임상병리와정도관리 : 제 23 권제 1 호 2001 J. Clin, Pathol. & Quality Control 2001:23:201-207 201 제한효소 HaeIII 를이용한비정형마이코박테리아의동정 장진숙 김대근 최태열 한양대학교의과대학임상병리과 Identification of Non-tuberculosous Mycobacteria by HaeIII Restriction Enzyme Analysis Jean Sook Chang, Dae Geun Kim, and Tae Yeal Choi Department of Clinical Pathology, Hanyang University Hospital, Seoul, Korea Background:Mycobacteria form a heterogenous group in terms of occurrence in clinical or enviromental material, complex phenotypic and genetic data, and disease association. This study was performed to identify mycobacteria to the level of species by multiplex PCR and restriction enzyme analysis(rea). Methods:Eleven reference strains and 160 strains of clincal samples were used in this study. All isolates and reference strains were subcultured in Ogawa medium and identified using standard biochemical test such as niacin accumulation test and nitrate reduction test. The multiplex PCR was performed by using the primers that amplifies 65 kda HSP gene which exist in all mycobacteria and the primers that amplifies MPB64 gene which is specific to Mycobacterium tuberculosis complex. The genus specific amplifed DNA products were digested with the restriction enzymes such as HaeIII, Sau96I, and BstEII. Results:Ten cases of non-tuberculous mycobacteria were detected by multiplex PCR. The ten cases of NTM were identify as five M. intracelluare, three M. avium, two M. fortuitum subsp. peregrinum by REA using HaeIII. Conclusions:The multiplex PCR and REA using HaeIII is the very easy and accurate method for identification of M. tuberculosis and NTM. Key Words:Non-tuberculous mycobacteria, PCR, Restriction enzyme analysis(rea) 서 결핵감염은아직까지전세계에서높은유병율과사망의주요원인이되고있으며, 이중비결핵성마이코박테리아 (non-tuberculous mycobacteria:ntm) 가후천성면역결핍증 (AIDS) 이나, 종양, 이식등으로면역력이저하된환자들에서발병빈도가계속증가하고있다 [1]. Mycobacteria 에는약 70 여종이있으며이중일부는폐결핵, 피부와연조직감염, 림프절감염, 파종성 ( 산재성 ) 감염을일으키 론 교신저자 : 최태열우 )133-711 성동구행당동 17 한양대학병원임상병리과전화 :2290-8974, Fax:2298-1735 고있어정확한동정이요구되고있다 [2, 3]. 결핵균의일반적인동정은결핵균의배양속도, 균집락의성상, 및생화학적인검사등에의해이루어지는데이는시간이많이소요될뿐아니라, 일부균종에서는정확한균동정이어려운경우가있다. 그외에 thin-layer chromatography[4], high-performance liquid chromatography[5], gas liquid chromatography[6] 등의균동정방법이있으나고가의장비를필요로하거나, 고도의숙련도가요구되고있어임상에적용하기가수월치못한실정이다. 최근에는탐식자교잡반응이상품화되어시판되고있으나역시고가이고, 제한된종 (species) 의동정에만사용할수있어진단에제한성을나타내고있다 [7]. 그러나결핵의주요유전자염기서열이밝혀짐에따라 65kDa heat shock protein (HSP) 유전자 [8, 9] 나 dnaj 유전자 [10, 11], 16S rrna
202 장진숙 김대근 최태열 유전자 [12, 13] 및 16S-23S rrna 유전자 [14] 등의일부유전자부위를증폭하여제한효소분석법 (restriction enzyme analysis:rea) 법으로종을동정하려는방법이많이소개되고있으나, 증폭되는부위및사용된효소에따라균동정의범위와정확도에차이가있다. 이에연구자들은 multiplex PCR 을실시하여 M. tuberculosis complex 와 NTM 을구분하였고 NTM 으로증폭된 DNA 산물을 HaeIII, Sau96I 및 BstEII 제한효소로절단하여 NTM 을종 (species) 수준까지동정하였다. 재료및방법 1. 실험균주표준균주는대한결핵연구원에서분양받은 11균주로 M. tuberculosis H37Rv(ATCC 27294), M. bovis(atcc 19210), M. bovis BCG(ATCC 27291), M. africanum (ATCC 25420), M. kansasii(atcc 12478), M. scrofulaceum(atcc 19981), M. szulgai(atcc 35799), M. gordonae(atcc 14470), M. avium(atcc 25291), M. intracellulare(atcc 13950), M. fortuitum(atcc 6841) 등이다. 실험균주는한양대학병원에서배양분리된결핵균 160 균주 ( 객담124, 기관지세척액 12, 흉막강액 11, 그외 13) 를대상으로하였다. 2. 결핵균배양 Ogawa 배지를사용하여결핵균을배양하였으며, 배양된결핵균은 niacine accumulation 검사, 및 nitrate reduction 검사를실시하여 M. tuberculosis 를동정하였다. 3. DNA 추출 Ogawa 배지에서자란균집락을 200µL 의 InstaGene Matrix(Bio-RAD, CA, USA) 액에풀어 56 에 30분방치한후 8분간끓인다음즉시얼음에식혀 12,000 rpm 에서 3분원심분리하여상층액을사용하였다. 4. Multiplex PCR Mycobacteria 에공통적으로존재하는 65 kda HSP gene 에대한시발체 Tb11, Tb12[15, 16] 와 M. tuberculosis complex 에특이적인 MPB 64 protein gene 에대한시발체 MPB 64-1, MPB 64-2[16] 를 BIONEER 사 (Cheong won, Korea) 에의뢰하여제작하였다 (Table 1). PCR 반응조건은 10 mm Tris-HCl(pH 8.3), 40 mm KCl, 1.5 mm MgCl2, dntp 각각 200 µm, 시발체 Tb11, Tb12 각각 0.5 µm과 MPB 64-1, MPB 64-2 각각 0.2 µm씩, 2% DMSO( 혹은 10% glycerol), 0.5 Unit Taq polymerase 에총반응액이 50 µl되게증류수를첨가하였다. PCR 조건은 94 에서 5분간 1 cycle, 9 4 에서 1분, 60 에서 1분, 72 에서 1분의과정을 35 cycles 후, 72 에서 10분간 1 cycle 실시하였다. 증폭산물은 2% agarose gel 에서전기영동후 ethidium bromide 로염색하였다. 5. Restriction enzyme analysis(rea) Multiplex PCR 에서증폭된 441bp 의 DNA 를 HaeIII, Sau96I 및 BstEII(Promega, WI, USA) 로처리하여 DNA 를절단하였다. REA 반응조건은증폭산물 10µL 에 buffer 2.0 µl, enzyme 5 Unit, DW로전체 20 µl를만들어 37 에서 2시간반응시켰다. 제한효소처리후의반응산물은 3% Metaphor agarose(fmc Bioproduct, ME, USA) 에서전기영동한후 ethidium bromide 로염색하여 Image analyzer(bio-rad Image analysis system, CA, USA) 를이용하여각제한효소별로표준균주들의 DNA 절편양상을정리하였다. 6. 염기서열분석 (Nucleotide Sequencing) Sanger 등 [17] 의 Dideoxy termination sequencing 방법을응용한 ABI PRISM BigDye Terminator Cycle Sequencing Ready Reaction Kit(Perkin Elmer, USA) 을사용하여수행하였다. 결과 1. Multiplex PCR 표준균주 11종의 multiplex PCR 은 M. tuberculosis, M. bovis, M. africanum 이 441 bp와 240 bp의 DNA 가증폭되었고, M. bovis BCG 와표준균주 7종의 NTM 은 Table 1. Oligonucleotide primers used for multiplex PCR of mycobacterial DNA Primer Sequence (5' 3') Target Gene Tb11 a Tb12 a MPB64-1 b MPB64-2 b ACC AAC GAT GGT GTG TCC AT CTT GTC GAA CCG CAT ACC CT TCC GCT GCC AGT CGG CTT CC GTC CTC GCG AGT CTA GGC CA a amplified a 441 bp fragment of the 65 kda HSP gene sequence. b amplified a 240 bp fragment of the MPB64 protein coding gene sequence. Mycobacteria M. tuberculosis complex
제한효소 HaeⅢ 를이용한비정형마이코박테리아의동정 203 Fig. 1. Multiplex PCR products from reference mycobacterial strains. Lanes:M, 100bp DNA ladder;1, M. tuberculosis H37Rv(ATCC 27294);2, M. bovis(atcc 19210);3, M. bovis BCG(ATCC 27291);4, M. africanum (ATCC 25420);5, M. kansasii(atcc 12478); 6, M. scrofulaceum(atcc 19981);7, M. szulgai(atcc 35799) ;8, M. gordonae(atcc 14470);9, M. avium(atcc 25291);10, M. intracellulare(atcc 13950);11, M. fortuitum(atcc 6841). Fig. 2. HaeIII REA patterns of the 441bp amplification products from 11 reference strains. Lanes:M, 100bp DNA ladder; 1, M. tuberculosis H37Rv(ATCC 27294);2, M. bovis(atcc 19210);3, M. bovis BCG(ATCC 27291) ;4, M. africanum(atcc 25420);5, M. kansasii(atcc 12478);6, M. scrofulaceum(atcc 19981);7, M. szulgai (ATCC 35799);8, M. gordonae(atcc 14470);9, M. avium(atcc 25291);10, M. intracellulare(atcc 13950) ;11, M. fortuitum(atcc 6841);M, 25 bp DNA ladder. Fig. 3. Sau96I REA patterns of the 441bp amplification products from 11 reference strains. Lanes:M, 25 bp DNA ladder;1, M. tuberculosis H37Rv(ATCC 27294) ;2, M. bovis(atcc 19210);3, M. bovis BCG(ATCC 27291);4, M. africanum(atcc 25420);5, M. kansasii (ATCC 12478);6, M. scrofulaceum(atcc 19981);7, M. szulgai(atcc 35799);8, M. gordonae(atcc 14470) ;9, M. avium(atcc 25291);10, M. intracellulare(atcc 13950);11, M. fortuitum(atcc 6841);M, 100bp DNA ladder. 441bp 만증폭되었다 (Fig. 1). 배양검사에서분리된 mycobacteria 160 균주중 150 균주는 M. tuberculosis, 10 균주는 NTM 으로판명되었다. 2. REA 양상표준균주를 HaeIII 로절단한결과 M. tuberculosis, M. bovis, M. africanum 은 155/130/70bp의 DNA 절편이생성되었고, M. bovis BCG 는 150/110/80bp, M. kansasii 는 130/105/80bp M. scrofulacium 은 150/130 /100bp, M. szulgai, 130/105/70bp, M. gordonae 는 Fig. 4. BstEII REA patterns of the 441bp amplification products from 11 reference strains. Lanes:1, M. tuberculosis H37Rv(ATCC 27294);2, M. bovis(atcc 19210);3, M. bovis BCG(ATCC 27291);4, M. africanum(atcc 25420);5, M. kansasii(atcc 12478);6, M. scrofulaceum(atcc 19981);7, M. szulgai(atcc 35799); 8, M. gordonae(atcc 14470);9, M. avium(atcc 25291) ;10, M. intracellulare(atcc 13950);11, M. fortuitum (ATCC 6841); M, 100 bp DNA ladder. 165/115/60bp, M. avium 은 130/105/45bp, M. intracellulare 는 150/130/60bp, M. fortuitum 은 150/125/ 60/55bp 의 DNA 절편을각각쉽게구별할수가있었다 (Table 2, Fig. 2). 표준균주를 Sau96I 으로절단한결과는 M. tuberculosis, M. bovis, M. africanum 은 275/ 145bp, M. bovis BCG 는 275/125bp, M. intracellulare
204 장진숙 김대근 최태열 Table 2. A schimetic diagram for the species identification of the reference strains by HaeIII, BstEII and Sau96I REA patterns from PCR-amplified 65 kda HSP gene sequences. Mycobacterial Species ATCC* No. Size of bands produced by HaeIII Sau96I BstEII M. tuberculosis H37Rv (ATCC 27294) 155/130/70 275/145 240/120/80 M. bovis (ATCC 19210) 155/130/70 275/145 240/120/80 M. bovis BCG (ATCC 27291) 150/110/80 275/125 240/120/100 M. africanum (ATCC 25420) 155/130/70 275/145 240/120/80 M kansasii (ATCC 12478) 130/105/80 245/125 240/210 M. scrofulaceum (ATCC 19981) 150/130/100 170/125/100 240/210 M. szulgai M. gordonae (ATCC 35799) (ATCC 14470) 130/105/70 165/115/60 280/110 390/45 No digestion 240/120/80 M. avium (ATCC 25291) 130/105/45 170/125/115 240/210 M. intracellulare (ATCC 13950) 150/130/60 170/125/115 240/120/100 M. fortuitum (ATCC 6841) 150/125/60/55 290/110 240/120/80 *:American Type Culture Collection, Rockville, Md 와 M. avium 은 170/125/115bp, M. scrofulacium 은 170/125/100bp, M. szulgai 는 280/110bp, M. fortuitum 은 290/110bp, M. gordonae 는 390/45bp 의 DNA 절편을관찰할수있었다 (Table 2. Fig. 3). 표준균주를 BstEII 로절단한결과는 M. tuberculosis, M. bovis, M. africanum, M. fortuitum, 및 M. gordonae 는 240 /120/80bp, M. bovis BCG, M. intracellulare 는 240 /120/100bp, M. avium, M. scrofulacium, M. kansasii 는 240/210bp 의 DNA 절편을관찰할수있었고, M. szulgai 는제한효소에의하여절단되지않았다 (Table 2., Fig. 4). 임상에서배양분리된 10개의 NTM 은 HaeIII로절단한결과 M. intracellulare 5균주, M. avium 이 3균주, M. fortuitum subsp. peregrinum 2균주로판명되었다. Sau96I 의결과는 HaeIII에서 M. intracellulare 로동정된 5균중 4균주가 M. scroflulacium 으로동정된것을제외하고는동일하게동정되었다. BstEII 의결과는 HaeIII 의결과와동일하였다. 3. 염기서열분석 HaeIII와 Sau96I 의제한효소분석에서서로다른결과를보인 4개의분리균주와표준균주 (M. intracellulare, M. scrofulacium) 의염기서열을비교한결과 M. intacellulare 의염기서열과의상동성이 99% 를나타내어 M. intracellulare로판정하였다. 고찰연구자들은인체감염된 M. tuberculosis 와 NTM 을진단하기위하여 mycobacteria 에 genus specific 한 DNA 의 primers 와, M. tuberculosis complex 에특이한 primers 를사용하여 M. tuberculosis complex 와 NTM 을구별하고, M. tuberculosis complexe 내에서의감별은 niacine accumulation 검사와 nitrate reduction 검사를실시하여 M. tuberculosis 를감별하였다. 실험에사용한시발체 Tb11, Tb12 는 mycobacteria 에공통적으로존재하는 65 kda heat shock protein 을 cording 하는 DNA 를증폭하여 441(396-836) bp의 DNA 를증폭하게끔고안하였다 [15, 16]. M. tuberculosis complex 에특이적인시발체 MPB 64-1 와 MPB 64-2 는 MPB 64 immunogenic protein 을 cording 하는유전자중 240(601-841)bp 의 DNA 를증폭하게끔고안하였다 [16, 18-20]. 본실험에서 PCR 반응액내에첨가제인 DMSO( 혹은 glycerol) 를첨가한이유는 M. kansasii, M. avium의경우첨가제를첨가하지않았을때는 441bp 의 genus 에특이적인 DNA 가증폭되지않았기때문이다. 이는시험균주에따라 PCR 반응액의조성을조절하여야할것을시사하는것이다 [15, 18]. M. tuberculosis, M. bovis, M. africanum에서는첨가제의유무에관계없이 441bp 의 DNA 와 240bp 의 DNA 가증폭되었다. M. bovis BCG 에서는 441bp 의 genus 특이적인 DNA 만증폭되고 240bp 의 M. tuberculosis complex 에특이적인 240bp DNA 는증폭이되지않았다. 이는사용된표준균주 M. bovis BCG가다른 M. tuberculosis complex 의 MPB64 gene 의염기서열에차이점이있기때문인것으로사료된다 [21]. Multiplex PCR 에서의분석민감도는 M. tuberculosis H37Rv 표준균주의집락을취해 MacFaland No. 1(3 10 8 CFU/mL) 에맞춘것으로이를 10배씩희석하여 DNA 를추출한후, 중합효소연쇄반응을실시한결과모든 my-
제한효소 HaeⅢ 를이용한비정형마이코박테리아의동정 205 cobacteria 에공통적으로증폭된 441bp DNA 절편은 10-6 까지증폭띠가유관적으로관찰되어 100CFU/mL의민감도를보였고, M. tuberculosis complex 에특이적인 240bp DNA 는 10-7 까지증폭되어 10CFU/mL의민감도를보여다른연구자들의 Multiplex PCR 의분석민감도와비슷하였다 [11]. NTM 의종동정은 genus 에특이적인 441bp 의 DNA 를제한효소분석 (REA) 법을이용하였다. 사용된제한효소는 HaeIII, Sau96I, BstEII 로염기서열중절단부위는각기 GG CC, G GNCC, G GTNCC 였다. HaeIII로표준균주를분석하였을때 M. tuberculosis copmlex중 M. tuberculosis, M. bovis, M. africanum은동일한 REA 양상을나타내었고, 나머지표준균주는육안적으로모두쉽게감별할수가있었다. M. bovis BCG 를쉽게감별할수있었던이유는또한 M. bovis BCG 의염기서열이다른 M. tuberculosis complex 의염기서열과일치하지않은것때문인것으로사료된다 [21]. Sau96I 으로처리했을때는 M. avium 과 M. intracellulare 가같은양상을보였고, 그외 M. tuberculosis complex 와 M. scrofulaceum, M. kansasii, M. gordonae M. szulgai, M. fortuitum, M. bovis BCG 가각각잘구분되었다. BstEII로처리했을때는 M. kansasii/m. scrofulaceum/m. avium 과 M. bovis BCG/M. intracellulare, 그리고 M. tuberculosis/m, bovis/m, africanum/m. gordonae/m. fortuitum 의 3가지양상으로구분이되었고 M. szulgai 는분할되지않았다. 이상의결과로보아 HaeIII 로만처리해도이번연구에서사용한표준균주는 M. bovis BCG를제외한 M. tuberculosis complex 와 NTM 을쉽게구분할수있었다. 3가지제한효소를사용한 REA 양상을 image analyzer 의 band analysis program 을이용하여도표로만들어본결과 (Table 2) 는 Telenti 등 [15], Steingrube 등 [9], Taylor 등 [22] 및 Devallois 등 [23] 의결과와비교할때각균주마다 ±5 bp 정도의 molecular size 차이로비슷한양상을나타냈다. 임상에서배양분리된 10개의 NTM 은 HaeIII로절단한결과 M. intracellulare 5균주, M. avium 이 3균주로판명되었고, 그외 2균주는연구자가사용한표준균주에는없었으나 HaeIII 를사용하였을때 M. fortuitum subsp. peregrinum(atcc 14467) 이 155/150/100bp로분절됨을규명한 Telenti 등 [18] 의결과와일치하여 M. fortuitum subsp. peregrinum으로판명하였다 [9, 15, 22]. Sau96I 의결과는 HaeIII와 BstEII 에서 M. intracellulare 로동정되었던 4균주가 M. scrofulaceum 으로동정되어동정에혼란이있어이 5균주를 M. intracellulare(atcc 13950), M. scrofulaceum(atcc 19981) 표준균주와더불어염기서열을분석하였다. Genus 특이적인 441bp 의증폭산물의염기서열분석결과 4례의임상분리균주는서로 100% 상동성을나타내었고 M. intracellulare 표준균주와는 99% 의상동성을보였고, M. scrofulaceum 표준균주와는 96% 의상동성을보여임상분리균주의염기서열분석결과는 M. intracellulare에더일치했다. Sau96I 제한효소처리에서 M. intracellulare가 M. scrofulaceum 으로동정된이유는증폭된 441bp 의 DNA 염기서열중에 141bp 부위의 T가 C로 mutation 을일으켜 Sau96I의 restriction site(g GNCC) 와일치되기때문에 M. scrofulaceum 으로동정된것으로사료된다. 이것으로보아 M. intracellulare 와 M. scrofulaceum 은 65kDa HSP 유전자의 441bp 증폭시 DNA 염기서열이밀접한유사성을갖고있으므로제한효소선택시이를염두에두고 HaeIII의결과를더중시하여야할것으로생각한다. 그외에 CfoI(HhaI) 과 AciI[9], BstNI와 XhoI[24] 등의제한효소를사용한연구가있었으나, NTM 중 M. avium, M. intracellulare, M. fortuitum 등이임상에서가장많이분리되고있는점을감안할때우선 HaeIII 제한효소를사용한 REA 를사용하면임상에서분리되는 NTM 은대다수쉽게동정되리라생각된다. 상기실험을임상검체에서직접, multiplex PCR을실시하고 REA를실시하려고시도하였으나증폭산물의양이일정치않아 M. tuberculosis 와 NTM 은쉽게진단할수는있었으나 NTM 의증폭산물의양이일정치않고미약한경우가많아 REA 의결과는신빙성이없어연구결과에서는제외시켰다. 상기결과를종합하면연구자들이사용한 multiplex PCR 은모든 mycobacterium 으로부터 M. tuberculosis 를쉽게구별할수있었으며, HaeIII 를이용한 REA 는임상에서많이분리되는 NTM 을종수준까지쉽게동정할수가있었다. 요약배경 : 임상에서분리되는 Mycobacterium 은표현형, 유전형및질병에따라여러가지이질적인군 (heterogenous group) 으로분류되고있다. 이에연구자는 multiplex PCR 법으로 M. tuberculosis 를구분하고 NTM 의증폭산물을여러가지제한효소를이용하여종 (species) 수준까지동정하였다. 방법 : 표준균주 11균주와임상에서배양분리된 160 균주를실험에사용하였다. multiplex PCR 에사용한 primers 는모든 mycobacteria 에존재하는 65kDa HSP 유전자를증폭하는시발체와 M. tuberculosis complex 에 MPB64 protein 유전자를증폭하는시발체를이용하여 multiplex PCR 을실시하였다. 증폭된 DNA 는 HaeIII, Sau96I, 및 BstEII 제한효소로처리하여전기영동하였다. 결과 :Multiplex PCR 에서 M. tuberculosis complex (M. bovis BCG 는예외 ) 는 441bp 와 240bp 의 DNA 가
206 장진숙 김대근 최태열 각기증폭되었다. M. bovis BCG 와 NTM 은 441bp의 DNA 만증폭되었다. 배양분리된 10균주의 NTM 은 HaeIII 제한효소를사용한 REA 에서 M. intracellulare 5균주, M. avium 3균주, M. fotuitum subsp. peregrinum으로동정되었다. 결론 : 연구자들이이용한 multiplex PCR 과 HaeIII를이용한제한효소분석법 (REA) 은 M. tuberculosis 와 NTM 을동정하는데있어서신속하고정확한방법이다. 참고문헌 1. Horsburgh CR Jr. Mycobacterium avium complex infection in the acquired immunodeficiency syndrome. N Engl J Med 1991;324:1332-8. 2. Vareldzis BP, Grosset J, Kantor ID, Crofton J, Laszlo A, Felten M. Drug resistant tuberculosis:laboratory issues(world Health Organization recommendations). Tubercle Lung Dis 1994;75:1-7. 3. Wolinsky E. Mycobacterial disease other than tuberculosis. Clin Infect Dis 1992;15:1-12. 4. Marks J, Szulge T. Thin-layer chromatography of mycobacterial lipids as an aid to classification; technical procedure; Mycobacterium fortuitum. Tubercle lung Dis 1965;46:400-11. 5. Butler WR, Jost KC Jr, Kilburn JO. Identification of Mycobacteria by high performance liquid chromartgraphy. J Clin Microbiol 1991;29:2468-72. 6. Levy-Frebault V, Daffe M, Goh KS, Laneelle MA, Aselineau C, David HL. Identification of Mycobacterium fortuitum and Mycobacterium chelonae. J Clin Microbiol 1983;17:744-52. 7. Musial CE, Tice LS, Stockman L, Roberts GD. Identification of Mycobacteria from Culture by using the Gen-probe Rapid dignostic system for Mycobacterium avium complex and Mycobacterium tuberculosis complex. J Clin Microbiol 1988;26:2120-3. 8. Ringuet H, Akoua-Koffi C, Honore S, Varnerot A, Vincent V, Berche P, Gaillard JL, Perre-Audigier C. hsp65 Sequencing for identification of Rapidly Growing Mycobacteria. J Clin microbiol 1999;37:852-7. 9. Steingrube VA, Gibson JL, Brown BA, Zhang Y. PCR amplification and Restriction Endonuclease Analysis of a 65-Kilodalton Heat Shock Protein Gene Sequence for taxonomic Separation of Rapidly Growing Mycobacteria. J Clin Microbiol 1995;33:149-53. 10. Takewaki S, Okuzumi K, Manabe I, Tanimura M, Miyamura K, Nakahara K, Tazaki Y, Ohkubo A, Nagai R. Nucleotide sequence comparison of the mycobacterial dnaj gene and PCR-restriction fragment length polymorphism analysis for identification of mycobacterial species. Int J Syst Bacteriol 1994;44:159-66. 11. 전창호, 하경임, 고은하, 이영현, 양창현. 단일시험관중합효소연쇄반응을이용한인형결핵균과비인형결핵균의감별검출. 대한임상병리학회지 1995;15:1:74-82. 12. Vaneechoutte M, Beenhouwer H, Claeys G, Verschraegen G, Rouck A, Paepe N, et al. Identification of Mycobacterium Species by Using Amplified Ribosomal DNA Restriction Analysis. J Clin Microbiol 1993;31:2061-5. 13. Wilton S, Cousins D. Detection and Identification of multiple mycobacterial pathogens by DNA amplification in single tube. PCR methods Appl 1992;1:269-73. 14. Sansila A, Hongmanee P, Chuchottaworn C, Rienthong S, Rienthong D, Palittapongarnpim P. Differentiation between Mycobacterium tuberculosis and Mycobacterium avium by Amplification of the 16S-23S Ribosomal DNA Spacer. J Clin Microbiol 1998;36:2399-403. 15. Telenti A, Marchesi F, Balz M, Bally F, Bottger E, Bodmer T. Rapid identification of Mycobacteria to the species level by polymerase chain reaction and restriction enzyme analysis. J Clin Microbiol 1993;31:175-8. 16. Cormican M, Glennon M, Riain UN, Flynn J. Multiplex PCR for identifying mycobacterial isolates. J Clin Pathol 1995;48:203-5. 17. Sanger F, Nicklen S, Coulson AR. DNA sequencing with chain terminating inhibitors. Proc Natl Acad Sci USA 1977; 74:5463-67. 18. Mustafa AS, Ahmed A, Abal AT, Chugh TD. Establishment and evaluation of a multiplex polymerase chain reaction for detection of mycobacteria and specific identification of Mycobacterium tuberculosis complex. Tubercle Lung Dis 1995; 76:336-43. 19. Cormican M, Barry T, Gannon F, Flynn J. Use of polymerase chain reaction for early identification of Mycobacterium tuberculosis in positive cultures. J Clin Pathol 1992; 45:601-4. 20. Lee BW, Tan JAMA, Wong SC, Tan CB, Yap HK, Low PS, Chia JN, Tay JSH. DNA amplification by the polymerase chain reaction for the rapid diagnosis of tuberculous meningitis. Comparison of protocols involving three mycobacterial DNA sequences, IS6110, 65 kda antigen, and MPB64. J Neuro Sciences 1994;123:173-9. 21. Philipp WJ, Nair S, Guglielmi G, Lagranderie M, Gicquel B, Cole S. Physical mapping of Mycobacterium bovis BCG Pasteur reveals differences from the genome map of Mycobacterium tuberculosis H37Rv and from M. bovis. Microbiology 1996;142:3135-4.
제한효소 HaeⅢ 를이용한비정형마이코박테리아의동정 207 22. Taylor TB, Patterson C, Hale Y, Safranek WW. Routine use of PCR-restrition fragment length polymorphism analysis for identification of mycobacteria growing in liquid media. J Clin Microbiol 1997;35:79-85. 23. Devallois A, Goh KS, Rastogkgi N. Rapid Identification of Mycobacteria to species level by PCR-Restriction Fragment length Polymorphism Analysis for the hsp65 Gene and proposition of an Algorithm to the differentiate 34 Mycobacterial species. J Clin microbiol 1997;35:2969-73. 24. Plikaytis BB, Plikaytis BD, Yakrus MA, Shinnick TM. Differentiation of slowly growing Mycobacterium species, including Mycobacterium tuberculosis, by gene amplification and restriction fragment length polymorphism Analysis. J Clin Microbiol 1992;30:1815-22.