The Korean Journal of Microbiology, Vol. 41, No. 2, June 2005, p. 117-124 Copyrightc2005, The Microbiological Society of Korea 16S-23S rrna Intergenic Spacer Region 을이용한 Vibrio ichthyoenteri Species-specific Primer 개발 문영건ㆍ허문수 * 제주대학교해양과학대학해양생물공학과 Rotifer 와병든넙치자어로부터분리된 2 개의균주는표현형적인특성확인결과 Vibrio ichthyoenteri 로확인이되었다. V. ichthyoenteri 를검출하기위해고감도 PCR 방법개발을하기위해 V. ichthyoenteri 16S-23S rrna intergenic spacer region(isr) 을분석하였고, V. ichthyoenteri 종특이적 primer 를개발하였다. V. ichthyoenteri 의 ISR 를분석한결과 1 개의다형성 ISR type 서열을포함하고있었다. ISR 서열은길이는 348bp 이며 trna gene 을가지고있지않았다. 이서열을가지고이미알려진다른 Vibrio 종의 ISR 서열과 mutiple alignment 를수행한결과여러영역에서높은가변성을나타내어가변부위를표적으로하여 V. ichthyoenteri 를검출하기위한종특이적 primer 를제작하였다. 제작된 primer 의특이성을확인하기위해 Vibrio 표준균주 19 종의 genomic DNA 와분리균주 18 group 에 genomic DNA 그리고 V. ichthyoenteri 와가장유사한서열을가지고있다고알려진 Vibrio 종의 genomic DNA 를가지고시험하였다. 그결과본연구에서제작된종특이적 primer 를가지고 PCR 반응을하면 V. ichthyoenteri 를검출할수가있다. Key words bacterial enteritis, species-specific primer, trna gene, Vibrio ichthyoenteri, 16S-23S rrna ISR 넙치종묘생산에있어특히자어기에발생하는감염성질병에는바이러스가원인인상피증생증 (VEH; viral epidermal hyperplasia) 과세균이원인인장관백탁증 (Bacterial enteritis) 이가장피해가큰질병으로들수있다. 특히장관백탁증의경우는자어기에만주로감수성이있는것으로알려져있으며, 부화후 25~30일령경의자어에발생하고단기간에거의전멸에가까운폐해를주는질병이다 (11, 12). 이질병의특징은장의점박상피에세균이감염되어점막에괴사, 박리가일어나고, 소화관의백탁및위축, 복부의함몰등의주요증상을나타낸다 (1). Masumura(10) 등은장관백탁증을유발하는원인균을분리하여형태학적, 생화학적, 생리학적, 병리학적그리고혈청학적시험을통하여 Vibrio species INFL (intestinal necrosis of flounder larvae) 로명명하였다. Muroga(13) 등은이분리균을먹인 rotifer (Brachionus plicatilis) 와 brine shrimp (Artemia salina nauplii) 를일령별로넙치자어에경구감염실험을하였으며, 이후 Ishimaru 등 (11) 이 V. ichthyoenteri 로명명하였다. 일반적으로 V. ichthyoenteri 는현재경구가유일한감염경로로인식되고있으며발병되면대부분대량폐사로이어지는질병이지만약 40일령이후에는감수성이없는것으로알려져있다 (5, 13). 따라서본연구에서는넙치 (Paralichthys olivaceus) 자어기의먹이생물섭취에의한장관백탁증원인경로를파악하기위하여초기먹이로공급되어지는동물성플랑크톤인 rotifer와넙치자어에서 장관백탁증원인균으로알려진 Vibrio ichthyoenteri 의분리를실시하였다. 또한분리되어진균주의생육및생장특성을조사하여 V. ichthyoenteri 에관한기초자료를획득하였다. 그리고대부분의세균은세개의 rrna 유전자를 16S-23S-5S rrna의순서로하나의 operon에가지고있다. 이중 16S rrna 유전자는종수준으로구분할수있는정보를담고있는정보를담고있는영역으로미생물간의유연관계를파악하는데유용하여가장많이쓰이고있으며, 현대세균분류학의토대가되는기준으로쓰이고있다. 그러나 16S rrna 유전자를비롯한 RNA 유전자부분은염기서열변이도가낮아종단계미만, 예를들면 serotype의동정에는사용하기어렵다고알려져있다. 그래서현재환경, 식품의약등자연계로부터분리한미생물의동정수단으로가장널리쓰이고있는 16S rdna 염기서열비교는대부분속 (genus) 혹은근연속까지의동정이가능할뿐이다. 그러나, 각각의유전자사이에존재하는 Intergenic Spacer Region (ISR) 은상대적으로변이도가크다. 두개의 ISR중특히 16S와 23S rrna 사이의 ISR이세균동정에많이사용되고있다. 그러므로 Vibrio ichthyoenteri 의 16S-23S rrna ISR 분석을통하여종특이적인검출 primer를개발하고, 이를이용하여원인균을신속검출함으로써자어기먹이및양식수계에서의감염을사전예방하는방법을개발하고자하였다. *To whom correspondence should be addressed. Tel: 064-754-3473, Fax: 064-756-3493 E-mail: msheo@cheju.ac.kr 117
118 Young-Gun Moon and Moon-Soo Heo Kor. J. Microbiol 원인균의분리와사용균주 재료및방법 장관백탁증을유발하는원인균의분리를위하여 2003년 5월에서 10월동안제주도내 5개소의넙치종묘배양장에서초기먹이로공급되어지는동물성플랑크톤인 rotifer와넙치자어배양수및 20~30일령넙치자어에서월 1회시료를채취하여장관백탁증원인균으로추정되는세균을분리하였다. 병원균의분리를위해서 rotifer는 0.8% 멸균생리식염수를사용하여 3회세척후무균적으로멸균스틱을사용하여마쇄하였고, 넙치자어는해부현미경으로소화관을관찰하면서장관을무균적으로절취하여 Marine agar (MA, Difco) 와 1.5% NaCl이첨가된 Thiosulfate Citrate Bile Sucrose Agar (TCBS, Difco) 에획선도말한후 26 o C, 24시간배양한후우점적형태의세균집락을순수분리하는방법을사용하였으며, 넙치자어배양수는 pore size 0.45 µm membrane filter (GN-6 Metrice Membrane Disc Filter Grid 47 mm, pall corporation, USA) 를이용하여 500 ml의배양수를여과 한후 membrane filter를각각 MA와 1.5% NaCl이첨가된 TCBS 평판에놓고 26 o C에서 24시간배양하여우점적으로자란세균집락을순수분리하는방법을사용하였다. 참조균주는한국미생물보존센터 (Korea culture center of microorganisms, KCCM) 에서제공받아본실험에사용하였다 (Table 1). 공시균의선정 총분리된 71개의균들을대상으로공시균주를선정하기위하여 1개의참조균주를포함하여 1.5% NaCl을첨가한 Brain Heart Infusion Agar (BHIA, Difco) 에서 26 o C, 24시간배양후그람음성간균을확인하였다. Vibrioaceae와 Aeromonadaceae를구분하기위하여비브리오 1 차선택배지인 TCBS에서의성장유무, 0/129 (2,4,-diamino-6,7- diisopropylpteridine phosphate) 에내성을조사하였다 (8). 그외생화학적성상시험은표준생화학검사법 (14) 에따라시험하였다. 공시균의생육조건검토 생화학적성상검사를통하여선정된공시균주 2개 (YG-1, YG-2) 와 1개의참조균주는 MA (Marine agar, Difco) 에획선도말하여 26 o C에서 24시간을배양후단일집락을 BHI (brain heart infusion, Difco) broth 10 ml에접종하여 26 o C에서 10 6 CFU/ml가되도록진탕배양하여전배양액으로실험에사용하였다. 최적배양조건을검토하기위하여온도는 4~40 o C, ph는 4~10, NaCl 농도는 0%~8% 의범위로설정하여 micro plate spectrophotometer 로 630 nm의흡광도에서 0, 2, 4, 6, 8, 12, 24 시간의생육도를측정하였다. 공시균주의 DNA 분리및 Random Amplified Polymorphic DNA 를이용한균주비교 참조균주 (KCCM 40870) 와분리균주 (YG-1, YG-2) 는 1.5% NaCl이첨가된 BHIB (Difco, USA) 배지 5 ml에접종하여 Shacking incubator 를이용하여 26 o C 에서 200 g 으로 24 시간배 양한배양액을 1.5 ml microcentrifuge tube 로옮겨서 16000 g 에서 1분간원심분리하여상등액을제거한후모아진 bacteria pellet을수집하여 Wizard Genomic DNA Purification Kit (Promega, USA) 을사용하여 genomic DNA를분리한후, UnicamUV/VIS Spectrophotometer (Heλios β. Unicam Ltd, United Kingdom) 를사용하여파장 260 nm에서 DNA농도를측정하였다. 장관백탁증원인균인 V. ichthyoenteri (KCCM 40870) 와분리균주중생육조건시험및생화학적성상검사에서 V. ichthyoenteri로동정되어진 YG-1과 YG-2에대해 TaKaRa 에서개발한 Microbial Universal Primer (MUP) Strain-typing kit을사용하여종내유전자다형성을분석하였다. PCR반응은 bacterial genomic DNA 50 ng, MUP (20pmol/ml) 1 µl, dntp mixture 2 µl, 10X PCR buffer 2 µl, 5 unit Ex taq polymerase (TaKaRa, Japan) 혼합액을멸균증류수를첨가하여최종부피 20 µl 로맞추 고, PTC-150 Mini cycler (MJ Research) 를사용하여반응시켰고, PCR과정은 94 o C에서 predenaturation 5분, 94 o C에서 denaturation 45초, 55 o C에서 annealing 45초, 72 o C에서 extension 1분간에반응을 30회동안수행하였고, 마지막 72 o C에서 extension 반응을 5분간반응하였다. 증폭된 PCR 반응산물은 GeneRuler TM 1 kb DNA ladder (Fermentas, USA) 를 maker로사용하여 2% agarose gel 전기영동으로확인하였다 (Fig. 1). V. ichthyoenteri ISR 증폭을위한 primer 제작및 PCR 반응 V. ichthyoenteri intergenic spacer region (ISR) 의증폭를위한 primer는 Vibrio 속의 16S rrna gene과 23S rrna gene을 multiple aligment를수행하여보존영역이높은 16s rrna 3' 말단, 23s rrna 5' 말단서열을기초로 primer를선택하였다. Forward primer 16SF ICH와 reverse primer 23SR ICH primer는 ( 주 )Bioneer 에의뢰하여제작하였다 (Table 2). PCR 반응은 bacterial genomic DNA 100 ng, 1 µm 에 primer Table 1. The strains used in this study Stains Origin YG-1 Isolated strains Vibiro ichthyoenteri YG-2 Intestine of olive flounder Jejudo, 2003 Reference strain R-1(KCCM a 40870) Hiroshima University, 1996 a : KCCM ; Korea Culture Center of Microorganisms
Vol. 41, No. 2 V. ichthyoenteri species-specfic primer 개발 119 Fig. 1. Random amplification of polymorphic DNA fragment patterns of V. ichthyoenteri and isolated strain YG-1, YG-2 by MUP3 (microbial universal primer 3). M: 1 kb DNA ladder, 1: V. ichthyoenteri (KCCM 40870), 2: YG-1, 3: YG-2. pairs (16SF ICH, 23SR ICH), 10 mm dntps, 10Ⅹ PCR buffer, 5 Unit Taq polymerase (TAKARA, Japan)) 혼합액에멸균된증류수를첨가하여최종부피를 50 µl로맞추고, PTC-150 Minicycler (MJ Research) 를사용하여증폭하였다. ISR 증폭과정은 94 o C predenaturation 2분, 94 o C denaturation 45초, 57 o C annealing 45초, 72 o C extension 1분의반응을 30회동안수행하였고, 마지막 72 o C에서 5분간 extension을실시하였다. 증폭된 PCR 반응산물은 GeneRulerTM 100 bp DNA ladder (Fermentas, USA) 를 maker로사용하여 1.7% agarose gel 전기영동으로크기를확인하였다 (Fig. 2). PCR 반응산물의 Cloning 과 Sequencing AccuPrep TM PCR Purification Kit (Bioneer, Korea) 을이용하여증폭된 DNA를분리하여 cloning을위한 insert로이용하였다. 분리된 DNA는 pgem T-easy vector (Promega, USA) 에 ligation을실시한후 E. coli XL-1 Blue에형질전환하였다. Ampicilin (50 µg/ml), IPTG (Isopropylthio-β-D-galactopyranoside, 25 mg/ Fig. 2. Electrophoresis of PCR-amplified 16S-23S rrna intergenic spacer regions of V. ichthyoenteri (KCCM 40870) on 1.7% agarose gel. Left lane is molecular weight marker (100 bp ladder). Right lane is the PCR-amplified 16S-23S rrna intergenic spacers of V. ichthyoenteri KCCM 40870. Table 2. Primer used for intergenic spacer region PCR amplification and detection PCR Primer Gene Name Position Sequence 16SF a ICH 16S 5'end CAC ACC ATG GGA GTG GGC TG 23SR a ICH b 23S 3' end GGT GGC ACA TGC GAA TCA GTG ICH ISR-F b ISR CCA GCA CTG GCT AAT CCA CAA CT ICH ISR-R b ISR GTG CGC AAC GGC TAT GAT A puc/m13f c GTT TTC CCA GTC ACG AC puc/m13r c CAG GAA AAC AGC TAT GAC a : primers designed for ISR amplification (F; forward and R; reverse) b : primers designed for the V. ichthyoenteri detection c : primers desingned for the pgem T-easy vector ml) 와 X-gal (5-bromo-4-chloro-3-indolyl-D-galactopyranoside, 10 µg/ml) 이포함된 LB배지 (1% Tryptone, 0.5% Yeast extract, 1.5% agar, 1% NaCl) 에도말하여배양한후 white colony를선별하여 ampicilin이첨가된 LB broth에접종하여 37 o C에서 250 rpm에서 16시간동안진탕배양하였다. 배양 16시간후배양액을 1.5 ml microcetrifuge tube 에옮겨 16,000 g 에서 1 분간원심분리하여 상등액을버리고 bacteria cell을모은후 AccuPrep TM plasmid extraction kit (Bioneer, Korea) 을이용하여 Plasmid DNA를분리하였다. 삽입된 insert 크기를확인하기위하여제한효소 EcoR1 (Bioneer, Korea) 로절단한후 2% agarose gel 전기영동을하여 insert 크기를확인하였다. 염기서열분석은 ( 주 ) 마크로젠에의뢰하였다. 자료분석 V. ichthyoenteri의 ISR 염기서열분석을위하여 ClustalW (ver. 1.71) program을사용하여 multiple aligment을수행하였으며, ISR의유전자구성을알아보기위해 trnascan-se program을사용하여 trna gene을확인하였다 (Table 7). 장관백탁증원인균검출을위한 primer 제작과 Detection PCR 반응 장관백탁증원인균인 V. ichhtyoenteri 검출을위한 detection primer를제작하기위해 V. ichthyoenteri ISR 서열을 Clustal W program을사용하여이미밝혀진 6종의 Vibrio ISR 서열과 multiple aligment을수행하여 V. ichthyoenteri 에종특이적 primer를제작하였다 (Table 2). 제작된 primer에특이성을확인하기위해서 V. ichthyoenteri KCCM 40870 이외에 19개의 V. strain (Table 4) 과, 분리되어진총 71개의 Vibrio sp. 에서생물학적검사와생화학검사, 탄수화물발효능검사에의해분류되어진 18개 group (Table 6) 에서각 1균주씩, 그리고 V. ichthyoenteri 와가장유사한염기서열을가지고있다고알려진 V. scophthalmi (Table 5) 를 Wizard Genomic DNA Purification Kit (Promega, USA) 을사용하여 genomic DNA를분리하여 detection PCR을실시하였다. PCR 반응은동일농도의 DNA를 template로하여반응시켰는데, genomic DNA, 1 µm에 primer pairs (ICH ISR-F, ICH ISR-R), dntps, 10X PCR buffer, Taq
120 Young-Gun Moon and Moon-Soo Heo Kor. J. Microbiol DNA polymerase (TAKARA, Japan) 을혼합액에 3차증류수를첨가하여최종부피를 50 µl로맞추고, PTC-150 Minicycler (MJ Research) 를사용하여 PCR 증폭하였다. PCR 반응조건은최초 94 o C에서 denaturation 5분, 94 o C에서 denaturation 45초, 58 o C에서 annealing 45초, 72 o C에서 extension 1분간에반응을 30회반복하였고, 마지막 extension은 72 o C에서 5분간반응시켜반응산물은 1.7% agarose gel 전기영동으로증폭된산물의크기를확인하기위해 100 bp DNA ladder를 maker로사용하였다. 결과및고찰원인균의분리실험에사용한균주는 2003년 5월과 2003년 10월에걸쳐제주도내 5개소종묘배양장에서초기먹이로공급되어지는 rotifer 와넙치자어배양수그리고 20~30일령넙치자어에서월1회시료를채취하여장관백탁증원인균분리를시도하였다. MA와 TCBS에서형성된집락을순수분리하여 Vibrio 의기본적인성상을나타내는보이는균주를 71개의균을분리하였으며생화학적동정실험을통하여장관백탁증원인균으로동정이이루어진균은 2 group으로분류되었다. 각 group에서 1균주씩을선택하여 (YG-1, YG-2) 본실험에사용하였다. 각균주는 1.5% NaCl이첨가된 BHIA에서크림색집락를, TCBS에서는 YG-1은녹색, YG-2는황색의집락를형성하였다. 공시균주의특성과 Random Amplified Polymorphic DNA 참조균주및 2개의공시균주에대한생화학적대사및당발효능과염분농도, 온도, ph에따른최적생육조건결과는 Table 3과같았다. 세균주모두생육을위해염분을필요로하였으며 8% 이상의염분농도에서는생육이이루어지지않았다. 온도는 25 o C, ph7-8 에서최적의생육능을보였으며 glucose, fructose, sucrose에서생육능이양호하나 lactose는이용하지못하였다. 분리균주들의생화학적및생육특성과본균주들의종간유연관계를확인하기위하여 TaKaRa 에서시판되는 Microbial Universal Primer (MUP) 인 MUP Strain-typing Kit (TaKaRa, Japan) 을사용하여 PCR을한후 gel 상에서표준균주와분리균주인 YG-1과 YG-2의 polymorphism을분석한결과 750 bp에서 6 kb까지의분자량으로동일한다형성밴드를형성하였으며 (Fig. 1) 본균주들은동일한종으로판단되었다. 본실험은모두 10개의 primer 를이용하여 Vibrio 속의다른종과비교하였으며 1개의 primer (MUP3) 에서만분리균주및참조균주에서동일한다형성밴드를얻었고다른종들에서는다른양상을보였다. V. ichthyoenteri 16S-23S rrna ISR 분석 V. ichthyoenteri (KCCM 40870) 의 genomic DNA를주형으로하여 16SF-ICH와 23SR-ICH primer를이용 PCR반응을수행하였다. PCR반응에의해증폭되어진 ISR fragment는 1.7% agarose gel 전기영동으로증폭된산물의크기를확인하였다 (Fig. Table 3. Biochemical and physiological charateristics of the used strains Tested items Reference strain Isolated strains R-1 YG-1 YG-2 Gram stain - - - Motility + + + Oxidase activity + + + Catalase activity + + + Fermentation glucose + + + Gas production of glucose - - - Indole - - - Methyl red + + + ONPG hydrolysis - - - H 2 S production - - - CF test F F F MR test + + + VP test - - - O/129 sensitivity + + + Hydrolysis of Tween 80 - - - Growth at: 4 o C - - - 15 o C - - - 25 o C + + + 30 o C +w +w +w 35 o C - - - 40 o C - - - Growth in the presence of: 0% NaCl - - - 1% NaCl +w +w +w 3% NaCl + + + 6% NaCl +w +w +w 8% NaCl - - - 10% NaCl - - - Growth on: ph4 - - - ph5 - - - ph6 - - - ph7 + + + ph8 + + + ph9 +w +w +w ph10 - - - Acid production from adonitol - - - myo-inositol - - - D-sorbitol - - - maltose + + + D-xylose - - - D-galactose - - - D-mannose + + + fructose + + + sucrose +w +w + D-glucose + + + lactose - - - D-mannitol - - -
Vol. 41, No. 2 V. ichthyoenteri species-specfic primer 개발 121 Table 4. Reference strains used in ISR-targetted PCR reaction Strains number* Species Strains number* Species KCCM 40870 V. ichthyoenteri KCTC 2730 V. proteolyticus KCTC 2714 V. aestuarianus KCTC 2731 V. furnisii KCTC 2715 V. cholerae KCTC 2733 V. cincinnatiensis KCTC 2716 V. campbelli KCTC 2735 V. mediterranei KCTC 2719 V. gazogenes KCTC 2736 V. metschnikovii KCTC 2720 V. harveyi KCTC 2737 V. minicus KCTC 2721 V. logei KCTC 2810 V. cyclosites KCTC 2722 V. nereis KCTC 2928 V. alginolyticus KCTC 2726 V. salmonicida KCTC 2954 V. vulnificus KCTC 2729 V. parahaemolyticus KCTC 2962 V. vulnificus *KCCM : Korea Culture Center of Microorganisms *KCTC : Korean Collection for Type Cultures 2). 400 bp와 500 bp사이에 1개의 major band, 700에서 800 bp 사이에 1개의 minor band를확인할수있었다. 증폭된 ISR fragment를 plasmid vector에 cloning하여선택된 clone을 EcoR1 으로절단한후 agarose gel 전기영동으로 insert 크기를확인하였다. ISR 증폭 PCR반응에서나왔던 800 bp fragment는 cloning이확인된 clone이존재하지않았으며 cloning이확인된 major band의염기서열을확인하였다. 염기서열분석후 5 말단 16S rrna와 3 말단 23S rrna 염기서열부분을제외하고 trnascan-1.21을이용하여 trna를 gene을분석하였다. ISR에 Table 5. Most similar sequence of other known bacterial species Strain Species Origin Isolated strain V. scophthalmi Jejudo, 2003, tubot Table 6. Isolated strains used in ISR-targetted PCR reaction group Isolsted strain number A(V. fischeri) 6, 22, 27, 28, 33 B(V. cholerae) 5 C(V. campbelii) 8, 10 D(Vibro sp.) 11, 15, 19, 31 E(V. gazogenes) 12, 38 F(V. harveyi) 13, 20, 30, 37, 41, 48, 70 G(V. alginolyticus) 14, 16, 50, 56, 58, 65, 66, 67 H(V. costicola) 17, 18 I(Vibro sp.) 29 J(Vibro sp.) 32, 34, 78 K(Vibro sp.) 36 L(Vibro sp.) 43 M(Vibro sp.) 59 N(V. pelagius) 35, 53, 69, 79 O(Vibro sp.) 64 P(Vibro sp.) 76, 77 Q V. ichthyoenteri(-) 4, 9, 21, 23, 24, 25, 26, 39, 40, 44, 45, 46, 47, 62, 68, 73, 74, 75, 80, 81, 82, 83 R V. ichthyoenteri(+) 61, 63 Not Vibro sp. 1, 2, 3, 7, 42, 49, 52, 54, 55, 60, 71, 72, 84, 85 존재하는 trna coding gene의조합에따른 Vibrio 의 ISR type은 ISR-no(tRNA gene을 coding하지않는 ISR), ISR-A, ISR-E, ISR-AE, ISR-EV, ISR-IA, ISR-EAV, ISR-EKV, ISR-IAV, ISR- EKAV 등 10가지종류의 ISR이보고되고있으며가장일반적인것은 ISR type이 ISR-E와 ISE-IA이나장관백탁증원인균인 V. ichthyoenteri (KCCM 40870) ISR은 trna gene이없는 ISRno type으로밝혀졌다 (Table 7). V. ichthyoenteri 검출을위한 primer 제작및 detection PCR 반응 V. ichthyoenteri에대한종특이적 primer를제작하기위하여 GenBank에등록되어있는 6종의 Vibrio genus에 ISR nucleotide 서열을참고하여 V. ichthyoenteri ISR-no type 서열과 multiple aligment를수행하였다 (Fig. 3). Multiple alignment 수행후 non coding region내의가변부위를표적으로하여 Foward primer ICH ISR-F 5'-CCAGCACTGGCTAATCCACAACT-3' 와 Reverse primer ICH ISR-R 5'-GTGCGCAACGGCTATGATA-3' 을제작하였다제작된 primer의종특이성을확인하기위하여 16SF ICH 와 23SR ICH primer와 ICH ISR-F와 ICH ISR-R primer를혼합첨가하여 (data not shown) 각각의 primer에따른적절한조합에의해 predenaturation시간과 primer anneling 온도를제외하고 16S-23S ISR 증폭 PCR 조건과동일하게하여 PCR 반응을실시하였다. 유전자은행 KCTC에서 19종의 Vibrio 균주를분양받아 genomic DNA를분리하여 detection PCR 반응에사용하였으며 positive control로 V. ichthyoenteri (KCCM 40870) 을동일하게 PCR 반응을실시하였다. Fig. 4에서보는바와같이 positive control로사용된 V. ichthyoenteri (KCCM 40870) 만이원하는크기의밴드 (348 bp) 를형성하였을뿐다른 19개의 Vibrio 균주는 Table 7. The size and trna composition of the 16S-23S rrna intergenic spacer region of V. ichthyoenteri KCCM 40870 Size (bp) Number of Type trna gene spacer amplified fragment clones (n=20) ISR-no No 348 410 5
122 Young-Gun Moon and Moon-Soo Heo Kor. J. Microbiol Fig. 3. Alignment of representetive 16S-23S ISR sequence of Vibrio species. spl; V. splendidus (accession number AF 413024), cam; V. campbellii (accession number AF 412997), par; V. parahaemolyticus (accession number AY 298808), cho2; V. cholerae (accession number AF 114721), cho47; V. cholerae (accession number AF 114743), mim; V. mimicus (accession number AF 114747), ich; V. ichthyoenteri KCCM 40870. Forward and reverse primer used in the species-specific PCR detection are underlined. 목적하는 크기의 band를 확인할 수 없었다. 이상의 결과를 토대 로 자어, 배양수, 먹이생물에서 분리된 Vibrio 균주의 V. ichthyoenteri 종 특이적 primer에 대한 확인을 위하여 이전 실험 에서 분리된 18 group에 균주의 genomic DNA를 분리하여 detection PCR 반응을 수행한 결과(Fig. 5) 생화학적 성상 등을 통해 V. ichthyoenteri로 분류되었던 2개 그룹의 균주에서 목적하 는 band를 확인하였고, 확인된 그룹에 genomic DNA를 16S rrna sequencing한 결과 V. ichthyoenteri와 99% 일치하는 결과 를 보였다. 또한 V. ichthyoenteri와 가장 유사한 염기서열을 가지 고 있다고 알려진 V. scophthalmi 야생분리균주(Table 5, Fig 6) 를 detection primer (Table 2)를 가지고 detection PCR을 수행한 결과 Fig. 7 에서 나타나듯이 V. ichthyoenteri 만이 검출되었다. 따라서 V. ichthyoenteri (KCCM 40870) ISR의 서열로 제작한 Fig. 4. PCR amplification of the rrna of different Vibrio strains using ISR-targeted primer. ICH ISR-F and 23SR-ICH. Lane M, 100bp DNA ladder; 1,KCCM40870; 2,KCTC2714; 3,KCTC 2715; 4, KCTC 2716; 5, KCTC 2719; 6, KCTC 2720; 7, KCTC 2721; 8, KCTC 2722; 9, KCTC 2726; 10, KCTC 2729; 11, KCTC2730; 12, KCTC 2731; 13, KCTC 27331; 14, KCTC 2735; 15, KCTC 736; 16, KCTC 2737; 17, KCTC 2810; 18, KCTC 2928; 19, KCTC 2954; 20, KCTC 2962. primer가 넙치 자어에 발병하는 장관백탁증 원인균인 V. ichthyoenteri 의 신속한 검출과 정확한 동정을 위한 molecular marker로 이용할 수 있음을 확인하였고, 배양수나 먹이생물의 신 속 진단 검출 방법으로 장관백탁증의 예방에 기여할 수 있을 것 으로 생각된다.
Vol. 41, No. 2 V. ichthyoenteri species-specfic primer 개발 123 Fig. 5. PCR amplification of the rrna of different Vibrio strains using ISR-targeted primer. ICH ISR-F and 23SR-ICH. Lane M, 100bp DNA ladder; 1, 11: KCCM 40870; 2: ioslated A group; 3: isolated B group; 4: isolated C group; 5: isolated D group; 6: isolated E group; 7; isolated F group; 8: isolated G group; 9: isolated H group; 10: isolated I group; 12: isolated J group; 13: isolated K group; 14: isolated L group; 15:isolated M group; 16:isolated N group; 17: isolated O group; 18: isolated P group; 19: isolated Q group; 20: isolated R group. Fig. 6. Dendrogram showing the phylogenetic relationship among trains of Vibrio genus and closely related bacteria. The length of each pair of branches represents the distance between sequence pairs, while the units at the bottom of the tree indicate the number of substitution events. 요약 2003년 5월과 2003년 10월동안에넙치종묘배양장에서초기먹이로공급되어지는동물성플랑크톤인 rotifer와 20~30일령넙치자어및넙치자어배양수에서 V. ichthyoenteri를분리하기위해실험한결과총 71개의 Vibrio sp. 분리가되었고, 생화학적동정결과 2개의그룹에서 24개균의 V. ichthyoenteri로동정되어일본에서분리된참조균주와종간유연관계를확인하여본결과 750 bp에서 6 kb까지의분자량으로동일한다형성 band pattern 을나타내어동일한종으로판단되었다. V. ichthyoenteri의신속한검출을위한종특이적 primer는 V. ichthyoenteri (KCCM Fig. 7. PCR amplification of the rrna of different Vibrio strains using ISR-targeted primer. ICH ISR-F and 23SR-ICH. Lane M, 100 bp DNA ladder, Lane 1, V. ichthyoenteri, Lane 2, V. scophthalmi. 40870) ISR의서열중 non-coding region내가변부위를표적으로하여제작하였다. 그리고제작된 primer에특이성을확인하기위하여 V. ichthyoenteri (KCCM 40870) 을 Positive control로하여 KCTC에서분양받은 19종의 Vibrio 속균주의 genomic DNA와분리균주 18 group genomic DNA 그리고참조균주와가장유사한염기서열을가지고있다는 V. scophthalmi의 genomic DNA 를가지고 PCR 결과 V. ichthyoenteri 만의특이적인 band가생성됨을알수가있다. 또한분리균주 18 group PCR 결과에서생화학적동정에서 V. ichthyoenteri로동정되어진 Q, R group에서참조균주와동일한 band pattern을나타내어 16S rrna sequencing 결과 V. ichthyoenteri 와 99% 일치하였다. 따라서 V. ichthyoenteri (KCCM 40870) ISR의서열로제작한 primer가넙치자어에발병하는장관백탁증원인균인 V. ichthyoenteri 의신속한검출과정확한동정을할수있는 molecular marker로이용할수있음을확인하였다. 감사의글 본논문은제주대학교해양과학대학 NURI 사업에의해지원되었음. 참고문헌 1. 박성우, 오명주 (2001). 어류질병. 진솔., pp.100-104. 2. 심두생, 이주석, 허문수, 김진우 (1995). 양식생물질병진단연구 ( 분리균주에대한혈청학적진단및최소발육저지농도조사 ). 수진사업보고서, 405-423. 3. 이정백, 노섬, 송춘복 (1995). 넙치, Paralichthys olivaceus 자어에서분리한장관백탁증의원인균인 Vibrio sp.(infl group) 의생물학적및생화학적특성. 한국어병학회지, 8(2), 99-109. 4. 진창남, 이창훈, 오상필, 나오수, 허문수 (2003). 양식넙치, Paralichthys olivaceus 치어의스쿠티카충감염경로. 한국
124 Young-Gun Moon and Moon-Soo Heo Kor. J. Microbiol 어병학회지, 16(1), 13-21. 5. D-H Kim, H-J Han, S-M Kim, D-C Lee and S-I Park. 2004. Bacterial enteritis and development of the larval digestive tract in olive flounder, Paralichthys olivaceus(temmminck & schlegel). J. Fish Diseases. 27, 497-505. 6. G.A. Bisbal., and D.A. Bengston. 1995. Development of the digestive tract in larval summer flouder. J. Fish Biol. 47, 277-291. 7. Ishimaru, K., M. Akagawa-Matsushita, and K. Muroga. 1996. Vibrio ichthyoenteri sp. nov.,a pathogen of Japanese flounder Paralichthys olivaceus larvae. Inter. J.syst bacteriol. 46(1), 155-159. 8. Lee HK., SS Lee. 1997. Identification of the Vibrios isolation from the Shrmp(Carngon affinis) in estuary of Nakdong river in Kor. J. Microbiol. 32, 523-537. 9. Maeda, T., N. Takada, M. Furushita and T. Shiba. 2000. Structural variation in the 16S-23S rrna intergenic spacers of Vibrio parahaemolyticus. FEMS Microbiol. Lett. 192, 73-77. 10. Masumura, K., Y. Iida, T. Nakai, T. Mekuchi. 1989. The effects of water temperature and fish age on a herpesvirus infection of Japanese flounder larvae, Paralichthys olivaceus. Fish Pathol. 24, 111-114. 11. Murata, O. 1987. Infectious intestinal necrosis in flounder. Fish Pathol. 22, 59-61. 12. Muroga, K. 2001. Viral and bacterial diseases in larval and juvenile marine fish and shellfish : A review. Fish Pathol. 30, 71-85. 13. Muroga, K., H. Yasunobu, N. Okada, & K. Masumura. 1990. Bacterial enteritis of cultured flounder Paralichthys olivaceus larvae. Dis. Aquat. Org. 9, 121-125. 14. MacFaddin, J.F. 2000. Individual biochemical tests. In: Biochemical Tests for Identification of Medical Bacteria, 3rd ed. pp.1-456. 15. Valle, L.D., L. Zanella, P. Belvedere, and L. Colombo. 2002. Use of random amplication to develop a PCR detection method for the causative agent of fish pasteurellosis, Photobacterium damselae subsp. piscicda(vibrionaceae). Aquaculture. 207, 187-202. 16. Young, R.A., R. Macklis, and J. A. Steitz. 1979. Sequence of the 16S-23S spacer region-in two ribosomal RNA operons of Escherichia coli. J. Biol. Chem 254, 3264-3271. 17. Yasuda, K., and N. Taga. 1980. A mass culture method for Artemia salina using bacteria as food. Mer. 18, 53-62. 18. Yoshimizu, M., I. Kaori, K. Kazuko, I. Nao, and Takahisa. 1999. Bacteria flora of hatchery reared Japanese flounder. Bull. Fac. Fish. Hokkaido Univ. 50, 193-200. (Received February 22, 2005/Accepted May 30, 2005) ABSTRACT : Use of 16S-23S rrna Intergenic Spacer Region for Species-specific Primer Developed of Vibrio Ichthyoenteri Young-Gun Moon and Moon-Soo Heo*(Faculty of Applied Marine Science, Cheju National University, Jeju 690-756, Korea) Two bacterial isolates obtained from rotifer and diseased olive flounder larvae, Paralichthys olivaceus, were identified as Vibrio ichthyoenteri based on the results of phenotypic characterization. In an attempt to develop rapid PCR method for the detection of V. ichthyoenteri, we examined the 16S-23S rrna intergenic spacer region(isr) of V. ichthyoenteri and developed species-specific primer for V. ichthyoenteri. Analysis of the ISR sequences showed that V. ichthyoenteri contains one type of polymorphic ISRs. The size of ISRs was 348 bp length and did not contain trna genes. Mutiple alignment of representative sequences from different V. species revealed several domains of high sequence variability, and allowed to design species-specific primer for detection of V. ichthyoenteri. The specificity of the primer was examined using genomic DNA prepared from 19 different V. species, isolated 18group Vibrio species and most similar sequence of other known Vibrio species. The results showed that the PCR reaction using species-specific primer designed in this study can be used to detect V. ichthyoenteri.