체유전체, rdna 정보분석방법을통한각종별엽록체, rdna 서열의완전해독을이루고동시에다양한변이를공통으로보이는지역을판별하여이를이용한종구분방법개발 10 종특이적마커선발가유전체정보를바탕으로종간차이를보이는바코딩마커중다양한근연종을포함하여동시에기원종을식별할수있는바코딩마커선발나각각의생약별로근연종혹은속식물 10개를비교분석하여기원종을식별할수있는바코드선발 11 선발된마커를사용한적용성테스트선발된마커를직접샘플에적용하여기원종감별정도를확인하고최종적으로마커를선별해낸다. Discrimination of Chrysanthemi Zawadskii Herba 15

2) 실험결과분석 (1) 구절초 ( 九折草, Chrysanthemi Zawadskii Herba) 의유전자분석가구절초 (Chrysanthemum zawadskii var. latilobum) 구절초에서 5개바코드구간의염기서열을분석한결과 matk와 atpf-atph, trnh-psba에서각각 2 가지 haplotype의종내변이가확인되었다. matk의 haplotype은 398 bp에서 G / T의염기전환 (transversion), atpf-atph의경우 246 bp와 769 bp에서각각 C / T, T / A의염기전환 (transversion) 및염기전위 (transition) 을보였고, trnh-psba는 65-71bp 사이의 AGTTACT 염기삽입및손실 (indel) 과 162 bp에서 A / C의염기전환인종내변이를보였다. < 그림 >. 구절초 matk 와 atpf-atph, trnh-psba 구간에서보이는 2 가지 haplotype 나산구절초 (Chrysanthemum zawadskii Herbich) 산구절초에서 5개바코드구간의염기서열을분석한결과 matk에서는 3가지의 haplotype, atpf-atph와 trnh-psba는종내변이에의해 2가지의 haplotype 확인하였다. matk 구간은 256, 398, 690 bp에서각각 G / G / A, T / G / G, A / G / A의염기서열변이를보이며 3가지의 haplotype으로나뉘었다. atpf-atph의 haplotype은각각 479-482 bp에서 AAAA / TTTT 염기서열을가지고, trnh-psba는 166 bp에서 16 구절초 ( 九折草 ) 의감별자료집

A / T 의염기전위를보이며 2 가지의 haplotype 을보였다. < 그림 >. 산구절초 matk 구간 (A) 와 atpf-atph(b), trnh-psba(c) 에서보이는각각의 haplotype 3) DNA 바코드를이용한구절초의기원종감별 (1) 구절초와산구절초의바코드구간분자유전학적분석 구절초의기원식물인구절초, 산구절초를구별하기위해엽록체 DNA와핵리보솜 DNA의 ITS 구간에대한바코드분석을진행하였다. 실험결과가장긴염기서열을가진구간은 matk (755 bp) 이고가장짧은구간은 ITS2 (472 bp) 이었다. 가장큰변이 (variable site) 를보이는구간은 atpf-atph (1.07%) 이고유전적거리 (P-distance) 가큰구간은 matk (0.002) 와 atpf-atph이었다. < 표 >. 구절초의염기서열분석결과 matk rbcl atpf-atph psba-trnh ITS2 Aligned (bp) 755 631 562 498 472 Conserved 747 631 556 490 470 Variable (%) 8 (1.06) 0 (0) 6 (1.07) 1 (0.2) 2 (0.42) P-distance (mean) 0-0.009 (0.002) 0 0-0.007 (0.002) 0-0.002 (0.001) 0 Discrimination of Chrysanthemi Zawadskii Herba 17

그러나분석한 5개구간모두에서거의동일한염기서열을보여구절초와산구절초, 두기원종을구별할수없었다. rbcl을제외한 4개구간 (matk, atpf-atph, psbatrnh 및 ITS2) 에서변이가나타났지만두종을구별할수있는종특이적인변이는아님을확인하였다. 그리고 matk와 atpf-atph는다른구간에비해유전적거리가크게나타났지만이역시종을구별할수없었다. (2) 구절초와산구절초의 DNA 바코드구간유연관계분석 18 구절초 ( 九折草 ) 의감별자료집

< 그림 >. 구절초와산구절초의 NJ 분석결과. (A) matk, (B) rbcl, (C) atpf-atph, (D) trnh-psba 및 (E) ITS2 구절초의 NJ 분석결과, matk, atpf-atph, psba-trnh, 3 구간은구절초와산구절초각분류군별로그룹이나누어지지않는결과를보였다. rbcl과 ITS2의경우구절초와산구절초의염기서열이모두동일하여구별할수없었다. 즉, 구절초는분석된 5개의모든구간에서구별할수없음을확인하였다. 본과제는 DNA 바코드를사용하여명확히동정된샘플을이용해차세대염기서열분석 (NGS) 을진행하고자하였다. 4) 구절초의차세대염기서열분석결과 (1) 구절초와산구절초의차세대염기서열분석결과 DNA 바코드로구별하기어려웠던구절초기원종의명확한분류기준을설정하기위하여엽록체유전체에대한차세대염기서열분석 (NGS) 을수행하였다. 차세대염기서열분석 (NGS) 은강원대학교식물자원보존연구센터에서대여한표본중구절초 ( 샘플번호 15D45) 와산구절초 (15D59) 를대상으로분석진행하였다. 1 구절초 (Chrysanthemum zawadskii var. latilobum) 구절초는평균길이 251 bp로추출된엽록체서열에해당하는엽록체 read의개수가 1,109,736으로총 278,543,736 bp 염기서열이엽록체서열로추출되었다. 이렇게일차적으로추출된엽록체염기서열을 de novo assembly 한결과 3개의 contig로구분되었으며, gap closing을통해서열을 mapping 하여최종 150,991 bp의엽록체유전체를완성하였다. Discrimination of Chrysanthemi Zawadskii Herba 19

2 산구절초 (Chrysanthemum zawadskii Herbich) 산구절초는평균길이 251 bp로추출된엽록체서열에해당하는엽록체 read의개수가 1,308,839로총 328,518,589 bp 염기서열이엽록체서열로추출되었다. 이렇게일차적으로추출된엽록체염기서열을 de novo assembly 한결과 1개의 contig로구분되었으며, gap closing을통해서열을 mapping 하여최종 150,043 bp의엽록체유전체를완성하였다. 구절초와산구절초두분류군의엽록체유전체는원형이고 Large single copy (LSC), small single copy (SSC) 와한쌍의 inverted region (IRa, IRb) 로구성되어있었다. 먼저구절초의각구조의길이는 LSC 82,771 bp, SSC 18,309 bp, IR 24,954 bp이었다. 총유전자수는 107개이고 protein coding gene 80개, trna 23개, rrna 4개로구성되어있었다. 산구절초는 LSC 82,826 bp, SSC 18,310,bp, IR 24,952 bp이었다. 총유전자수는 107개이고 protein coding gene 80개, trna 23개, rrna 4개로구절초와동일하게구성되어있었다. 가샘플품질확인 Trinean을이용하여 1차로 DNA의양과질을조사한후 Picogreen assay를통해보다정밀히 DNA양을측정하였다. 이후 Gel electrophoresis를통해 DNA를최종선택하였다. 최종선택된 DNA를 library 제작에사용하였다. < 그림 >. DNA 확인을위한전기영동 (F. 구절초, I. 산구절초 ) 20 구절초 ( 九折草 ) 의감별자료집

나라이브러리구축 (Library prep. 및 QC) Covaris (S220) 를이용하여 peak power (175), duty factor (7.0), cycles/burst (200), time (50초), volume (50 ul) 조건하에 200 ng의 DNA를 550 bp 크기로 shearing 하였다. 이후 Fragmented DNA를 Illumina TruSeq Nano DNA Sample Prep Kits의매뉴얼에따라 library로제작하였다. Size selection은 magnetic bead를이용하여 DNA의평균 size가 550bp가되게하였다. DNA 3 쪽에 adenylation 시킨후 adapter를 ligation 하였다. 잔여 adapter를제거하기위해 magnetic bead를사용하였고, 바로 DNA를증폭하기위해 PCR (8 cycles) 를수행하였다. PCR 산물을 magnetic bead로 clean up 한후 library가정상적으로제작되었는지 bioanalyzer (Agilent) 로확인하였다. < 그림 >. Bioanalyzer results(agilent 2100 Bioanalyzer) 다시퀀싱결과 (NGS 서열품질확인 ) 차세대염기서열분석기, miseq 을통해생산된서열은아래와같다. < 표 >. 시퀀스생산현황 샘플명 # Reads Yield(Bases) GC rate (%) %of>=q30 Bases(PF) 구절초 89,119,380 22,368,964,380 36.25 89.70 산구절초 92,484,042 23,213,494,542 36.07 89.10 Discrimination of Chrysanthemi Zawadskii Herba 21

< 표 >. Base sequence quality Read 1 Read 2 구절초 산구절초 라엽록체 de novo assembly 식물의엽록체를조립하는방법으로는 shotgun sequencing 서열의초기조립을통해조립된 contigs로부터엽록체와관련된 contigs만을수집하여메꿔지지않는 gap을 closing하는과정을수행하는방법이있으며, metagenome에서관심있는미생물의유전체를조립하듯관련서열만을추출하여 subsets을만들고이들만을가지고 assemble을수행하는방법이있다. 본조립은후자의방법을통하여빠르게진행한후, 조립된염기서열에 raw data 서열을 mapping하여확인하는방법으로진행하였다. 생산된서열데이터를 de novo assembly 하기위해품질이좋은서열만을선별하고아답터를제거하기위한품질및 trimming 분석을진행하였다. < 표 >. 엽록체로추출된서열 샘플명 엽록체 read 개수 평균길이 총사이즈 (bp) 구절초 1,109,736 251 278,543,736 산구절초 1,308,839 251 328,518,589 22 구절초 ( 九折草 ) 의감별자료집

선별된서열데이터는 CLCgenomics Workbench 소프트웨어를사용하여조립되었으며, 어셈블조건은아래와같다. - Ambiguous base = 0 - Quality limit = 0.01 - Min. number of nucleotides in reads = 300 - Similarity fraction: 0.95 - minimum size: 500-bp - minimum depth: 10 위결과를기반으로약하게 (Quality limit=0.01, Min. number of nucleotides in reads=150) trimming한서열을이용하여조립한결과와레퍼런스서열에 mapping 되어나온 contigs 결과를이용하여 contig ordering을수행하고 merge하였다. < 표 >. de novo assembly 결과 샘플명 contig 개수 총길이 (bp) 평균 depth 총 matched bases 구절초 3 127,009 2,828.4 359,232,256 산구절초 1 116,161 2,213.7 257,145,606 마레퍼런스 Gap-closing 메꿔지지않은 gap을 closing하기위하여 IMAGE (Tsai et. al., Genome Biology, 2010) 프로그램을이용하여 gap을 closing하였다. 또한, manual curation을통하여 mate 정보가깨지는지역을강제로끊어 contig를나누었다. 이후, contig end에존재하는 single reads의 mate reads를 in house scripts를이용하여추출하여 assemble하고 end를확장하여 gap을 closing하였다. 최종적으로, 조립된유전체정보에서열을다시 mapping하여 mate 정보가문제없이 alignment 되는지확인하였다. < 표 >. in silico gap closing 샘플명 contig 개수 평균 depth(x) 총길이 (bp) 비고 구절초 1 1,826.5 150,991 Circular (finished) 산구절초 1 2,155.5 151,043 Circular (finished) Discrimination of Chrysanthemi Zawadskii Herba 23

바유전자지도 < 그림 >. 구절초의엽록체유전체지도 사엽록체유전체의유전자위치 < 표 >. 산구절초의엽록체유전체의유전자위치 Gene Name class start end strand trnh-gtg trna_primary_transcript 10 83 - psba protein coding gene 467 1528 - matk protein coding gene 2083 3600 - rps16 protein coding gene 5220 5408 - trnq-ttg trna_primary_transcript 7208 7279 - psbk protein coding gene 7635 7814 + psbi protein coding gene 8178 8318 + trns-gct trna_primary_transcript 8453 8540-24 구절초 ( 九折草 ) 의감별자료집

Gene Name class start end strand trnc-gca trna_primary_transcript 9272 9342 + petn protein coding gene 9928 10017 + psbm protein coding gene 10547 10651 - trnd-gtc trna_primary_transcript 11321 11394 - trny-gta trna_primary_transcript 11515 11598 - trne-ttc trna_primary_transcript 11798 11869 - rpob protein coding gene 12733 15915 + rpoc1 protein coding gene 15942 18743 + rpoc2 protein coding gene 18851 23002 + rps2 protein coding gene 23255 23965 + atpi protein coding gene 24181 24924 + atph protein coding gene 26059 26304 + atpf protein coding gene 26669 27922 + atpa protein coding gene 27993 29519 + trnr-tct trna_primary_transcript 29652 29723 - trnt-ggt trna_primary_transcript 30890 30961 + psbd protein coding gene 32143 33204 + psbc protein coding gene 33113 34573 + trns-tga trna_primary_transcript 34783 34865 - psbz protein coding gene 35216 35404 + trng-gcc trna_primary_transcript 35719 35789 + trnm-cat trna_primary_transcript 35973 36046 - rps14 protein coding gene 36201 36503 - psab protein coding gene 36637 38841 - psaa protein coding gene 38867 41119 - ycf3 protein coding gene 41855 43814 - trns-gga trna_primary_transcript 44638 44724 + rps4 protein coding gene 45052 45657 - trnt-tgt trna_primary_transcript 46016 46088 - trnf-gaa trna_primary_transcript 47463 47535 + ndhj protein coding gene 48234 48710 - ndhk protein coding gene 48813 49662 - ndhk protein coding gene 48813 49490 - Discrimination of Chrysanthemi Zawadskii Herba 25

Gene Name class start end strand ndhc protein coding gene 49542 49904 - trnm-cat trna_primary_transcript 51879 51951 + atpe protein coding gene 52150 52551 - atpb protein coding gene 52548 54017 - rbcl protein coding gene 54763 56193 + accd protein coding gene 56778 58229 + psai protein coding gene 58708 58818 + ycf4 protein coding gene 59192 59746 + cema protein coding gene 60013 60702 + peta protein coding gene 60938 61900 + psbj protein coding gene 62635 62757 - psbl protein coding gene 62906 63022 - psbf protein coding gene 63045 63164 - psbe protein coding gene 63174 63425 - petl protein coding gene 64701 64796 + petg protein coding gene 64958 65071 + trnw-cca trna_primary_transcript 65184 65257 - trnp-tgg trna_primary_transcript 65441 65514 - psaj protein coding gene 65823 65951 + rpl33 protein coding gene 66391 66591 + rps18 protein coding gene 66767 67072 + rpl20 protein coding gene 67333 67713 - rps12 protein coding gene 68425 68553 - clpp protein coding gene 68707 70707 - psbb protein coding gene 71156 72682 + psbt protein coding gene 72861 72971 + psbn protein coding gene 73024 73254 - psbh protein coding gene 73263 73502 + petb protein coding gene 74368 75021 + petd protein coding gene 75843 76388 + rpoa protein coding gene 76577 77584 - rps11 protein coding gene 77664 78074 - rpl36 protein coding gene 78175 78288-26 구절초 ( 九折草 ) 의감별자료집

Gene Name class start end strand infa protein coding gene 78395 78628 - rps8 protein coding gene 78750 79154 - rpl14 protein coding gene 79336 79704 - rpl16 protein coding gene 79819 80229 - rps3 protein coding gene 81412 82068 - rpl22 protein coding gene 82053 82526 - rps19 protein coding gene 82608 82886 - rpl2 protein coding gene 82942 84431 - rpl23 protein coding gene 84450 84731 - trni-cat trna_primary_transcript 84897 84970 - ycf2 protein coding gene 85082 91882 + ycf15 protein coding gene 91931 92029 + trnl-caa trna_primary_transcript 92337 92417 - ndhb protein coding gene 92980 95182 - rps7 protein coding gene 95478 95945 - rps12 protein coding gene 96549 96857 - ycf15 protein coding gene 97742 97933 - trnv-gac trna_primary_transcript 98618 98689 + rrn16s rrna_primary_transcript 98916 100406 - rrn23s rrna_primary_transcript 102039 105462 - rrn4.5s rrna_primary_transcript 105562 105826 - rrn5s rrna_primary_transcript 105909 106030 + trnr-acg trna_primary_transcript 106276 106349 + trnn-gtt trna_primary_transcript 106823 106894 - ycf1 protein coding gene 107969 112237 + rps15 protein coding gene 112641 112919 + ndhh protein coding gene 113011 114192 + ndha protein coding gene 114194 116348 + ndhi protein coding gene 116425 116925 + ndhg protein coding gene 117284 117814 + ndhe protein coding gene 118016 118321 + psac protein coding gene 118554 118799 + ndhd protein coding gene 118898 120415 + Discrimination of Chrysanthemi Zawadskii Herba 27

Gene Name class start end strand ccsa protein coding gene 120617 121591 - ccsa protein coding gene 120617 121591 - trnl-tag trna_primary_transcript 121698 121777 - rpl32 protein coding gene 122648 122812 - ndhf protein coding gene 123804 126029 + ycf1 protein coding gene 126083 126649 - trnn-gtt trna_primary_transcript 126977 127048 + trnr-acg trna_primary_transcript 127522 127595 - rrn5s rrna_primary_transcript 127841 127962 - rrn4.5s rrna_primary_transcript 128045 128309 + rrn23s rrna_primary_transcript 128409 131832 + trnv-gac trna_primary_transcript 135182 135253 - ycf15 protein coding gene 135938 136129 + rps12 protein coding gene 137014 137322 + rps7 protein coding gene 137926 138393 + ndhb protein coding gene 138689 140891 + trnl-caa trna_primary_transcript 141454 141534 + ycf15 protein coding gene 141842 141940 - ycf2 protein coding gene 141989 148789 - trni-cat trna_primary_transcript 148901 148974 + rpl23 protein coding gene 149140 149421 + rpl2 protein coding gene 149440 150929 + < 표 >. 구절초의엽록체유전체의유전자위치 Gene Name class start end strand trnh-gtg trna_primary_transcript 10 83 - psba protein coding gene 467 1528 - matk protein coding gene 2063 3580 - rps16 protein coding gene 5199 5387 - trnq-ttg trna_primary_transcript 7181 7252 - psbk protein coding gene 7608 7787 + psbi protein coding gene 8151 8291 + 28 구절초 ( 九折草 ) 의감별자료집

Gene Name class start end strand trns-gct trna_primary_transcript 8425 8512 - trnc-gca trna_primary_transcript 9244 9314 + petn protein coding gene 9894 9983 + psbm protein coding gene 10513 10617 - trnd-gtc trna_primary_transcript 11284 11357 - trny-gta trna_primary_transcript 11478 11561 - trne-ttc trna_primary_transcript 11761 11832 - rpob protein coding gene 12699 15881 + rpoc1 protein coding gene 15908 18709 + rpoc2 protein coding gene 18817 22968 + rps2 protein coding gene 23221 23931 + atpi protein coding gene 24147 24890 + atph protein coding gene 26016 26261 + atpf protein coding gene 26626 27879 + atpa protein coding gene 27955 29481 + trnr-tct trna_primary_transcript 29614 29685 - trnt-ggt trna_primary_transcript 30858 30929 + psbd protein coding gene 32116 33177 + psbc protein coding gene 33086 34546 + trns-tga trna_primary_transcript 34757 34839 - psbz protein coding gene 35190 35378 + trng-gcc trna_primary_transcript 35693 35763 + trnm-cat trna_primary_transcript 35947 36020 - rps14 protein coding gene 36175 36477 - psab protein coding gene 36611 38815 - psaa protein coding gene 38841 41093 - ycf3 protein coding gene 41818 43775 - trns-gga trna_primary_transcript 44599 44685 + rps4 protein coding gene 45013 45618 - trnt-tgt trna_primary_transcript 45977 46049 - trnf-gaa trna_primary_transcript 47425 47497 + ndhj protein coding gene 48205 48681 - ndhk protein coding gene 48784 49461 - Discrimination of Chrysanthemi Zawadskii Herba 29

Gene Name class start end strand ndhk protein coding gene 48784 49634 - ndhc protein coding gene 49514 49876 - trnm-cat trna_primary_transcript 51853 51925 + atpe protein coding gene 52124 52525 - atpb protein coding gene 52522 53991 - rbcl protein coding gene 54737 56194 + accd protein coding gene 56753 58204 + psai protein coding gene 58676 58786 + ycf4 protein coding gene 59160 59714 + cema protein coding gene 59982 60671 + peta protein coding gene 60907 61869 + psbj protein coding gene 62603 62725 - psbl protein coding gene 62874 62990 - psbf protein coding gene 63013 63132 - psbe protein coding gene 63142 63393 - petl protein coding gene 64638 64733 + petg protein coding gene 64895 65008 + trnw-cca trna_primary_transcript 65121 65194 - trnp-tgg trna_primary_transcript 65378 65451 - psaj protein coding gene 65760 65888 + rpl33 protein coding gene 66327 66527 + rps18 protein coding gene 66703 67008 + rpl20 protein coding gene 67270 67650 - rps12 protein coding gene 68362 68490 - clpp protein coding gene 68645 70647 - psbb protein coding gene 71096 72622 + psbt protein coding gene 72801 72911 + psbn protein coding gene 72964 73194 - psbh protein coding gene 73203 73442 + petb protein coding gene 74308 74961 + petd protein coding gene 75799 76344 + rpoa protein coding gene 76533 77540 - rps11 protein coding gene 77620 78030-30 구절초 ( 九折草 ) 의감별자료집

Gene Name class start end strand rpl36 protein coding gene 78131 78244 - infa protein coding gene 78351 78584 - rps8 protein coding gene 78706 79110 - rpl14 protein coding gene 79295 79663 - rpl16 protein coding gene 79779 80189 - rps3 protein coding gene 81357 82013 - rpl22 protein coding gene 81998 82471 - rps19 protein coding gene 82553 82831 - rpl2 protein coding gene 82887 84376 - rpl23 protein coding gene 84395 84676 - trni-cat trna_primary_transcript 84842 84915 - ycf2 protein coding gene 85027 91827 + ycf15 protein coding gene 91876 91974 + trnl-caa trna_primary_transcript 92282 92362 - ndhb protein coding gene 92925 95127 - rps7 protein coding gene 95423 95890 - rps12 protein coding gene 96494 96802 - ycf15 protein coding gene 97688 97879 - trnv-gac trna_primary_transcript 98564 98635 + rrn16s rrna_primary_transcript 98862 100352 - rrn23s rrna_primary_transcript 101986 105409 - rrn4.5s rrna_primary_transcript 105509 105773 - rrn5s rrna_primary_transcript 105856 105977 + trnr-acg trna_primary_transcript 106223 106296 + trnn-gtt trna_primary_transcript 106770 106841 - ycf1 protein coding gene 107916 112184 + rps15 protein coding gene 112589 112867 + ndhh protein coding gene 112959 114140 + ndha protein coding gene 114142 116296 + ndhi protein coding gene 116373 116873 + ndhg protein coding gene 117232 117762 + ndhe protein coding gene 117964 118269 + psac protein coding gene 118503 118748 + Discrimination of Chrysanthemi Zawadskii Herba 31

Gene Name class start end strand ndhd protein coding gene 118849 120366 + ccsa protein coding gene 120568 121542 - ccsa protein coding gene 120568 121542 - trnl-tag trna_primary_transcript 121649 121728 - rpl32 protein coding gene 122609 122773 - ndhf protein coding gene 123767 125992 + ycf1 protein coding gene 126035 126595 - trnn-gtt trna_primary_transcript 126923 126994 + trnr-acg trna_primary_transcript 127468 127541 - rrn5s rrna_primary_transcript 127787 127908 - rrn4.5s rrna_primary_transcript 127991 128255 + rrn23s rrna_primary_transcript 128355 131778 + trnv-gac trna_primary_transcript 135129 135200 - ycf15 protein coding gene 135885 136076 + rps12 protein coding gene 136962 137270 + rps7 protein coding gene 137874 138341 + ndhb protein coding gene 138637 140839 + trnl-caa trna_primary_transcript 141402 141482 + ycf15 protein coding gene 141790 141888 - ycf2 protein coding gene 141937 148737 - trni-cat trna_primary_transcript 148849 148922 + rpl23 protein coding gene 149088 149369 + rpl2 protein coding gene 149388 150877 + 32 구절초 ( 九折草 ) 의감별자료집

(2) 구절초와산구절초의엽록체유전체비교 (synteny) 완성된엽록체에대해유전자의순서및구조를검증하기위한 synteny 분석을수행하여근연종내또는종간비교를통해유전체의특성 (Rearrangement: Fusion/ Duplication/ insertion/ inversion) 을확인하였다. < 그림 >. 산구절초및구절초 synteny map 구절초와산구절초의엽록체유전체를비교하여두분류군간의 SNP(142개 ) 과 Indel(64개 ) 을확인하였다. < 표 >. 구절초의엽록체유전체의유전자위치구절초와산구절초엽록체사이의 SNP 형태와각각의개수 SNP 형태 개수 SNP 형태 개수 AC 20 GA 16 AG 16 GC 5 AT 8 GT 12 CA 17 TA 4 CG 3 TC 18 CT 11 TG 12 합계 142 Discrimination of Chrysanthemi Zawadskii Herba 33

(3) 차세대염기서열분석결과에따른구절초와산구절초의종감별마커 NGS로분석된구절초와산구절초의엽록체유전체염기서열을비교하였고, 총 4개의구간에서 indel을바탕으로두분류군을구별할수있는마커를개발하였다. < 그림 >. 구절초와산구절초의종감별마커모식도 34 구절초 ( 九折草 ) 의감별자료집

< 표 >. 구절초와산구절초종감별마커후보군 No. Marker name Position Location Direction Primer seq.(5-3 ) 1 Chr01 matk 25146 2 Chr02 psba-ycf3 41318 3 Chr03 psbe-petl 64142 4 Chr04 rps12-ycf15 97371 F R F R F R F R GTTTGGTCCATTTATACCAT ATTTCGTTTGGTCAATCGTTG GGAAGTCGATCCGGGGCAAGTGTTC GCTAATGCCTACTCGCGTGATTTGG CTAGTCTTAGAATATAGTTGAACC CATTATAGACAGCACTAACAAGG GAGCGAAGGGTACGAAATAAATC TCACGGTACAATCCTC (4) 구절초, 산구절초의종감별마커의적용성테스트 NGS 분석결과확보한엽록체유전체의염기서열을활용하여구절초와산구절초의엽록체변이지역을바탕으로 2종을구분할수있는엽록체기반분자마커를개발한결과 InDel에기반한마커를개발하였고, matk 지역기반마커와 psaa-ycf3 구간에대한적용성테스트결과는다음과같다. < 그림 > 구절초와산구절초의종감별마커 2종에대한적용성테스트결과 (1: 구절초, 2: 산구절초 3-10: 시료 ) Discrimination of Chrysanthemi Zawadskii Herba 35

matk와 psaa-ycf3 구간은모두구절초와산구절초를 indel에따른증폭사이즈차이로구분할수있도록제작하였다. 적용성테스트를위해구절초 (15D45), 산구절초 (15D59) 와유통품 8개시료를대상으로하였다. 두구간에서모두 NGS분석시료의예상증폭결과와일치하게나왔으며, 유통품에서도각시료별로두기원종내의결과가분포하였다. 5) 결론및고찰 구절초는 대한약전외한약( 생약 ) 규격집 (2014) 에구절초 (Chrysanthemum zawadskii var. latilobum) 또는산구절초 (C. zawadskii) 의전초로수재되어있다. 유전적거리분석결과, DNA 바코드로분석한 5개구간모두에서구절초와산구절초는거의동일한염기서열을보여두기원종을구별할수없었다. rbcl을제외한 4개구간 (matk, atpf-atph, trnh-psba 및 ITS2) 에서변이를확인하였지만, 종내변이로두종 ( 구절초와산구절초 ) 을확인하기위한마커로는사용할수없었다. 또한 matk와 atpf-atph는다른구간에비해유전적거리가크게나타났지만이역시종을구별할수없었다. NJ 계통분석결과, matk, atpf-atph, trnh-psba rbcl 및 ITS2의경우구절초와산구절초의염기서열이모두동일하여구별할수없었다. 즉, 품목구절초는분석된 5개의모든구간에서구별할수없음을확인하였다. 국화과 2,315 종을대상으로 DNA 바코드구간분석을한연구결과에서보편성 (universality), 염기서열변이 (sequence variation), 및종해상력 (identification capability) 의관점에서 ITS2가가장유용했다고보고하고있으나 17), 이결과는국화과전체의분류군을대상으로분석된것으로변종 (variety) 수준에서는맞지않는것을확인하였다. 본과제는 DNA 바코드를사용하여명확히확인된샘플을이용해차세대염기서열분석 (NGS) 을진행하고자하였으나, 구절초의경우 DNA 바코드만으로는분류가어려워형태학적감별방법을통해동정하였다. 형태학적으로구절초와산구절초는잎의형태에따라구별할수있다. 구절초의잎은난형으로가장자리가 1회우상으로갈라지지만산구절초는 2회우상으로갈라지는것이차이점이다. 샘플은분류학자가종동정한식물표본으로써강원대학교식물자원보존연구센터 ( 구절초 ) 와국립원예특장과학원 ( 산구절초 ) 에서대여및분양한것을사용하였다. 36 구절초 ( 九折草 ) 의감별자료집

NGS 분석결과구절초의엽록체유전체는원형이고, 길이는 150,991 bp 이며, 산구절초는 150,043 bp 이었다. 두엽록체유전체염기서열을비교하였고, SNP(142 개 ) 과 Indel(64개 ) 을확인하였다. 그중 Indel을기반으로두분류군을구별할수있는마커를개발하였다. 그중 matk와 psaa-ycf3의 2개구간을이용하여적용성테스트를수행한결과유통품내에서 2개의기원종내의결과가분포함을확인할수있었으며, 정확한감별확인을위해서는보다많은시료의테스트가필요하다. 두분류군을유전학적인방법으로구별하는것은본연구가처음이고기존의 DNA 바코드구간외에새로운구간을제시할수있게되다. 이번연구의결과를이용하여구절초의기원이되는구절초, 산구절초를구별하는것은한약재의올바른유통뿐만아니라식물계통분류학적으로도도움이될것으로사료된다. Discrimination of Chrysanthemi Zawadskii Herba 37

3 이화학적연구 대한민국약전외한약 ( 생약 ) 규격집에서아래 < 표 10> 와같이규정하고있다. < 표 >. 각국공정서의구절초 ( 九折草 ) 기원및확인시험 공정서기원확인시험함량시험 KHP 구절초 : Chrysanthemum zawadskii Herbich var. latilobum (Maxim.) Kitamura 산구절초 : Chrysanthemum zawadskii var. coreanum (Nakai) 정색반응 - 외국공정서에는수재되어있지않음 1) 시료처리 구절초 1 g을 50% MeOH 20 ml을넣고초음파추출방법으로 60분간추출하였다. 이후추출액을 membrane filter (0.45 μm) 에통과시킨후그중 10 μl를 HPLC 분석시의검액으로사용하였다. 지표성분의농도는 chlorogenic acid (1), apigenin- 7-O-β-D-glucuronide (4) 은 100 µg/ml 이며, 3,4-di-O-caffeoylquinic acid (2), 4,5-di-O-caffeoylquinic acid (5) 은 25 µg/ml, 3,5-di-O-caffeoylquinic acid (3), linarin (6) 은 200 µg/ml 로하였다. 38 구절초 ( 九折草 ) 의감별자료집

2) 대상성분 < 그림 >. 성분명및구조 3) 분석조건 < 표 >. HPLC analytical condition Time (min) 0.1 % FA in DW (%) 0.1 % FA in AcCN (%) 0 90 10 Mobile phase 10 85 15 15 80 20 30 80 20 50 65 35 Detector UV (310 nm) Column X select C18 (4.6 250 mm, 5 μm) Flow rate 1 ml/min Injection volume 10 μl Temperature 30 Device Agilent 1260 series - DAD *formic acid **distiled water ***acetonitrile Discrimination of Chrysanthemi Zawadskii Herba 39

4) HPLC-UV 크로마토그램 구절초 (C. zawadskii var. latilobum) 및산구절초 (C. zawadskii var. coreamum) 는 chlorogenic acid (1), 3,4-di-O-caffeoylquinic acid (2), 3,5-di-O-caffeoylquinic acid (3), apigenin-7-o-β-d-glucuronide (4), 4,5-di-O-caffeoylquinic acid (5), linarin (6) 의성분확인으로생약명구절초의확인이가능함을확인하였다. < 그림 >. HPLC chromatogram 지표성분, 구절초, 산구절초 chlorogenic acid (1) 3,4-di-O-caffeoylquinic acid (2) 3,5-di-O-caffeoylquinic acid (3), apigenin-7-o-β-d-glucuronide (4), 4,5-di-O-caffeoylquinic acid (5), linarin (6) 40 구절초 ( 九折草 ) 의감별자료집

5) 특이성 chlorogenic acid (1) 3,4-di-O-caffeoylquinic acid (2) 3,5-di-O-caffeoylquinic acid (3) apigenin-7-o-β-d-glucuronide (4) 4,5-di-O-caffeoylquinic acid (5) linarin (6) < 그림 >. 구절초의 UV spectrum Discrimination of Chrysanthemi Zawadskii Herba 41

6) 결론및고찰 구절초 ( 九折草 ) 는 대한민국약전외한약( 생약 ) 규격집 에등재되어있는품목으로국화과 (Compositae) 에속하는구절초 Chrysanthemum zawadskii Herbich var. latilobum (Maxim.) Kitamura 또는산구절초 Chrysanthemum zawadskii var. coreanum(nakai) 의전초로국외공정서에는수재되어있지않다. 구절초의감별에있어 chlorogenic acid (1), 3,4-di-O-caffeoylquinic acid (2), 3,5-di-O-caffeoylquinic acid (3), apigenin-7-o-β-d-glucuronide (4), 4,5-di-O-caffeoylquinic acid (5), linarin (6) 6종의지표성분으로동시분석법을개발하여특이성및반복성등을검토한결과구절초의분석법으로적합하다고판단하였다. 하지만구절초와산구절초에서지표성분의유무와함량의차이는정확하게구분이되지않았다. 위의결과는 [NGS를활용한 구절초 2품목의유전학적감별연구 ] 에서구절초의연구결과와동일한것으로확인되었다. 하지만이화학적감별결과와유전학적감별결과를토대로관능적감별결과를제시한다면생약명인구절초의감별이가능할것으로예상된다. 결과적으로구절초와산구절초가같은생약명으로유통되는데있어서같은지표성분을가지고있기때문에구분하여유통하지않아도적절하게품질관리가가능할것으로보인다. 42 구절초 ( 九折草 ) 의감별자료집

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감별자료집 발행처 : 식품의약품안전평가원 발행일 : 2017 년 4 월 발행인 : 식품의약품안전평가원손여원 편집위원장 : 식품의약품안전평가원의료제품연구부서경원 편집위원 : 식품의약품안전평가원의료제품연구부생약연구과성락선, 심영훈, 김종환, 강일현, 현성예, 이규하, 이재준, 황대선, 김규엽, 김선혜 자문위원 : 국립생물자원관이병윤과장, 서울대학교성상현교수, 서울대학교양태진교수 문 의 처 : 28159 충청북도청주시흥덕구오송읍오송생명2로 187 오송보건의료행정타운식품의약품안전평가원생약연구과 전화 : 043) 719-4807 팩스 : 043) 719-4800