Product News Letter 2 호 Newly Developed, Highly Qualified Restriction Enzymes CUT-PROOF Restriction Enzymes 고순도정제단백질효소 정확한 Unit 함량 엄격한품질관리및애프터서비스 타사대비누구나만족할만한저렴한가격 은단백질전문기술기업입니다기술혁신형중소기업입니다 ISO9001 인증기업입니다 충분한재고확보로발주즉시출고고객문의 : 042-581-8448 E-mail : sales@elpisbio.com URL :
제한효소란? 제한효소는분자생물학의기본작업인클로닝은물론유전체의비교분석실험등에널리사용되고있는가장기초적인실험도구입니다. 현재까지약 18,000여종의제한효소가다양한미생물에서보고되었으며 (http://rebase.neb.com/rebase/rebase.html), 이중약 640여종이제품화되어판매되고있습니다. 제한효소에의한제한 / 변형시스템 (restriction/modification system) 은미생물의방어기작중하나로서외래유전물질의침입에대처하기위한미생물의자구책으로진화하였습니다. 변형은 methyltransferase에의해메틸기가유전자에수식되는방법으로이루어지며, 제한효소는메틸기가도입된자기유전자와메틸기가없거나또는메틸화패턴이다른외래유전자를정확히구분하여절단함으로써외래유전자를제거하는방식으로이루어지고있습니다. 제한 / 변형시스템은하나의유전자클러스터로작동하는경우가많으며, methylase ( 또는 methyltransferase) 는제한효소와동일한서열을인식하고있습니다. 메틸기가수식된 DNA는제한효소의접근을방해함으로써제한효소의절단으로부터유전자를보호하게됩니다. 결론적으로제한효소는특정한 DNA 서열을인식하여절단하는효소입니다. 클로닝의가장기본적인작업이 DNA를절단하고붙이는것이라했을때, DNA 절단은제한효소에의해, 붙이는것은 ligase에의해이루어집니다. 제한효소는인식자리 (recognition site) 에서특정한염기서열을인식하고제한자리 (restriction site) 에서 DNA를절단합니다. 따라서제품화된제한효소에는인식자리와제한자리를정확히표기하여야합니다. 제한효소의인식자리와제한자리의표기는제조사에따라방식이조금씩다를수있지만같은효소라면표기방식이다르더라도동일한서열을인식절단하는것이므로이점만명심한다면크게혼동되는일은없을것입니다. 다음은 BamH I의표기방법입니다. GGATCC는 BamH I의인식자리이며제한자리는각각화살표와실선으로표기되어있습니다. N사의경우 5 G G A T C C 3 5 G G A T C C 3 3 C C T A G G 5 3 C C T A G G 5 엘피스바이오텍의경우 G G A T C C 5 G G A T C C 3 C C T A G G 3 C C T A G G 5 + + 제한효소의종류 제한효소소단위 (subunit) 의구성, 서열의특이성, 절단하는위치, 그리고조효소의종류및필요성에따라크게 3가지 (I, II, III) 로분류되고있습니다. 이중에서우리가실험실에서많이사용하고있는제한효소는 II형으로서서열의특이성과절단위치에따라 8가지로세분되고있지만, 크게주의해야하는사항은 methyl기의존재여부에따라제한이이루어지는 Dpn I 정도입니다. 제한효소는발견된미생물의속명머리글자 1문자와종명머리글자 2문자, 주명으로표기합니다. 그리고한균주가여러개의제한효소를가지고있는경우발견된순서에따라로마자로순서를구분합니다. Xho I의경우를보면 Xanthomonas holicola의첫문자를따고처음발견되었기때문에로마자 I을넣어명명한것입니다. 따라서동종에서두번째로발견된제한효소는 Xho II가됩니다. 흔히많이사용하는효소주의하나인 EcoR I은 Escherichia coli RY13 균주에서처음분리된효소입니다. 따라서효소의이름만으로도효소가발견된균주를추정할수있는것입니다. 제한효소의활성단위 제한효소의활성단위는 unit으로표시되며, 1 unit은기준조건에서 1 µg의 DNA를 1시간동안 100% 절단할수있는효소의양으로표시를하고있습니다. 활성단위의결정은 lambda DNA를기질로주로사용하고있으며, 경우에따라서는 methyl기가없는 lambda DNA (dam 또는 dcm methyl 수식에의한절단이제한되는효소의경우 ) 나또는 pbr322와같은 plasmid DNA를사용하기도합니다. 제한효소는주로 5-20 unit/µl로제품화되어포장되며, 여기에는 ph 유지를위한 buffer, 50-200mM의 NaCl 또는 KCl, 산화를방지하기위한 DTT, 단백질분해효소를억제하기위한 EDTA, -20 에서결빙을방지하기위한 50% 의 Glycerol이첨가됩니다.
제한효소의보관 제한효소는 20 에보관해야합니다. 전용보관용기를사용하는것이가장좋으며, 전용보관용기가없는경우냉동고에서꺼낸제한효소는즉시얼음위에두어야합니다. 제한효소는 20 에보관하는경우 1년이상안정하지만상온에방치하는경우활성이급격히저하될수있기때문입니다. 장기간보관하는경우에는 70 의초저온냉동고에보관하는것이바람직하지만, 잦은해동과냉동으로인한얼음결정의생성은효소의활성에치명적일수있으므로일회개봉후에는반드시 20 에보관하는것이좋습니다. 다른모든단백질효소류와같이보관만잘하면현저한활성저하없이 10년은무난히사용할수있습니다. Buffer와 BSA는 20 에보관하는것을권장하지만, 4 냉장고에보관하여도활성저하는나타나지않습니다. 제한효소를잘사용하는방법 1. 제한효소사용시필수고려사항 Methyl화영향 :DNA의메틸화는제한효소활성에중대한영향을주므로사용하고자하는제한효소의메틸화특성과자르고자하는 DNA의메틸화여부를사전에반드시확인해야합니다. 생명체에존재하는 methyl화반응은크게 Dam methylation, Dcm methylation, CpG methylation으로나눌수있는데, Dam과 Dcm methylation은주로미생물의메틸화반응이고고등생물의경우엔 CpG 메틸화반응이주를이루고있습니다. 따라서고등동식물로부터추출한 genomic DNA를절단하고자할때사용할제한효소가 CpG 메틸화에영향을받는지반드시확인을해야하는것입니다. 가령 Ava I, Not I, Sma I 등의효소들은인식자리의 C에메틸기가붙어있을경우, 그부위를절단할수없습니다. 또한 Apa I 이나 Ban I 등은인식자리의다음염기가 G 가되고마지막 C염기에메틸화가되어있으면그부위를절단하지못합니다. 이와같은내용은외우기쉽지않은내용으로서사전에제한효소의메틸화특성표를충분히살펴보아주의를기울여야합니다. 흔히 Plasmid DNA의 cloning에사용하는대장균주들은 dam과 dcm 유전자를가지고있습니다. 이와같은대장균주에서정제한 DNA는 GATC의 A염기에그리고 CCWGG의처음 C염기에메틸화가되어있는데, 몇몇제한효소는이와같은메틸화에의해절단이제한되고있습니다. Bcl I, Dpn II, Mbo I은 Dam 메틸화 DNA를절단하지못하며, Apa I은인식자리 GGGCCC 다음에 WGG가오고다섯번째 C에메틸화가되어있으면이 DNA를자르지못합니다. 따라서정확한메틸화에대한이해가없으면, 제한효소처리후예상외의분석결과가나오더라도이를적절히해석하기어렵습니다. 메틸화반응에대한자세한내용은초보자로서는쉽게이해하기어려운내용이지만제한효소가메틸화반응에영향을받는다는사실을주지하고사전에메틸화특성표를살펴보는습관만갖는다면메틸화반응에의한이상결과에당황하지않을수있습니다. Additional Base : Plasmid vector를두개의제한효소로절단해야하는경우나또는 PCR 산물을제한효소로절단해야하는경우에있어서인식자리가 DNA의끝부분에위치하면그 DNA는 100% 잘리지않는경우가발생할수있습니다. 가령 BamH I을예로들어설명하면, DNA가 5 -GGATCC -3 의서열을가질때 BamH I의인식부위는 GGATCC이지만절단되는효율은 0% 가됩니다. 한개의추가염기가존재하는경우말단에존재하는경우, 즉 5 -CGGATCC -3 의서열일때는 20시간을처리해도 20% 수준밖에는절단이되지않습니다. 반면 2개이상의추가염기가존재할경우그효율은 1시간처리만으로도 90% 이상이절단되는데, 이와같이모든제한효소에는 100% 절단에필요한최소의추가염기수가존재합니다. 2-3개만의추가염기로도효율이높은제한효소가있는반면, Nde I과같은효소는최소 7개이상의추가염기가있어야하는등제한효소에따라요구되는추가염기수가다르므로사전에이에대한충분한이해가필요합니다. 따라서제한효소의특성표를사전에반드시확인해봐야하는내용입니다. 반응부피 : 10-100 µl가적절합니다. DNA의양 : 0.05-1 µg/µl의 DNA가적절합니다. 너무높은농도의 DNA를사용하면 DNA용액의높은점성으로인해반응이저해될수도있습니다. DNA의순도 : O.D. 260/280 비율이 1.8 이상인 DNA를권장합니다. DNA를정제하는과정에서오염될수있는 salt, ethanol, phenol 등의오염물질들은제한효소의활성을저해하거나 star activity를유발할수있습니다. 그리고, DNA를정제하는과정에포함될수있는단백질들은제한효소의작용에큰영향을주지는못하지만, EndA + 균주를이용해정제한 plasmid DNA의경우에는 endonuclease A가오염될수있으므로제한효소를처리하는과정중에 endonuclease A에의해 DNA가모두깨질수있다는점에특히주의를해야합니다.
제한효소의양 : 1 unit이 1 µg의 DNA를자르는활성단위임을고려하여첨가할효소의양을결정하여야합니다. DNA의양과제한효소의포장 unit을고려하지않은채 enzyme을 volume 기준으로만사용하는것은좋지않은실험방식입니다. 그러나많은회사들은활성 unit 대비 100% 절단을위해 5-10배가량의제한효소사용을권장하고있으며, 경우에따라서는반응시간을늘리는것또한권장하고있습니다. 반응온도 : 일반적으로는 37 를권장하고있으나, 효소에따라서 25 를권장하는경우 (Apa I, Sma I) 그리고 50 (Bcl I, Sfi I) 나 65 (Taq I, Pho I 등 ) 를권장하는경우가있으므로실험전반드시카탈로그나매뉴얼을통해최적활성온도를확인해야합니다. 그리고높은온도에서장시간반응을하게되면반응용액의증발로최종부피의변화가생길수있으므로장시간처리를해야하는경우에는 water bath보다는 tube의내외부온도가같아증발이이루어지지않는항온기를사용하는것이좋습니다. Buffer의사용 : 특수한경우를제외하고는기본적인 Buffer 4종이사용되고있습니다. 제한효소에따라권장 Buffer가있으므로반드시해당하는 Buffer를사용해야하며, double cut을해야하는경우엔도표 (Double Digestion Buffer Guide) 를참조하여최적의 Buffer를선택한후사용해야합니다. Buffer는상온에보관하더라도활성저해는나타나지않지만가능한 4 에보관하는것이좋습니다. BSA 등첨가제 : Bovine serum albumin (BSA) 은효소의최적활성에필요한경우가있으며, 이는제한효소의특성표에표기되어있으므로사전에확인하여권장하는양으로사용해야합니다. BSA의첨가에대한언급이없는제한효소의경우에, BSA의첨가가반응저해로나타나지는않습니다. 따라서 double cut의경우, 한종류의제한효소사용에 BSA의첨가가표시되어있다면 BSA를사용해야합니다. 반응혼합액의제조 : 반드시다음과같은순서를지켜야합니다. DNA 용액 1/10 vol 10x Buffer BSA 제한효소 반응전체반응용액의부피를결정한후첨가할 10x Buffer, BSA 그리고제한효소의부피를뺀만큼 DNA용액의부피를계산하여넣어주고위의순서대로첨가해야합니다. 제한효소는반드시맨마지막에넣어야한다는점을명심해야합니다. 또한 BSA는 10x Buffer의조건에서는높은염농도로인해침전이발생할수있으므로반드시희석된 buffer에첨가해야합니다. 반응물의혼합은가벼운 pipetting이나손가락으로 tube의끝을톡톡치는정도로해주는것이좋으며, 심한 vortexing을하게되면반응물의심하게튀어최종부피의변화가생길수도있음에주의해야합니다. 2. 반응종결및분석불활성화 : 제한효소의반응후불활성화는반드시필요한것은아니지만, 이후의다른작업을위해필요하다면매뉴얼에있는방법에따라불활성화를시켜주어야합니다. 전기영동분석 : 6x Gel loading buffer를 1/6 수준으로반응액에첨가한후적절한 % 의 agarose gel에서분석합니다. 제한효소의 buffer에포함되어있는 salt는 DNA의전기영동 pattern에영향을주어정확한크기와맞지않는경우가발생할수있습니다. 따라서정확한크기비교를해야하는경우에는 phenol/chloroform 추출방법이나. PCR purification kit를이용해 DNA를사전에깨끗이정제한후전기영동분석을하는것이좋습니다. 전기영동분석은 0.5x TAE buffer를사용하는것이보편적이며, 보다나은해상도를요구하는실험의경우엔, 0.5x 또는 1x TBE buffer system을권장합니다. DNA전기영동의해상도는사용하는 agarose의품질과도밀접한관계가있으므로좋은결과를위해서는좋은품질의 agarose를사용해야합니다. 6x Gel loading buffer : 30% glycerol, 0.1% bromophenol blue, 0.1% xylene cyanol 50x TAE buffer : 242g Tris base, 37.2g Na 2 EDTA in 900ml DW. Add 57.1ml glacial acetic acid and adjust to final 1Liter 사용하기전에증류수로 100배희석하시면됩니다. 1% Agarose gel (0.5x TAE) : 1g agarose를저울로재어 100ml의 0.5x TAE에넣고, 4-6분간전자레인지를이용해녹여줍니다. 부족한부분은증류수 ( 절대 TAE가아님 ) 로채우고손으로만졌을때따뜻한정도까지식힌후 EtBr을첨가하고, gel tray에부어굳히면됩니다. 남은 gel용액은 55 항온기에보관하시면됩니다.
표준반응예시 예시1) 1 µg의 pbluescript DNA를 cloning을위해 BamH I과 Xho I으로절단하는경우 1 µg pbluescript in 16 µl DW 2 µl 10x BamH I buffer 0.2 µl 100x BSA 0.1-0.5 µl BamH I (10 unit/µl) 0.1-0.5 µl XhoI (10 unit/µl) Adjust to final 20 µl with DW, incubate for 1-2hr at 37 Gel electrophoresis on a 0.7% agarose gel in 0.5x TAE DNA purification by Gel Extraction Kit 예시2) 1 µg의 pbluescript DNA를 cloning을위해 Sma I으로절단하고 Alkaline phosphatase를처리하는경우 1 µg pbluescript in 16 µl DW 2 µl 10x Buffer 4 0.1-0.5 µl Sma I (10 unit/µl) Adjust to final 20 µl with DW, incubate for 1-2hr at 25 Add alkaline phosphatase to reaction mix according to the user s manual Gel electrophoresis on a 0.7% agarose gel in 0.5x TAE DNA purification by Gel Extraction Kit Note: Alkaline phosphatase 의처리는제한효소 buffer 를그대로사용해도무방하나, 반드시 DNA 의몰수를계산하여정해진 unit 을정해진사용방법에따라사용해야합니다. 예시3) PCR 산물을이용해제한효소절단후 cloning하는방법 Primer의디자인 : 증폭하여 cloning하고자하는 DNA의제한효소인식자리를인터넷상의제한효소분석사이트로부터확인한후 (www.encyclon.net/seqsenser/restriction) DNA의내부에인식부위가없는제한효소를결정합니다. Cloning에사용하고자하는효소의최소염기수를특성표에서확인합니다. 즉, BamH I을사용하고자하는경우에, 5 -RRR-GGATCC-.-3 추가염기 3 개 BamH I 증폭특이서열 추가염기의염기서열은임의로결정할수있으며전체 primer 의 Tm 값을맞춰결정하는것이좋습니다. 90% 이상의절단효율을위해필요한추가염기수는제한효소에따라다르므로반드시제한효소의추가염기특성표를확인해야합니다. PCR증폭 : Cloning에사용할 PCR 산물은가능한돌연변이율이낮은, 즉 fidelity가높은 Taq 효소를사용하는것이바람직합니다. 그러나아무리 fidelity가높은 Pfu를사용하더라도전혀돌연변이발생이없다는의미는아니므로최대한돌연변이를방지하기위해조건을최적화해야합니다. PCR산물의정제 : 제한효소를처리하기위해서는사전에반드시 PCR purification kit를이용해증폭 DNA를고순도로정제해야합니다. 정제도가낮을경우, DNA에포함된 salt와각종물질들이제한효소의활성을저해할수있습니다. 또한 Taq polymerase는 DNA와의친화도가높기때문에 DNA에결합되어있는 Taq polymerase가제한효소의인식부위를가려절단을방해할수도있으므로반드시정제과정을거친후제한효소절단에사용해야합니다. 제한효소처리 : BamH I과 Xho I을사용한경우 0.1-1 µg PCR products in 16 µl DW 2 µl 10x BamH I buffer 0.2 µl 100x BSA 0.1-0.5 µl BamH I (10 unit/µl) 0.1-0.5 µl Xho I (10 unit/µl) Adjust to final 20 µl with DW, incubate for 1-2hr at 37 Gel electrophoresis on a 0.7% agarose gel in 0.5x TAE DNA purification by Gel Extraction Kit
자주하는질문 1) 제조사가다르더라도 Buffer를공유해사용할수있나요? 저희엘피스바이오텍을포함한많은제조사들은최적의활성조건을제공하기위해자사에서제공하는 buffer의사용을권장하고있습니다만효소가같다면, 타사의 buffer를사용해도무방합니다. 단 buffer의조성이정확히같은것인지, 혹은효소가정확히같은것인지를사전에확인해야합니다 ( 가령어떤회사는인식자리와절단자리는동일하지만효소의이름이나기원이다른것을판매하기도합니다 ). 제한효소에사용되는기본 buffer는 4종입니다. 이는대부분의제조사가동일하며 buffer의명칭이다르고순서는다르지만 (A B C D, 1 2 3 4, I II III IV 등 ) 구성성분을확인하면크게다르지않습니다. 추가로 BamH I, EcoR I, Sal I 등의몇몇효소는기본 buffer가아닌특이 buffer를제공하고있으며, 이는기본 buffer에서포함된염류농도가아닌보다정확한염류의농도를요구하는경우에한하고있습니다. 2) 제한효소의품질을결정하는요인은무엇인가요? 모든단백질효소들이마찬가지이지만제한효소의품질을결정하는요인중가장중요한것은효소의정제도와활성도입니다. 현재세계적으로판매되고있는많은효소제품들은대장균을발현숙주로이용해재조합으로발현하고정제한효소들입니다. 제한효소의품질을결정할때정제도가중요한이유는정제과정중오염될수있는 exo, endonuclease의존재입니다. 많은회사들은 RR1이나 HB101 균주와같이 endonuclease A (enda) 유전자를가지는균주를발현숙주로사용하고있으며, 정제과정에서 endonuclease가오염되게되면제한절단하고자하는 DNA를서서히깨버릴수있습니다. 이는아주미세한차이로 cloning의효율을방해할수있으며, 필자역시이와같은상황을수차례경험한바있습니다. 그러나, 저희엘피스바이오텍은 enda 음성균주를재조합발현에사용하고있으며, 또한음이온교환방법보다는친화성결합방법을이용해순도 99% 로제한효소를정제하고있습니다. 따라서 exo, endonuclease의오염을원천적으로막아놓고있는것입니다. 또한순수정제된단백질을이용하므로 specific activity (unit/mg) 가타사의제품에비해월등히뛰어납니다. 결론적으로제한효소는잘자르기만하면되는것이아니라잘붙일수있도록절단된부위에손상을주지말아야합니다. 3) 제한효소의 unit은어떻게결정하는것인가요? 제한효소는 1µg의 DNA를정해진조건에서 1시간동안자르는양으로 1 unit을결정합니다. 보통은 lambda DNA를기질로이용하고있습니다. 참쉽죠 ~ 잉. 제한효소의활성 unit이정확한것인지또는실활되지않았는지를확인하는방법으로누구나쉽게할수있는방법입니다. 즉제조사에서시행하는 QC를재연해보면제한효소를이용한 cloning 과정에서문제점이나타날경우, 그문제점을쉽게찾을수있는방법이됩니다. 4) 제한효소의 QC는어떤방법으로이루어지나요? 제한효소는정제도를확인하기위해정제후 SDS-PAGE분석을합니다. 정제된효소의 unit을결정하는데, 50, 10, 5, 2, 1, 0.5, 0.2 unit에서절단되는정도를수치화하여정확한 unit을결정하고 50 unit에서 over-digestion하여 star activity는없는지, endonuclease의오염은없는지를확인해줍니다. 또한 over-digestion한 DNA를 T4 DNA ligase를이용해 ligation이정상적으로이루어지는지를확인하는데, 이과정에서 exonuclease의오염여부를재차확인합니다. Ligation한 DNA는다시절단하여정상적으로절단되는지를재확인합니다. 마지막으로흔히사용하는 cloning vector를이용해절단한 DNA, 절단후 ligation한 DNA를대장균에형질전환시켜실제형질전환효율을확인합니다. 1. Purity by SDS-PAGE 1. ApaI 2. BglI 3. EcoRV 4. KpnI 5. MboI 6. PvuII 7. ScaI 8. TthHB8I 9. XbaI Analyzed purified enzymes on a 7.5% Gradi-Gel II 2. Contamination of exo and endonuclease HinfI HaeIII HincII HpaII EagI 1h 24h 1h 24h 1h 24h 1h 24h 1h 24h 3. Over-digestion and ligation/re-cut EcoRV HindIII HinfI HpaII 1. Cut 2. Ligation 3. Re-cut 5) 제한효소의보관, 및유효사용기간제한효소는 20 에보관해야합니다. 전용보관용기를사용하는것이가장좋으며, 전용보관용기가없는경우엔냉동고에서꺼낸제한효소는즉시얼음위에두어야합니다. 제한효소는 20 에보관하는경우에 1년이상안정하지만상온에방치하는경우라면활성이급격히저하될수있기때문입니다. 장기간보관하는경우에는 70 의초저온냉동고에보관하는것이바람직하지만, 잦은해동과냉동으로인한얼음결정의생성은효소의활성에치명적일수있으므로일회개봉후에는반드시 20 에보관하는것이좋습니다. 모든단백질효소류가그렇듯이보관만잘하면현저한활성저하없이 10년은무난히사용할수있습니다. Buffer와 BSA는 20 에보관하는것을권장하지만, 4 냉장고에보관하여도활성저하는나타나지않습니다.
저희엘피스바이오텍의제품유효사용기간은 2년으로하고있습니다. 6) Star activity가뭔가요? 제한효소들중에는 fidelity가낮은것들이있습니다 (Ase I, BamH I, EcoR I, EcoR V, Hind III, Hinf I, Pst I, Pvu II, Sal I, Sca I 등 ) 제한효소에서 fidelity란, 정해진염기서열을얼마나정확히인식하느냐의척도로서제한효소고유의특성입니다. Fidelity가낮다는것은정해진서열외에유사한서열에서 DNA를절단할수있다라는의미입니다. 하지만사용방법만정확하다면 Star activity는발생하지않습니다. Star activity를유발하는요인으로는, DNA의양에비해과도한효소첨가, 낮은 salt 농도, 5% 이상의 glycerol 농도, 높은 ph, 비권장온도등다양합니다. 하지만정해진활성 unit을사용하고, 정제도가높은 DNA의사용만으로도 star activity는평생구경하지못할수도있습니다. 그리고구경하지말아야할것이 Star activity입니다. 7) Isoschizomer와 compatible end는무엇이며차이가어떤것인가요? 기원이다르고이름은다르지만같은제한서열을갖는효소를 isoschizomer라고합니다. Hinc II와 Hind II는유전자상에서도같은효소이지만, 기원이다른경우이고, Mbo I과 Dpn II, Sau3A I은유전자도다르고기원도다르지만같은인식자리와같은제한자리를갖은대표적인 isoschizomer들입니다. Compatible end를갖는다는의미는완전히다른제한효소이지만, 절단후절단부위가 100% 일치하여 ligation 될수있는경우입니다. 예를들어설명하면, BamH I, Bgl II, Mbo I은각각 GGATCC, AGATCT, GATC의제한자리를인식하지만, 절단부위는모두 GATC이므로이세종류의enzyme으로처리하여절단한 DNA는모두 ligation이가능합니다. Sal I과 Xho I은또다른대표적인 compatible end를만드는효소들입니다. Compatible end를만드는제한효소에대해좀더주의를기울이면특정제한자리를없애거나또는 multimer ligation에이용할수있는등활용성을높일수있습니다. 8) 메틸화 DNA는무엇인가요? 그리고효소반응에서왜중요한가요? 주의해야하는메틸화반응은크게세가지입니다. CpG methylation, Dam methylation, Dcm methylation. 메틸화된 DNA는제한효소에의해절단되지않을수도있으므로사용하고자하는제한효소가메틸화에의해영향을받는것인지실험전에반드시확인을해야합니다. 가령 Mbo I은 GATC를제한하는효소로서 A 염기에메틸화가된 DNA는자르지못하며 GATC서열은일반적인대장균에서모두메틸화가됩니다 (Dam methylation). 따라서 Dam 유전자돌연변이형이아닌일반균주에서정제한 DNA는 Mbo I으로는잘리지않습니다. 또한고등동식물의일반적인메틸화인 CpG methylation은 DNA의 CG 서열에서 C염기에메틸기를붙이는것으로서이와같이 C염기에메틸화가되면다수의효소들이작동을하지못하므로미리그활성여부를확인해야합니다. 내 sample DNA에메틸화되어있는지? 그리고어떤염기에메틸화되어있는지? 사용하고자하는제한효소가해당메틸화에영향을받는지? 9) 두개의제한효소를동시에사용하고자할때고려해야하는내용은무엇인가요? 두개의효소를처리해야하는경우, 가장이상적인경우는한번에그리고동시에처리하는것이지만여러가지이유로그럴수없을때도있습니다. 1. Buffer의차이 2. 반응온도의차이 3. 인식자리의근접성 4. 절단에필요한최소말단염기수두효소가같은 buffer를사용하는경우인지아니면, 동시에처리할수있는 buffer가있는지를먼저확인해봐야합니다 (Double Digestion Guide Table 참조 ). 같은 buffer를사용하더라도반응온도에있어서현저한차이를보인다면함께반응하기가어려우며, 이경우에는한가지효소를먼저넣고반응이끝난후다음효소를넣은방법을사용하면됩니다. 하지만모든것을만족하더라도인식자리가너무가까워절단이불가능한경우나또는한가지씩자르더라도절단에필요한최소염기수가적은경우에는동시절단이불가능할수도있습니다. 다음과같은경우는근접성과최소염기수를고려했을때같은효소를사용하더라도순서에따라서절단이될수있는경우와없는경우를보여주고있습니다. 5 -..GGATCC CATATG -3 BamH I Nde I - BamH I 과 Nde I 을동시처리 동시절단불가 - BamH I 을먼저처리하고 Nde I 을처리 절단효율이극히낮음 - Nde I 을먼저처리하고 BamH I 을처리 정상적으로절단 그이유를설명하면 BamH I은절단에필요한최소말단염기가 2개인데반해 Nde I은최소 7개이기때문입니다. 따라서 Buffer의호환성, 인식자리의근접성과말단염기수그리고반응온도를모두고려해야합니다. 10) Supercoiled Plasmid DNA와 linear DNA를기질로하는경우에있어서반응의차이점이있나요? Supercoiled DNA는 linear DNA에비해접근성이용이하지않으므로더많은 unit의제한효소를사용해야합니다. 예를들면 Sca I의경우에절단효율은 linear DNA에비해 plasmid DNA의효율이 5-10% 정도입니다. 따라서이러한경우에는더많은제한효소를반응에사용해야합니다. 11) 제한효소처리후불활성화가반드시필요한가요? 제한효소처리의일반적인목적은 ligation에사용할 DNA 절편을준비하는것이전부라해도과언이아닙니다. 이런경우, 제한효소를처리한 DNA는보통 phenol 추출이나 DNA extraction kit를이용해정제를하므로정제전불활성화는별의미가없습니다. 이는효소가 phenol이나또는 DNA extraction buffer에있는 chaotropic agent에의해 denature됨으로써제거되기때문입니다. 하지만제한효소처리후직접다른반응 (ligation이나또는순차적인
이종효소처리 ) 을할목적이라면가장보편적인불활성화가열에의한것입니다. 많은제한효소들이 65 에서 20-30분정도열처리하는것만으로도활성이없어지지만, 80 이상에서생존하는효소도있기때문에열처리를하기전적절한처리시간과온도를반드시확인하는것이좋습니다. 12) 제한효소처리후 DNA절편의예측크기와다르게나오는이유는무엇인가요? 제한효소처리후정제과정없이직접전기영동을해보면예측한크기보다크게나오는경우를본적이있을겁니다. 이와같은현상은제한효소의 buffer에존재하는 salt의양적차이에의해서나타나는것으로 salt의농도가높을수록 DNA의이동은방해를받기때문에크기가다르게보이는정도가커집니다. 보통은그러려니하지만제한효소를사용해본경험이없고꼼꼼한성격이라면, 절단부위에대한정보가잘못되었다고판단할수있으나이는지극히정상적인것으로서, 제한효소처리한 DNA를정제하여 salt를없앤후전기영동을해보면정확한제크기로이동하는것을볼수있습니다. 또한제한효소에따라 salt의요구농도가다르므로 ( 사용하는 buffer가다르므로 ), 모든제한효소에서이러한현상이나타나는것은아닙니다. 13) 제한효소만처리하면 DNA가모두깨집니다. 왜그럴까요? 제한효소를처리하다보면간혹 smear되어나오는결과를얻는경우도있습니다. 이런경우는두가지를생각해봐야합니다. 1. DNA를추출한균주가 endonuclease를가지고있는것인지? Cloning에사용되는일반적인대장균들은 (DH5a, XL1-blue 등 ) enda를없앤돌연변이균주들입니다. 이는정제한 DNA에혹, endonuclease가조금이라도오염되게되면 DNA가자동적으로깨져나가는현상이나타나기때문입니다. 하지만야생균주를사용한경우나또는 BL21 균주를사용한경우에는 enda가활성화되어있기때문에아무리 plasmid DNA를깨끗이정제했다할지라도 pg수준이하로오염될수있는 endonuclease가 DNA를순식간에깨버릴수있습니다. 이경우에는정제과정에서 endonuclease의오염을없애는전용 DNA 정제키트를사용하는것이좋습니다. 2. 제한효소의 star activity : 과량의효소를사용하거나 buffer를잘못사용하는경우, 그리고 DNA가깨끗하지못한경우에서 star activity를보이는일부의효소들은과반응에의해 DNA를무작위로절단할수있습니다. 제조사의권장방법에따라최적의조건으로제한효소처리를하는방법밖에는도리가없습니다. 3. 흔한경우는아니지만시약이나 buffer가오염되어있는경우에도이러한현상은나타날수있습니다. 특히 gel loading buffer나전기영동 buffer가심하게오염된경우에발생할수있는현상으로서전기영동 buffer는이물질이발생한경우즉시교체해주는것이좋습니다. 14) 제한효소처리후확인해보면잘잘린것같은데, transform을해보면 self가많이뜹니다. 왜그런가요? 어떤반응이던 100% 는없습니다. 99.999% 의효율을가지고있는경우, 육안으로는모두잘린듯하지만남아있는 0.001% 의절단되지않은 DNA는대장균을transform을시키기에충분한양일수있습니다. 따라서단일효소를사용한경우라도절단된 DNA와 circular DNA의크기가차이나는점을이용해전기영동후 gel정제를통해 DNA를준비하는것이좋습니다. 또는자주사용하는 vector의경우, 제한효소자리의중간부분에임의의 DNA조각을넣어놓고 (stuffer), 제한효소를처리해 stuffer가제거된정확한크기의 vector DNA만을정제해사용하는것도한방법입니다. vector부위 EcoRI Stuffer DNA EcoRI vector부위 15) 제한효소처리는잘되었지만 transform을해보면 colony가없습니다. 왜그럴까요? 제한효소자체에또는 DNA 샘플에 exonuclease가오염된경우에, 제한절단에의해생성된 sticky end가잘려나가 T4 DNA ligase에의해접합이않될수도있습니다. 저역시이러한경우로인해고생을한적이몇번있습니다. DNA 샘플이오염된경우라면, 다시준비하면되겠지만, 제한효소가오염된경우라면사실문제확인이아주어렵습니다. 이런점때문에저희회사는모든효소들에대해, cut, ligation, re-cut의 QC는물론transformation 실험을하고있습니다. 하지만, transformation은 DNA의상태, 절단효율, DNA의양, T4 DNA ligase의활성그리고적절한사용방법, 마지막으로 Competent cell의 transformation효율등아주다양한요인들에의해영향을받을수있는것이므로이모든상황에대해실험자스스로 QC매뉴얼을가지고있는것이좋습니다. 16) 제한효소처리후잘잘린것은알겠는데, 잘붙는것은어떻게확인을하나요? 제한효소처리한 DNA를 T4 DNA ligase로처리하고전기영동을해보면됩니다. 단일절단이건이중절단이건 DNA간의접합이이루어지므로단일 band 가아니며원래 DNA 크기보다크고또한크기가다른여러개의 band를관찰할수있어야합니다. Ligation이덜되었거나또는 ligation이않되었다면, 원래크기의단일 band가많거나또는전부이어야합니다. 아래사진은 pbluescript vector를해당하는제한효소로자른후 T4 DNA ligase로접합하고다시제한효소로자른결과를보여주고있습니다. 보시는바와같이 DNA가접합되어큰 size의 multi band로나타나고있는데, 이는제한효소의 QC 뿐만아니라 T4 DNA ligase의활성 QC방법으로도유용하게사용할수있습니다. Kpn I Mwo I EcoR V M Cut ligation re-cut M Cut ligation re-cut M Cut ligation re-cut 17) 제한효소처리후보관은어떻게합니까? 제한효소처리후, 즉시실험을수행하지못하는경우에는, 4 에보관하여도무방합니다. 장기보관을해야하는경우에는 20 에보관하여야합니다.
18) 제한효소처리는어디에서하는것이좋은가요? 제한효소처리는항온기, 항수조, 히팅블록, PCR기계등사용자의취향에따라다르게사용하고있습니다. 항수조는온도전달이빨라효소반응에많이사용하고있으나, 튜브내용액의증발현상이발생할수있어자주확인해주고원심분리를해주지않으면용액내구성물의농도변화가발생하게되어예측하지못한현상이발생할수도있습니다. 장시간처리해야하는경우에는내외부의온도가같은항온기를사용하는것이바람직하며, PCR기계를이용하는것도한방법입니다. 19) 제한효소위치찾는프로그램? 제가주로사용하는프로그램은, http://www.encyclon.net/seqsenser/restriction 회원가입후사용하시면됩니다. Methylation Sensitivity Blocked by CpG methylation Aat II, Age I, Ava I, Cla I, Eag I, Fsp I, Hae II, Hha I, Hpa II, Kas I, Mlu I, Nae I, Nar I, Not I, Nru I, Pvu I, Sac II, Sma I, SnaB I, Xho I Blocked by overlapping CpG methylation Acc I, Apa I, ApaL I, Ava II, Ban I, Bgl I, Dpn II, Dra III, EcoR I, EcoR V, Hinc II, Hinf I, Hpa I, Mbo I, Mwo I, Nhe I, Sfi I Blocked by dam methylation Bcl I, Dpn II, Mbo I Blocked by overlapping dam methylation Cla I, Hph I, Nru I, Xba I Blocked by overlapping dcm methylation Apa I, Ava II, Ban I, Sfi I Double Digestion Buffer Guide Enzym e Aat II BamH I Bgl II Eag I EcoR I EcoR V Hind III Kpn I Nco I Nde I Nhe I Not I Pst I Pvu I Sac I Sac II Sal I Sma I Spe I Sph I Xba I Xho I Buffer 4 BamH I 3 3 EcoR I 3 2 1 4 4 2 3 3 3 1 4 3 4 4 2 4 4 Aat II 4 -- seq seq seq seq 4 4 4 4 4 4 seq 4 seq 4 4 seq 4 4 4 4 4 BamH I BamH I seq -- 3 3 EcoR I 3 seq seq 3 3 seq 3 3 3 seq seq 3 seq seq 3 3 3 Bgl II 3 seq 3 -- 3 EcoR I 3 2 2 3 3 2 3 3 3 2 seq 3 seq 2 2 2 3 Eag I 3 seq 3 3 -- EcoR I 3 seq seq 3 3 seq 3 3 3 seq seq 3 seq seq 3 3 3 EcoR I EcoR I seq EcoR I EcoR I EcoR I -- EcoR I seq 1 EcoR I EcoR I 1 EcoR I EcoR I EcoR I 1 EcoR I EcoR I seq EcoR I EcoR I seq EcoR I EcoR V 3 4 3 3 3 EcoR I -- 2 2 3 2 2 3 3 3 2 2 3 4 2 2 2 3 Hind III 2 4 seq 2 seq seq 2 -- 2 2 2 2 2 2 2 2 2 seq 4 2 2 2 2 Kpn I 1 4 seq 2 seq 1 2 2 -- 1 1 1 2 1 2 1 4 seq seq 1 1 2 1 Nco I 4 4 3 3 3 EcoR I 3 2 1 -- 4 2 3 3 3 1 4 3 4 4 2 4 4 Nde I 4 4 3 3 3 EcoR I 2 2 1 4 -- 4 3 3 3 4 4 3 4 4 2 4 4 Nhe I 2 4 seq 2 seq 1 2 2 1 2 4 -- 2 2 2 1 4 seq 4 2 2 2 2 Not I 3 seq 3 3 3 EcoR I 3 2 2 3 3 2 -- 3 3 2 2 3 seq 2 2 3 3 Pst I 3 4 3 3 3 EcoR I 3 2 1 3 3 2 3 -- 3 1 2 3 4 2 2 3 3 Pvu I 3 seq 3 3 3 EcoR I 3 2 2 3 3 2 3 3 -- 2 2 3 seq 2 2 3 3 Sac I 1 4 seq 2 seq 1 2 2 1 1 4 1 2 1 2 -- 4 seq 4 1 1 4 1 Sac II 4 4 seq seq seq EcoR I 2 2 4 4 4 4 2 2 2 4 -- seq 4 4 4 4 4 Sal I 3 seq 3 3 3 EcoR I 3 seq seq 3 3 seq 3 3 3 seq seq -- seq seq 3 3 3 Sma I 4 4 seq seq seq seq 4 4 seq 4 4 4 seq 4 seq 4 4 seq -- 4 4 4 4 Spe I 4 4 seq 2 seq EcoR I 2 2 1 4 4 2 2 2 2 1 4 seq 4 -- 2 4 4 Sph I 2 4 3 2 3 EcoR I 2 2 1 2 2 2 2 2 2 1 4 3 4 2 -- 2 2 Xba I 4 4 3 2 3 seq 2 2 2 4 4 2 3 3 3 4 4 3 4 4 2 -- 4 Xho I 4 4 3 3 3 EcoR I 3 2 1 4 4 2 3 3 3 1 4 3 4 4 2 4 -- Xma I 4 4 seq seq seq seq 4 seq 4 4 4 4 2 4 seq 4 4 seq 4 4 4 4 4
효소반응시문제점과해결방안 문제원인해결방안 DNA 가잘리지않거나부분적으로잘리는경우 제한효소활성이낮을때 DNA 절단 band 수가예상보다많을때 제한효소처리후에 DNA 가 Smearing 되거나관찰되지않을때 절단 DNA 의 ligation 효율이낮을때 DNA 가깨끗하지않은경우 DNA 농도가너무높거나낮은경우 DNA 의메틸화 (dam, dcm, CpG methylation) Supercoil form DNA 인경우 비특이적반응 (star activity) 이나타난경우 다른종류의 DNA 가오염된경우 다른종류의제한효소가존재한경우 제한효소의유사한염기서열 (cognate sequence) 에대한비특이적반응은부적절한반응조건때문에나타나므로적절한반응조건을지키며깨끗한 DNA를이용해야합니다. 비특이적인반응의원인 : 과량의효소 (>100 units/ μg ), 5% 이상의글리세롤농도, 망간을비롯한 2가이온 ( 마그네슘대신 ), 적정농도범위를벗어난 NaCl 농도, 극단적인 ph (>ph 8.0), DMSO와에탄올을비롯한유기용매의오염등기질 DNA 분리시오염에의한다른종류의 DNA가포함되어있을가능성이있으므로 DNA를새롭게준비하여이용해야합니다. 아가로즈전기영동시에로딩완충액또는전기영동완충액에다른 DNA 오염가능성도있으므로새로운것을이용하는것이좋습니다. 기준이되는 Lambda DNA나절단부위의수가확실한기질을이용하여 DNA band pattern을확인하여추가 band가확인되면다른제한효소가오염되었을가능성도있으므로새로운 batch의제한효소를사용해야합니다. DNA 염기서열정보가잘못된경우 DNA 의염기서열정보를자세히살펴서정확한제한효소부위와개수를확인해야합니다. 기질 DNA 가부적당한경우 비특이적핵산분해효소 (nuclease) 의오염의경우 분광광도계나아가로즈젤전기영동을이용하여 DNA의정확한농도를확인하고 RNA나 Guanidine과같은염이오염되어있는가를확인해야합니다. 염이많은경우 230nm에서높은흡광도를보이는점을이용하여확인할수있습니다. RNA는 RNase를처리하여제거하고, 에탄올침전방법으로 RNA와염을제거한후사용해야합니다. EndA(+) 대장균주에서 DNA를분리한경우 endonuclease가오염되어 DNA를완전히분해하게되므로 enda(-) 대장균주를사용하고, 부득이한경우 endonuclease를제거할수있는 DNA정제 kit를이용하는것이좋습니다. 반응성분들에박테리아, 곰팡이등이오염되어있는지여부를확인하고성분자체의 nuclease 오염여부를확인하여새로운시약으로교체해야합니다. BSA가든 buffer의경우에는박테리아나곰팡이가증식할수있으므로저온보관을해야합니다. ligation buffer 조성의문제 ligation buffer 내의 ATP, DTT 는쉽게깨어지는성분이므로새로운 buffer 를사용해야합니다. ligation 반응에서제한효소의활성이남아있는경우 ligase 농도가너무낮은경우 DNA를분광광도계와아가로즈젤전기영동을이용하여정확한농도와순도를확인해야합니다. 순도가낮으면제한효소가제대로작용하지못하게됩니다. 따라서 Phenol/Chloroform 추출방법으로단백질을제거하고, 에탄올침전을통해불순물을제거하거나또는 DNA 분리 kit 등을이용하여정제도를높인후제한효소를처리해야합니다. DNA 농도가지나치게높으면점도가높아져효소반응이저해를받게되므로희석하여반응하고너무낮은경우는반응효소의 Km 값이낮아지기때문에부분절단현상이나타나게되므로 DNA를더첨가하여반응해야합니다. 이용하는제한효소가 DNA 메틸화에영향을받는지를확인하여메틸화에영향을받는다면메틸화에영향을받지않는 isoschizomer 를이용하거나, 기질 DNA 를메틸라제 (methylase) 유전자가없는대장균주 ( 예 JM110; dam- dcm- ) 를이용하여분리하여이용해야합니다. Dpn I 과같은일부제한효소는염기 (N6-methylated adenine) 에메틸화되어있을때작용하므로 methylase 유전자가있는대장균주로부터기질 DNA 를분리하여이용해야합니다. 기질 DNA 가 Supercoil form 인경우에 linear form 에비해구조적인문제로절단이잘안되는경우가있으므로더많은제한효소를필요로합니다. 일반적으로제한효소 unit 은 linear DNA (lambda) 를기준으로하기때문에 supercoil DNA 의절단을위해서필요한효소량을확인하여절단하며. supercoling 에저해를받지않는제한효소를먼저처리한후, 다른제한효소를처리하거나, topoisomerase 등을처리하여 DNA 를풀어진상태로변환시켜처리하는방법도있습니다. 또한제한효소 unit 을정하는기준 DNA 보다절단부위의개수가현저하게많을경우는제한효소의양을증가시켜반응해야합니다. DNA 염기서열정보가잘못된경우 DNA 의염기서열에서제한효소부위와개수를확인해야합니다. 제한효소가불활성되거나약화된경우 제한효소반응억제제 (inhibitors) 가있는경우 제한효소가반응액내에서완전히섞이지않은경우 제한효소희석으로효소활성이낮아지거나없어진경우 효소의보관이부적절한경우 효소를희석하여사용보관한경우 Pipetting error 글리세롤에의한효소활성방해의경우 제한효소의활성도를나타내는 unit 은 linear DNA 1 μg을 1 시간에모두절단할수있는제한효소의양을의미하므로 Lambda DNA 나기질 DNA 를이용하여효소의활성을검사하여활성상태를확인해야합니다. 많은제한효소는열에약해불활성화되거나공기에노출되어단백질산화가되어변성될수있으므로제한효소는장시간외부노출을하지말고희석하는경우나또는반응액에첨가시에도부드럽게섞어주어야합니다. 제한효소의실활이확인되면새로운 batch 를사용해야합니다. Phenol, Chloroform, Ethanol, EDTA, SDS, CsCl 이오염되어있거나고농도의염상태인경우제한효소의활성이억제될수있습니다. DNA 분리시이용되는 Phenol/Chloroform 처리후에탄올침전방법시시약이딸려오지않도록완전히제거하도록하며, 상업적으로구입이가능한 DNA 분리 kit 등을사용하는방법도있습니다. 제한효소를마지막에첨가하고부드럽게혼합하여완전히섞이도록합니다 (vortex 는사용금지 ) 제한효소는가능하면희석하지않고사용하는것이좋으나희석이필요한경우 storage buffer나희석액 (diluent) 에희석하여사용해야합니다. 바로사용하는경우라면, 1x reaction buffer에희석할수있으나장시간보관은피해야합니다. 제한효소는성에제거기능이없는 -20 C 냉동고에서보관하는것이최적이며전용용기또는 cooler를이용하는것이좋습니다. 제한효소를물에직접희석하는것은좋지않으며적절한희석액에희석을해야하고, 희석후쉽게실활되는경우가많기때문에가능한빨리사용해야하며이를냉동보관하는것은좋지않습니다. 점도가높은용액 DNA 나제한효소를소량취할때에실제보다더욱소량을취하는경우가있을수있으므로 pipetting 에주의해야하며, 경우에따라서는 DNA 나효소를희석하여사용해야합니다. 제한효소가전체반응액의 10% 를넘게되면 ( 즉, 글리세롤농도가 5% 를넘게되면 ) 효소활성이방해를받게되므로반응액의양을조절하거나제한효소양을줄여야합니다. 반응온도를잘못한경우제한효소의반응온도를확인하여적절한온도에서효소반응을실시해야합니다. 반응조건이맞지않은경우제품설명서를확인해야합니다. 제한효소의불활성화 (heat inactivation, phenol extraction 방법등 ) 를확실히한후사용해야하며, 제한효소, ligase, DNA 중에비특이적핵산분해효소의오염가능성이있는것이있는지확인해봐야합니다. blunt end ligation 반응은 sticky end에비해더높은농도의 ligase를필요로하며, 특정제한효소중에서도 ligation이잘안되는경우 ( 예 ; Mbo II) 가있으므로 ligase 농도를더높이거나 10% 농도가되도록 PEG를추가로넣고반응해야합니다.
CUT-PROOF Restriction Enzymes G A C G T C Aat II C T G C A G EBR-1001 250 unit 80,000 A G G T C T A C C A T C T G G A Acc I EBR-1003 250 unit 80,000 T C C G G A Acc III A G G C C T EBR-1005 250 unit 80,000 A C C G G T Age I T G G C C A EBR-1007 250 unit 80,000 G G G C C C Apa I C C C G G G EBR-1013 2,500 unit 60,000 Pu A A T T Py Apo I Py T T A A Pu EBR-1203 500 unit 80,000 C Py C G Pu G Ava I G Pu G C Py C EBR-1019 2,500 unit 80,000 A T G C A T Ava III T A C G T A EBR-1023 1,000 unit 80,000 G G Py Pu C C Ban I C C Pu Py G G EBR-1027 2,500 unit 70,000 T G A T C A Bcl I A C T A G T EBR-1033 1,000 unit 60,000 A G A T C T Bgl II T C T A G A EBR-1037 2,500 unit 60,000 CH 3 G A T C C T A G Dpn I EBR-1045 500 unit 70,000 CH 3 T T T A A A Dra I A A A T T T EBR-1049 1,000 unit 70,000 C G G C C G Eag I G C C G G C EBR-1053 500 unit 70,000 G A T A T C EcoR V C T A T A G EBR-1057 5,000 unit 70,000 Pu G C G C Py Hae II Py C G C G Pu EBR-1063 1,000 unit 70,000 (N) Hae IV 7 GAPyNNNNNPuTC (N) 14 (N) 13 CTPuNNNNNPyAG (N) 9 EBR-1067 500 unit 80,000 A A G C T T Hind III T T C G A A EBR-1073 10,000 unit 60,000 G T T A A C Hpa I C A A T T G EBR-1077 500 unit 70,000 Kas I EBR-1205 500 unit 70,000 G G C G C C C C G C G G G A T C Mbo I C T A G EBR-1085 500 unit 80,000 C T T A A G Afl II G A A T T C EBR-1201 2,500 unit 80,000 A G C T Alu I T C G A EBR-1011 500 unit 80,000 G T G C A C ApaL I C A C G T G EBR-1015 1,000 unit 70,000 A T T A A T Ase I T A A T T A EBR-1017 2,500 unit 80,000 A G G T C C C C T G G A Ava II EBR-1021 1,000 unit 80,000 G G A T C C BamH I C C T A G G EBR-1025 10,000 unit 50,000 G C A G C (N) Bbv I 8 C G T C G (N) 12 EBR-1031 200 unit 70,000 GCCN NNN NGGC Bgl I CGGN NNN NCCG EBR-1035 1,000 unit 60,000 C T N A G Dde I G A N T C EBR-1043 250 unit 70,000 G A T C Dpn II C T A G EBR-1047 1,000 unit 70,000 CAC NNN GTG Dra III GTG NNN CAC EBR-1051 2,500 unit 70,000 G A A T T C EcoR I C T T A A G EBR-1055 10,000 unit 50,000 GGATG (N) Fok I 9 CCTAC (N) 13 EBR-1059 1,000 unit 80,000 G G C C Hae III C C G G EBR-1065 2,500 unit 70,000 G T Py Pu A C Hinc II C A Pu Py T G EBR-1071 1,000 unit 70,000 G A N T C Hinf I C T N A G EBR-1075 2,500 unit 70,000 C C G G Hpa II G G C C EBR-1079 1,000 unit 70,000 G G T A C C Kpn I C C A T G G EBR-1083 5,000 unit 70,000 GAAGA (N) Mbo II 8 CTTCT (N) 7 EBR-1087 250 unit 80,000
A C G C G T Mlu I T G C G C A EBR-1089 1,000 unit 80,000 G C NNNNN NN GC Mwo I C G NN NNNNN CG EBR-1091 250 unit 80,000 C C A T G G G C C G G C Nae I C G G C C G EBR-1093 500 unit 80,000 Nco I G G T A C C EBR-1097 1,000 unit 60,000 C A T A T G Nde I G T A T A C EBR-1099 5,000 unit 70,000 G C G G C C G C Not I C G C C G G C G EBR-1103 500 unit 70,000 C T G C A G Pst I G A C G T C EBR-1109 10,000 unit 60,000 C A G C T G Pvu II G T C G A C EBR-1113 2,500 unit 70,000 C C G C G G Sac II G G C G C C EBR-1117 1,000 unit 70,000 A G T A C T Sca I T C A T G A EBR-1123 1,000 unit 70,000 C C C G G G Sma I G G G C C C EBR-1127 2,500 unit 70,000 A C T A G T Spe I T G A T C A EBR-1131 500 unit 70,000 A A T A T T Ssp I T T A T A A EBR-1135 500 unit 70,000 T C T A G A Xba I A G A T C T EBR-1147 5,000 unit 70,000 Pu G A T C Py Xho II Py C T A G Pu EBR-1151 500 unit 80,000 G C T A G C Nhe I C G A T C G EBR-1101 1,000 unit 70,000 G G C C Pho I C C G G EBR-1107 500 unit 80,000 C G A T C G Pvu I G C T A G C EBR-1111 500 unit 80,000 G A G C T C Sac I C T C G A G EBR-1115 2,500 unit 70,000 G T C G A C Sal I C A G C T G EBR-1119 2,500 unit 70,000 GGCC NNNN N GGCC Sfi I CCGG N NNNN CCGG EBR-1125 2,500 unit 80,000 T A C G T A SnaB I A T G C A T EBR-1129 500 unit 80,000 G C A T G C Sph I C G T A C G EBR-1133 500 unit 80,000 T C G A TthHB8 I A G C T EBR-1145 2,500 unit 70,000 C T C G A G Xho I G A G C T C EBR-1149 5,000 unit 60,000 C C C G G G Xma I G G G C C C EBR-1153 250 unit 70,000 Buffer Composition (1x) Pu = A or G Py = C or T N = A or C or G or T Buffer 1 : 10mM Bis Tris Propane-HCl, ph7.0, 10mM MgCl 2, 1mM DTT Buffer 2 : 10mM Tris-HCl,pH7.9, 50mM NaCl, 10mM MgCl 2, 1mM DTT Buffer 3 : 50mM Tris-HCl,pH7.9, 100mM NaCl, 10mM MgCl 2, 1mM DTT Buffer 4 : 20mM Tris-acetate, ph7.9, 10mM magnesium acetate, 50mM potassium acetate, 1mM DTT Buffer BamH I : 10mM Tris-HCl,pH7.9, 150mM NaCl, 10mM MgCl 2, 1mM DTT Buffer EcoR I : 100mM Tris-HCl,pH7.5, 50mM NaCl, 10mM MgCl 2, 0.025% Triton X-100 ELPIS-Biotech. Inc. 보다자세한자료를원하시면 을방문하시거나이메일 sales@elpisbio.com 또는전화 042-581-8448 로문의를주시면성심껏답변을드리겠습니다