최신연구동향 1 유산균발현시스템개발현황 충북대학교식품생명공학과 한남수교수 1. Lactic acid bacteria 유산균 ( 젖산균, lactic acid bacteria) 은다양한식품산업에이용되고있는산업적으로중요한미생물로, 다양한탄소원을이용하여빠른속도로젖산을생성하고

최신연구동향 1 유산균발현시스템개발현황 충북대학교식품생명공학과 한남수교수 1. Lactic acid bacteria 유산균 ( 젖산균, lactic acid bacteria) 은다양한식품산업에이용되고있는산업적으로중요한미생물로, 다양한탄소원을이용하여빠른속도로젖산을생성하고이로인해식품의저장기간을연장시키는역할을하며이외에도식품에있어향기, 물성, 그리고영양학적으로유익한측면을제공한다. 특히, 치즈나유산균발효유로대표되는유가공산업이나김치등의채소발효산업에흔히이용되는데, 약 20종의다양한 genera의유산균중식품산업에서는 Lactococcus, Lactobacillus, Leuconostoc, Oenococcus, Pediococcus, 그리고 Streptococcus가많이이용되고있다. 유산균의대사경로는생물공학적으로사용되는다른미생물에비해단순하여합성능력과생산되는대사물질의다양성이제한되는반면, 오히려단순한대사경로는본미생물을대사공학적용도로개발하는데있어서장점으로평가된다. 더욱이에너지대사경로와생합성경로가거의완벽하게분리되어있어서로간에영향을미치지않는점은큰장점으로간주된다. 유산균을이용한생물공학적연구는대표적으로 Lactococcus lactis를이용하여다양한대사공학적시도들을성공적으로수행하며활발히진행되어왔다. 본연구동향에서는지금까지개발된유산균의유전자재조합기술들을소개하고이들을바탕으로수행된다양한대사공학적연구사례를정리하였다. 2. Food-grade concept: Consideration of regulatory framework 재조합 food-grade 유산균을단백질, 효소와같은다양한물질들을생산할수 있는세포공장으로서새롭게이용하기위해서는우선유산균의안전한사용을

위한법률체계에대한이해가필요하다. [de Vos 1999a; Salminen et al. 1998; Sybesma et al. 2006]. 예를들어Lactobacillus균은 food-grade 미생물이지만 GMO(genetically modified organism) 로써식품에이용하기위해서는엄격하게규제를받고있다 [Gruère and Rao 2007; Renault 2002]. 식품에 GMO의사용규제는전세계적으로다르게규정되어있는데 [Gruère and Rao 2007; Renault 2002], 미국의경우에는약간의규제만을하는반면, 유럽이나오세아니아에서는식품생산에 GMO의이용규제를엄격히준수하고있다. 또한, " 유전자변형 (Genetic modification) " 과 GMO의정의는국가와관련기관에따라다르게정의되고있다. 미국의경우 " 유전자변형 " 은어떤기술을이용하여 DNA sequence를변형시킨것으로, 그돌연변이균주의특성에따라승인이되며 [FDA 2001], 재조합 DNA기술을이용하여개량된미생물로제조된식품은 bioengineered foods 이라하고 GMO라는용어는사용하지않는다 [Pedersen et al. 2005]. 미국의규정에의하면 GM(genetically modified) 유산균은 GRAS라분류되며몇년동안식품산업에서시장을형성하고있다. 대조적으로유럽의유산균시장은자연적으로발생하지않고 in vitro에서개량된모든미생물들을 GMO로간주하고 [EC 2001], 오세아니아에서는 in vitro 기술을이용한몇가지규정된유전적기술을이용하여만들어진미생물만을 GMO라정의한다 [Hobbs 2001]. Lactobacilli는독소가없고, 건강증진효과를주는프로바이오틱으로써식품생산공정에수천년동안이용이되고있는 GRAS이고 QPS(Qualified Presumption of Safety) 미생물로지난 10년동안재조합발현숙주로꾸준히이용되어왔다. 또한, Lactococcus lactis 유산균모델은 1990년초에개발된이후로지난 10년동안단백질재조합발현시스템으로써발전되어왔다 [Kleerebezem et al. 1997; Konings et al. 2000; Mierau and Kleerebezem 2005]. GM-유산균를이용한발현시스템은식품의안전한사용을위해몇가지충족되고고려될사항이있는데, 이를 "Food-grade concept" 이라한다. 이용어는유산균발현시스템이처음으로개발된 1990년대부터사용되었고,

Johansen [1999] 에의해 food-grade 발현시스템의엄격한정의및기준은다음과같이설명되었다. Food-grade 발현시스템의가장중요한기준은유전공학적용도로사용되는숙주는안전하고, 안정적인특징을가지고있으며, GRAS 또는 QPS 이어야한다. 더불어식품과호환가능한선발표지 (selectable maker) 를사용해야되는데, 항생제저항유전자표지는배제되어야하고숙주나발현시스템에의해서해롭거나, 독소를생성하거나, 알레르기를일으키는성분이생성되지않아야되고, 모든유전적변형은자가복제로이뤄져야한다. 또한, food-grade 시스템으로써또다른중요한특징은바이오산업이나식량생산산업에있어서대규모로산업에응용가능하며사람이 food-grade modified된유산균을섭취하였을때위장관에서안정적이어야한다. 엄격한 food-grade는같은 genus의종에서유래한유전자나식품미생물에서얻은유전자를가진유산균군으로정의할수있다. 넓은범위로는최종적으로 food - grade 균주의 DNA가완전히제거가되었을때, non-gras 또는 QPS 미생물에서유래한유전자도승인이된다. 이것은식품효소와 EFSA(European Food Safety Authority ) 의안내에관한현재 EC 규정과는대조적으로 [EC 2008; EFSA 2009], 식품효소에대한 EC 규제는안전에대해상세평가후, 각효소에대해안전성이확보되면승인후에식품에첨가될수있다. Food-grade concept를기초로하여많은시스템들이지난 20년간발전해왔고, 특히재조합 Lactococcus와 Lactobacilli의발현시스템의이용이증가되어왔다. 다양한종류의 Lactobacilli 숙주와프로모터, food-grade 선발표지가개발되었고 [Diep et al. 2009; Morello et al. 2008], 이시스템을이용한재조합효소와생백신 (live vaccine) 의생산연구가관심을받고있다.

표1: Guidelines for the use of GMO in food products in several regions [Carter and Gruère 2007] Area Definition GMO Product Labelling Authority China Organism in which DNA has been modified using any recombinant Yes, also if no novel DNA or recombinant protein is detectable Chinese Ministry of Science and Technology technology (MOST) Organism in which DNA Yes, also if no novel has been modified in a DNA or recombinant European Food Europe way that does not occur protein is detectable, Safety Authority naturally by mating and/or product threshold (EFSA) natural recombination 0.9% Only when novel Organism in which DNA DNA or recombinant Food Standards Oceania has been modified by any protein is detectable, Australia New in vitro technique otherwise not Zealand (FSANZ) United States Term not used; GMO foods are designated as bioengineered required Only if food differs significantly from conventional equivalent Food and Drug Administration (FDA) 3. Lactic acid bacteria for recombinant protein production 미생물을유전적으로변형하고재조합미생물로이용하기위한첫번째과정은형질전환기술을이용하여외래유전자를미생물내로도입하는것이다. 1980년말에 Lactobacilli의형질전환에관한연구가처음발표된이래로, 다양한종류의 Lactibacilli가재조합단백질생산에이용이되었다. [Aukrust and Blom 1992; Aukrust and Nes 1988; de Vos 1987; Natori et al. 1990]. Electroporation, protoplast formation, conjugation methods등의형질전환기술들이발전되어 Lb. acidophilus, Lb. casei, Lb. helveticus, Lb. plantarum Lb. reuteri, Lb. sakei, 와 Lb. pentosus들유산균에외래유전자를도입하여재조합 Lactobacilli로부터외래단백질 (heterologous protein) 및다양한 origin의 antigen을생산할수있었으며 [Bermudez-Humaran et al. 2011; Tarahomjoo 2012; Wells and Mercenier 2008]

[Hashiba et al. 1992; Kok 1996; Pouwels and Leer 1993; Wanker et al. 1995], 이외에도다양한종류의유산균에서많은단백질이성공적으로발현, 생산되었다 ( 표2). 표2. Lactobacilli which have been used for the recombinant expression of proteins Strain Recombinant protein Yield* Induction Reference Lb. plantarum α-amylase 1,154 nkat/l constitutive [Fitzsimons et al. 1994] Aminopeptidase N n. d. constitutive [Takala and Saris 2002] Aminopeptidase N 53 nkat [Sorvig et al. /mgprotein 2005] Chitinase 0.42 [Nguyen et al. 2012] Cholesterol Oxidase 0.06 constitutive [Kiatpapan et al. 2001] β-galactosidase 1,017 [Halbmayr et al. 2008] β-glucosidase 2,500 [Böhmer et al. 2012] β-glucuronidase 1680 Miller Units [Sorvig et al. 2005] Green fluorescent protein n. d. Nisin [Geoffroy et al. 2000] Oxalat Decarboxylase 43.3 [Kolandaswa my et al. 2009] Malolactic enzyme 368 [Schümann et al. 2012] Green fluorescent protein n. d. Nisin [Geoffroy et al. 2000] Lb. casei Cholesterol Oxidase 0.015 constitutive [Kiatpapan et al. 2001] β-glucosidase 1,070 [Böhmer et al. 2012]

Levanase 8,335 nkat/l Inulin Xylose-isomerase n. d. D-Xylose [Wanker et al. 1995] [Posno et al. 1991] Lb. sakei Aminopeptidase N 80 [Sorvig et al. 2005] β-glucuronidase 1590 Miller Units [Sorvig et al. 2005] β-galactosidase 492 [Halbmayr et al. 2008] * denoted in nkat in order to make them comparable, if no conversion possible similar to that presented in the original publications : sakacin P inducing peptide; inducing peptide of 19 amino acids 표2. Lactobacilli which have been used for the recombinant expression of proteins Strain Recombinant protein Yield* Induction Reference Lb. reuteri α-amylase 82 nkat/ml Nisin [Wu et al. per OD600nm 2006] β-glucanase / 14.3/25.0 Lactose [Liu et al. Xylanase nkat/ml 2007] [Lin et al. Lb. acidophilus β-galactosidase 35 nkat/ml Lactose 1996] Alcohol Lb. brevis dehydrogenase / Pyruvate 30/58 nkat/mg Lactose [Liu et al. 2007] decarboxylase 1250 μg Lb. bulgaricus Nuclease digested constitutive DNA/mL Lb. helveticus α-amylase n. d. Lactose scfv antibody Lb. paracasei 500 μg/l constitutive fragment [Chouayekh et al. 2009] [Hashiba et al. 1992] [Martin et al. 2011] Mannanase 90 nkat/ml constitutive [Yoon 2012] Lb. pentosus Chloramphenicolacetyltransferasen. d. Xylose [Lokman et al. 1994]

* denoted in nkat in order to make them comparable, if no conversion possible similar to that presented in the original publications : sakacin P inducing peptide; inducing peptide of 19 amino acids 4. Integration벡터 Integration벡터는유전자의넉아웃 (knock-out), 증폭 (amplification), 교체 (replacement) 그리고삽입 (insertion) 에사용되고있다. 삽입서열의전위 (transposition via IS elements) 및 att/integrase systems을이용하여특정부위에재조합, suicide 또는temperature sensitive vectors를이용한 homologous recombination 방법이흔히사용한다 [2]. 유산균 integration벡터시스템은 onestep Campbell-like integration과 one-이나 two-step homologous recombination 두가지형태로구분된다. Campbell-like integration은 integration 동안에 complete vector DNA가염색체내부로삽입되고, 염색체내부와같은위치에 plasmid가 multi-copy integration이일어나게된다. one-이나 two-step homologous recombination 기술은벡터와chromosome 사이에 homologous region이존재하면발생할수있는데, one-step gene replacement 가일어날때, 동시에 crossover (double crossover) 가일어나고, two-step이일어날때는연속적으로 integration벡터가 loop-out deletion에의해 integration (single crossover) 이일어나게된후 chromosomal deletion이되거나 integration gene이염색체내부로삽입된다 [3]. Campbell-like integration은 Leenhouts에의해 Lc. lactis에서복제가되지않는 origin을가지고있는pbr322 (E.coli) 와 pe194 (Staphylococcus aureus) 을이용하여처음으로시도되었다. 그후, pbluescript SK vector의 E.coli replicon 유전자를이용한 chromosomal integration연구가진행되었다 [4, 5]. Lactococcal origin을이용한 integration벡터는복제개시단백질 (RepA) 이불활성화된 lactococcal broad host range plasmid인 pwv01를이용하여개발된 pori/pint 벡터시리즈를사용한다. 이벡터는 RepA을제공하여그람양성균

(Lc. lactis LL108) 뿐만아니라그람음성균 (E. coli EC1000) 에서 integration 벡터로이용된다. Chromosome에 integration된 plasmid는항생제마커를이용하여선발한후 integration벡터의 lacz reporter gene을이용하여후 loop-out deletion을할수가있다. 이와같은방법으로 sucrose-specific enzyme II을코드하는 scra유전자와 sucrose-6-phosphate hydrolase을코드하는 scrb유전자로구성된 pint (pwv01 replication origin) integration벡터를 erythromycin 내성유전자를교체하여, chromosome안에 target유전자를 Campbell-like integration하여 foodgrade system으로이용한사례가있다 [6]. 4.1 온도민감형플라스미드 (Temperature-sensitive plasmids) 염색체내부로유전자를삽입하기위해조건 / 비조건적으로복제하는플라스미드의원리를이용한 temperature-sensitive 벡터를이용한다. Integration벡터인 pg+ 시리즈는조건부플라스미드로 temperature-sensitive replicon을가지고있어, permissive temperaure ( 예 28 ) 에서그람양성균과그람음성균에서복제가되지만생장온도를높이게되면 (35 이상 ) 복제개시단백질 (RepA) 이불활성화되어벡터의복제와숙주염색체안에삽입되는능력을잃게된다. RepA+ temperature sensitive helper plasmid인 pve6007 [7] 와 RepA- vector인 pori280 [8] 는또다른 homologous recombination 시스템으로사용된다. 이들두개의플라스미드는 permissive temperature에서는유지하지만생장온도가높아지면 pve6007 helper plasmid에서는 RepA가불활성화되고, RepA가존재하지않는 pori280에서는복제와 chromosome안으로삽입을할수없게된다 [2]. Russell and Klaenhammer [9] 는 thermophilic lactobacilli의 pwv01 replicon을기초로한 temperature-sensitive helper plasmid인 ptrk669를개발하였고, Neu and Henrich [10] 는 thermophilic lactobacilli를위한 ptn1 vector를기초로한

integration 벡터를개발하였다. 이플라스미드는 Lb. curvatus 의 rolling-circle 플라스미드인 tplc2 에서유래하여 42 이하에서복제능력을불활성화시킨다. 5. 발현벡터-ON/OFF 유도시스템유산균에서동형유전자 (homologous protein) 와이형유전자 (heterologous protein) 를발현하기위한발현벡터에는복제될유전자의전사를조절하기위해서적절한프로모터가존재한다. 주로 transcription terminator는복제될유전자의 downstream에위치하고있어벡터의유전자전사를종결하고불필요한전사를막아주고, Signal sequences는생성된단백질을분비시키기위해사용이되며생성된단백질의정제를용이하게하기위해일반적으로 His-tag 이나다른인공적인태그를붙여사용한다. 만일발현벡터의프로모터 strength가강하고유전자발현이매우높으면, 생성된단백질은세포질 (cytoplasm) 안에축적되고생물학적활성이없는 inclusion bodies를생성하게된다. 또한몇몇의단백질의경우고농도로생성이되면오히려세포에독성을나타낸다 [1]. 그로인해발현수준을적절히조절할수있는여러가지유도프로모터 (inducible promoters) 가개발되었다. 유도프로모터에는 sugar와 NaCl 조절프로모터, ph의감소, 온도의변화와파아지감염프로모터가있다 [2]. 지금까지는 NICE라불리는 nisin 유도프로모터가유산균균주에널리사용이되고있으며특히 Lc. lactis에이용되고있다. Nisin은 nisin cluster에의해조절되어유산균에서생합성되는항균성을가진펩타이드이고, NICE 시스템은 nisa 프로모터에의해유전자를조절하는플라스미드로 Lc. lactis의 nisin gene cluster에서 histidine kinase를코드하는 NisK유전자와 response regulator역할을하는 NisR유전자로구성이되어두개의유전자의조절에의해신호변화를준다 [12]. NICE 플라스미드는 nisin을생성하지않고 NisR와 NisK 단백질을생성하는균주에도입되어세포가생장하는대수기때배지에첨가된 nisin에의해 nisa 프로모터가조절되는데, 발현수준은첨가된 nisin양과비례하고단백질의생성수준은총생산 soluble 단백질의 10% 에서 60% 까지증가율을보였다 [12]. Nisin 유도시스템은 Lc. lactis외의다른유산균에서숙주세포와유도효율에의한내성으로인해 nisr와 nisk의발현수준에서문제가될수있으나, nisin은 food-grade물질로값이저렴하고적은양 (0.05-5 ng/ml) 으로도정확하게단백질생산을 on/off 로유도할수가있어생산시스템으로많은장점을가지고있다. 또다른유도프로모터로 Lb sakei와 Lb. plantarum에서 class Ⅱ bacteriocin sakacin A (sap gene cluster) 나 sakacin P (spp gene cluster) 의프로모터와조절유전자를이용한 psip벡터가개발되었고 [13, 14], 이시스템은 pheromone 펩타이드를첨가하여단백질발현을유도할수있다.

lacz PnisA ErmC ColE Rep D NICE system 9463 bp NisK RepE NisR NisI RepG 그림 1. Schematic overview of the NICE vector and psip vector expression system. PnisA; promoter, NisR and NisK; regulation, NisI; immunity, PsppA or PsppQ; promoter, sppk and sppr; regulation 6. 합성프로모터 (synthetic promoters) Jensen and Hammer [15] 은목표유전자 (targeted gene) 의발현수준을높이고 매우안정된발현시스템을얻고자합성프로모터의라이브러리를기초로한 Lc. lactis 발현시스템을개발하였다. 프로모터부분의 -35 와 -10 에일치하는 염기서열 (consensus sequences) 을일정하게유지하고염기서열간에일치하지 않는 spacer sequences 부분은랜덤한염기서열로대체하였다. 랜덤하게존재하는 spacer sequences 의프로모터는 degenerated single-stranded promoter oligonucleotide 에의해합성하였고이를 β-galactosidase 유전자 (lacl and lacm) 발현에적용하였다. 합성프로모터는단백질발현량을 10-1000 배로 다양하게조절할수있으며유산균뿐만아니라다른미생물에서도유용하게 적용이가능하다 [16]. 표 3. Constitutive promoter for the expression in lactic acid bacteria Promoter Reporter Gene Host References pepc, pepn, pepx, pepo, pepe, pepo2, hsp17 β-glucuronidase (gusa) Lactobacillus helveticus (Chen, 2005) slp, ldhl,ermb GFP Lactococcus lactis, (green fluorescent protein ) Lactobacillus reuteri (Lizier et al.,2010) Lactobacillus casei, ldh promoter GFP Lactobacillus plantarum, (Sun et al., 2010)

Lactobacillus fermentum, Lactobacillus brevis putative promoter chloramphenicol resistance Lactobacillus casei ssp. gene Alactosus (An et al., 2006) P2 Luciferase Lactococcus lactis ssp. cremoris (Jeong et al, 2006) pneumococcal GFP Lactococcus lactis (Palencia et al., 2000) p32 GFP Leuconostoc mesenteroides (Lee et al., 2007) Synthetic Promoter β-glucuronidase (GusA) Lactobacillus sakei, aminopeptidase N (PepN) Lactobacillus plantarum (Rud et al, 2006) bacteriophage Φ 31 promoter β-galactosidase Lactococcus lactis (O'sullivan et al, 1996) pep; proteolytic enzyme genes, hsp; small heat-shock protein gene, slp; surface layer protein gene, ldh; lactate dehydrogenase gene, erm; enterococcal rrna adenine N-6-methyltransferase gene 7. Food-grade 선발표지 (selectable marker) Food-grade시스템은숙주안에서 integration과발현벡터의안정성을기초로하여, 식품에사용이가능한다양한선발표지개발이필요하다. 무엇보다항생제내성선발표지의경우인간장내미생물로항생제내성이전이될수있으므로사용할수없으며, 이를대체하기위해dominant와 complementation 선발방법을이용하여선발표지를개발해왔다. [17, 18]. 높은활성을보이는 dominant선발은재조합유산균을선발함에있어서항생제내성선발표지의사용과같은효과를보이며 host의특정유전자에의존하지않으므로유산균의다양한종에서이용된다. Nisin에내성이있는 nsr유전자는 hydrophobic 단백질로써, dominant선발에이용이된다. pnp40 (60 kb) 벡터에 nsr유전자를도입하여 food-grade 선발표지로사용되고있으며 [19], Takala and Saris [20] 는 nisin 면역유전자인 nisi를이용하여 pleb590 벡터를개발하였고, class II bacteriocin lactacin F를코딩하는 Lb. johnsonii lafi유전자를이용하여 lactacin F에민감도를보이는균주에사용가능한 ptrk434/435발현시스템을개발하였다 [21]. Two-component food-grade 클로닝시스템은 Lc. lactis MG 1363과산업용 Lc. Lactis 균주에서사용되고있는데 [22], 이시스템은 theta type메커니즘으로

복제가이루어지며선발표지가없는 pvec1와, repb유전자가불활성화되고 erythromycin 내성유전자를가지고있는 pcom1으로두가지벡터로구성되어있다. Erythromycin첨가배지에 pvec1와 pcom1 벡터가같이복제가되어야만생존할수있으며, pcom1와같은 theta type메커니즘으로복제하는벡터는세포분열과구조면에서안정성을보이기때문에선발후항생제가없는배지에생장시킬경우에 pcom1만을복제하는미생물을선발할수있다. O Sullivan [23, 24] 는 natural co-integrate lactococcal plasmid pah90(26kb) 을이용하여 cadmium 내성으로재조합유산균을선발하는방법을개발하였으며, Strep. thermophilus [25, 26] 와 L. lactis [27] 균주에이용했다. 최근에는 Lb. plantarum 유래의 bile salt hydrolase을이용한 dominant 선발표지가개발되어, Lb. casei에서 bsh유전자를발현시켰을때, 재조합유산균은 0.1% bile salt (glycodeoxycholic acid sodium, GDCA) 에서생육이되지만 wild-type Lb. casei는 0.05% GDCA에서생장이저해되어재조합유산균을선발할수있다. Posno [28] 은 D-xylose와같은당대사능력을이용한 dominant 선발방법을처음으로개발했다. Lb. pentosus에서 D-xylose를코드하는 xylrab 유전자를이용한 E. coli-lactobacillus 셔틀벡터는 erythromycin을첨가한배지에서 D- xylose를대사할수있어 food-grade 마커로써사용이될수있다. 또한, Lactococcus raffinolactis균주에서b-galactosidase유전자를이용하여 melibiose 대사할수있는발현벡터를개발하였다 [29]. 안정적이고선택적인 host/vector시스템을개발하기위한또다른방법으로는미생물의대사경로나어떤특성을부여하는필수적인단계에관련된 chromosome 유전자를돌연변이시키는 complementation방법이이용된다. Complementation을구축하기위해서 host chromosome안에목적유전자를 knock-out한돌연변이균주를선발한후, 양립할수있는 complementation을도입한벡터를구축한다. Dickley[54] 는 Purine 생합성경로에서 nonsense suppressor (ocher suppressor유전자 supb) 의돌연변이를일으킨 Lc. Lactis를

이용하여영양요구성 food-grade마커를도입한 pfg1를개발하였다. Alanine racemase를코드하는 alr유전자를이용한 complementation이개발되었다. Alanine racemase는 L-alanine과 D-alanine의상호작용을촉매하여세포벽합성에관여하여 Lb. plantarum와 Lc. lactis [31] 생장에필수적으로필요한효소로써, Lb. plantarum와 Lc. Lactis의 chromosomal alr유전자내부의 100bp와 30bp부분을각각제거하여 D-alanine 영양요구성균주를선발하였고, lactococcal/lactobacillal alr유전자로구성된 pgip벡터를이용된다. 그외에다양한유산균에서 chromosomal lactose operon을특정적으로돌연변이를일으켜서 complementation마커로이용된다 [32]. 8. 유산균에서 food-grade gene expression 사례 Hernández은 [36] strawberry (Fragariax ananassa) 유래의 alcohol acyltransferase (SAAT) 와 linalool/nerolidol synthase (FaNES) 를코딩하는두가지유전자를 NICE system을이용하여발현시켜 fruit flavor metabolites, esters 그리고 terpenoid를각각합성할수있었고, 면역단백질생산에있어서 peanut (Arachis hypogaea) allergen Ara h2을코딩하는유전자를 signal sequence (SP310mut2) 와 lactate-inducible lactococcal P170 promotor를이용하여 Lc. Lactis에서발현을수행하였다 [37]. 항시발현 Lactococcal P32 promoter와 NICE system을이용하여 Bacillus subtilis nattokinase 생산을 Lc. lactis에서연구하여혈전증 (thrombosis) 을예방하거나조절할수있는물질을생산하였으며 [38], 그외로 oral vaccine 및단백질 delivery 연구가 Lc. lactis에서진행이되어 murine cytokine IFN-γ[39, 40], Helicobacter pyloris urease subunit B [41], a hepatitis B virus surface antigen [42], 또는 Listeria monocytogenes antigens P60와 LLO [43] 을생산하였다. 표 4. Secretion system for the expression in Lactic acid bacteria Protein Gene Origin Host References Reporter Nuc nuc Staphylococcus aureus Lc. lactis (Loir et al., 1994) β-lactamase bla Escherichia coli Lc. lactis (Sivakov et al., 1991)

α-amylase amys Geobacillus (formerly Bacillus) Lc. lactis (Loir et al., 1998) α-amylase amyl Bacillus licheniformis Lc. lactis (Perez et al., 1992) Bacterial antigens Urease subunit B ttfc Helicobacter pilori Lc. lactis (Lee et al., 2001) TTFC ttfc Helicobacter pilori Lc. lactis (Wells et al., 1993) Eukaryotic antigens GLURP-MSP3 fusion protein Plasmodium falciparum Lc. lactis (Teisen et al., 2004) Viral antigens E7 E7 HPV type-16 Lc. lactis (Bermude et al., 2002) BCV epitope BCV Bovine coronavirus Lc. lactis (Lomgella et al., 1996) VP8 subunit of VP4 VP8 rotavirus Lc. lactis (Gil et al., 2001) Interleukins IL-2 IL-2 Mouse Lc. lactis (Steidler et al., 1998) IL-6 IL-6 Mouse Lc. lactis (Shina et al., 2000) IL-10 IL-10 Mouse Lc. lactis (Steidler et al., 2001) IL-12 IL-12 Mouse Lc. lactis (Bermude et al., 2003) IFN-ω IFN-ω Ovine Lc. lactis (Bermude et al., 2003) 표 5. Display system for the expression in Lactic acid bacteria Protein Gene Origin Host References Reporter Nuc nuc Staphylococcus aureus Lc. lactis (Dieye et al., 2001) M6 Streptococcus pyogenes Lc. lactis (Piard et al., 1997) Streptavidin SA Streptomyces avidinii Lc. lactis (Steidler et al., 1998) Bacterial antigens L7/L12 L7/L12 Brucella abortus Lc. lactis (Ribeiro et al., 2002) Viral antigens E7 E7 HPV type-16 Lc. lactis (Bermude et al., 2002) Virulence factors Fibronectin binding protein A fnbpa Staphylococcus aureus Lc. lactis (Sinha et al., 2000) Clumping factor A clfa Staphylococcus aureus Lc. lactis (Que et al., 2000) Clumping factor A and clfb B Staphylococcus aureus Lc. lactis (O'Brien et al., 2002) serine-aspartate sdre Staphylococcus aureus Lc. lactis (O'Brien et al., 2002) repeat protein Protein A spa Staphylococcus aureus Lc. lactis (Steidler et al., 1998) Enzyme Cell Surface Protease prtb Lactobacillus Lc. lactis (Bernasconi et al.,

delbrueckii subsp. 2002) bulgaricus