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ORIGINAL ARTICLE Korean J Clin Lab Sci. Vol. 45, No. 1, Mar. 2013 21 Korean J Clin Lab Sci. 2013, 45(1):21-25 ISSN 1738-3544 Errors of Antibiotic Susceptibility Testing from Automated and Manual Systems in Clinical Isolates of Acinetobacter baumannii Ji Youn Sung, Ji-Eun Oh, and Eun Sun Kim Department of Biomedical Laboratory Science, Far East University, Eumseong 369-700, Korea Acinetobacter baumannii is an aerobic, gram-negative and glucose-non-fermenting bacterium, which has emerged as a serious opportunistic pathogen. Many clinical microbiology laboratories use the Vitek 2 system for the routine antimicrobial susceptibility testing process, including testing on A. baumannii isolates. However, in case of amikacin, it is now recommended to perform additional antimicrobial susceptibility testing for A. baumannii strains due to the relatively lower minimum inhibitory concentration (MIC) in the Vitek 2 system compared to conventional reference methods. In our study, we assessed MIC for amikacin susceptibility testing of A. baumannii isolates in the Vitek 2 system, the agar dilution, Etest, and disk diffusion method. We collected 40 gentamicin-resistant, A. baumannii strains (amikacin MIC by Vitek 2: 2 μg/ml, 2 isolates; 4 μg/ml, 34 isolates; 8 μg/ml, 4 isolates) from a University hospital and compared the Vitek 2 system to other reference methods for testing susceptibility to amikacin. The Vitek 2 system showed major errors in all of the 40 isolates, yielding a low MIC. The results of our study strongly suggested that the Vitek 2 system was not a reliable method to test the MICs of gentamicin; ranging from 16 μg/ml for amikacin susceptibility. Other tests, such as agar dilution, Etest, or disk diffusion methods, should be paralleled to determine the MIC of amikacin in A. baumannii. Keywords: Acinetobacter baumannii, Amikacin, Agar dilution, Etest Corresponding author: Ji Youn Sung Department of Biomedical Laboratory Science, Far East University, Wangjang-ri, Gamgok-myeon, Eumseong-gun, Chungbuk 369-700, Korea. Tel: 82-43-879-3668 E-mail: azaza72@naver.com This is an Open Access article distributed under the terms of the Creative Commons Attribution Non-Commercial License (http://creativecommons.org/licenses/by-nc/3.0) which permits unrestricted non-commercial use, distribution, and reproduction in any medium, provided the original work is properly cited. Copyright 2013 Korean Society of Clinical Laboratory Science. All rights reserved. Received: January 29, 2013 Revised: February 7, 2013 Accepted: March 13, 2013 서론광범위항균제의사용이늘어나면서세균의항균제에대한내성은점차증가하여전세계적으로문제가되고있다. 또한다제내성을보이는그람음성간균의유병률이높아지고있는데그대표적인예가 Acinetobacter baumannii이다 (D'Agata, 2004; Kim과 Lee, 2008; Koo 등, 2010). 이세균은호기성의포도당비발효그람음성구간균으로자연과병원환경에광범위하게분포하고있으며외이도염, 골수염, 뇌수막염, 심내막염, 폐렴, 요로감염및균혈증등다양한유형의감염증을유발한다 (Srinivasan 등, 2009). 또한 Pseudomonas aeruginosa에이어두번째로흔한병원감염균으로여러항균제에대해내재성혹은획득내성을지니고있기때문에이세균에의한감염증의치료는쉽지않다 (Bergogne-Berezin 과 Towner, 1996). 일반적으로 A. baumannii는 cephalosporin, aminoglycoside, fluoroquinolone 그리고 monobactam 등으로치료를하는데이중 aminoglycoside 는다소간의신독성과이독성이있지만항세균작용이빠르고살균성으로작용하여여러감염치료에널리쓰이고있다. 국내많은임상미생물검사실에서는배양검사가의뢰되는많은수의검체를적은비용과노동력으로검사하면서도신속하게균동정및항균제감수성결과를얻기위해자동화장비를사용하고있다 (Foxman, 2002). 가장보편적으로임상미생물검사실에도입하여사용하고있는자동화장비는 Clinical and Laboratory Standards Institute (CLSI, Wayne, PA, USA) 의참고방법과비교하였을때 96% 의일치율을보이고술식이간단한 Vitek 2 자동화장비 (biomérieux, Durham, NC, USA) 이다 (Ligozzi 등, 2002). 그러나 A. baumannii 균종을대상으로 Vitek 2 자동화장비를이용하여얻은 amikacin에대한 MIC 값이다른항균제감수성검사법

22 Ji Youn Sung, et al. Antibiotic Susceptibility Testing Errors in A. baumannii 에의한 MIC (minimum inhibitory concentration) 값보다상대적으로낮아결과를보고할때확인검사가필요하다고보고되고있다 (Hsieh 등, 2009). 또한 Vitek 2 자동화장비제조사에서도 A. baumannii 균종에서 amikacin 항균제에대해서는다른감수성검사법으로추가적인검사를하여결과를확인후보고하도록요구하고있다. 감염증을항균제로치료할때그효과에영향을주는주된요인은감염세균의항균제에대한감수성, 항균제의특성및환자의방어력 3가지이다. 따라서시험관내에서이루어지는항균제감수성검사는감염치료에가장유효한항균제를알아내기위한것으로매우중요한검사라할수있다. 그러나환자를치료시항균제감수성시험결과에서감수성으로나온항균제를치료제로사용했는데도치료에실패한예들이보고되고있어검사결과의정확도를높일필요성이부각되고있다 (Fiebelkorn 등, 2003). 이에저자들은 A. baumannii 균종을대상으로항균제감수성검사를시행했을때검사법간의불일치율이가장높은것으로보고되고있는 amikacin 에대하여, Vitek 2 자동화장비에의한항균제감수성검사결과와한천희석법, Etest 및디스크확산법에의한항균제감수성검사결과를비교하여신빙성을검토하고자하였다. DNA polymerase (SolGent, Daejeon, Korea) 및증류수를혼합하여총부피 25 μl의반응용액을만들었다. Gene Amp PCR System 9600 (Perkin-Elmer Cetus Corp., Norwalk, CT., USA) 으로 95 o C에서 5분간반응시킨후, 95 o C에서 20초, 52 o C에서 40 초, 72 o C에서 30초씩 30회증폭반응시키고, 72 o C에서 5분간연장반응시켰다. 각각의 PCR 생산물을 ethidium bromide가포함된 2% agarose gel에서 40분간전기영동하여밴드를확인하였다. 증폭산물을 DNA extraction kit (SolGent) 로분리후, BigDye R Terminator Cycle Sequencing Kit (PE Applied Biosystems, Foster City, CA, USA) 와 ABI PRISM 3730xl DNA analyzer (PE Applied Biosystems) 를이용하여염기서열을분석하였다. 3. 항균제감수성검사 1) Vitek 2 자동화장비에의한항균제감수성검사혈액한천배지에서 2회계대배양된대상균집락을 Tryptic soy broth (Difco, Cockeysville, MD, USA) 에접종하여 0.5 McFarland 탁도로맞추어준비하였다. 대상균부유액을포도당비발효그람음성막대균을위한 AST N132 카드에넣고제조사의지침대로검사를수행하였다. 재료및방법 1. 균주의수집 2010년 3월부터 2011년 5월까지의기간동안대전에위치한한개의대학병원에서분리된 A. baumannii 균주중 Vitek 2 자동화장비를이용하여항균제감수성검사를한결과 gentamicin 에는내성을보였으나 amikacin 에는감수성을보인균주를대상으로하였다. 균주는객담, 혈액, 농, 각종도말및체액검체에서분리되었다. 정도관리를위해서 Escherichia coli ATCC 25922와 P. aeruginosa ATCC 27853을동시에시험하여허용범위내에있는지를확인하였다. 대상균주들은 -70 o C에서냉동보관하였다가계대배양하여사용하였다. 2. 균의동정 Vitek 2 자동화장비에서 A. baumannii 로동정된균주를대상으로 rpob 유전자분석을시행하여 A. baumannii 임을확인하였다. rpob 유전자를증폭시키기위해 Ac1055F (5'-GTGATAARA TGGCBGGTCGT-3') 및 Ac1598R (5'-CGBGCRTGCATYTTGT CRT-3') 를시발체로하여중합효소연쇄반응과염기서열분석을시행하였다 (Ko 등, 2007). DNA 추출액 (5 μl), 10 Taq buffer (2.5 μl), 10 mm dntp mix (0.5 μl), primer 각 10 pmol, 0.7 U Taq 2) 한천희석법을이용한항균제감수성검사 CLSI에서제시한한천희석법으로 amikacin 과 gentamicin에대한 MIC를측정하였다 (CLSI, 2010). 시험균주 10 4 colony forming unit을시험항균제가각각 0.5-256 μg/ml 농도로함유된 Mueller-Hinton 한천에 Steers replicator (Craft Machine, Chester, PA, USA) 로접종하였다. 37 o C 호기성환경에서 18시간배양후항균제농도에따른집락의증식양상을관찰하였다. 3) 디스크확산법및 Etest를이용한항균제감수성검사 CLSI 지침에따라 amikacin 과 gentamicin 에대한감수성을디스크확산법과 Etest로확인하였다 (CLSI, 2010). Vitek 2 자동화장비로검사하기위하여제조한균부유액을 Mueller-Hinton 한천 (Difco) 에면봉을사용하여접종한후항균제디스크 (BBL, Cockeysville, MI, USA) 및 Etest strip (AB Biodisk, Solna, Sweden) 을올려놓고 35 o C 항온기에 18시간동안배양한후제조사의지침에따라억제대의직경및대상균주의 MIC를측정하였다. 결과 1. 균의동정 Vitek 2 자동화장비에서 A. baumannii로동정되고 gentamicin

Korean J Clin Lab Sci. Vol. 45, No. 1, Mar. 2013 23 에내성그리고 amikacin에감수성을보인 63균주를대상으로 rpob 유전자의염기서열을분석한결과 40주가 A. baumannii로확인되었다. 2. 항균제감수성검사법간의비교 1) Amikacin에대한항균제감수성검사결과 Vitek 2 자동화장비에의한항균제감수성검사결과 40균주모두 amikacin 에대해감수성인것으로나타났으며 MIC가 4 μg/ml 인균주가 34주로가장많았다 (Table 1). 그러나이들 40균주는한 천희석법, Etest 및디스크확산법에서모두내성으로판정되었다. 대상균주모두한천희석법에서는 MIC가 512 μg/ml 이상이었으며, Etest에서는 MIC가 256 μg/ml 이상인것으로확인되었다. 디스크확산법결과 40균주중한균주를제외한 39균주가 7 mm 이하의억제대를보였으며나머지한균주도 10 mm의억제대를나타내모두내성으로판정되었다. 2) Gentamicin에대한항균제감수성검사결과 Gentamicin 에대한항균제감수성검사결과는 Vitek 2 자동화 Table 1. Comparison of four antibiotic susceptibility testing method for amikacin susceptibility testing of 40 gentamicin resistant A. baumannii isolates Isolates Category Etest (MIC, μg/ml) Vitek 2 (MIC, μg/ml) Disk diffusion (mm) Agar dilution (MIC, μg/ml) 08-4 R ( 256) S (4) R ( 6) R ( 512) 08-14 R ( 256) S (4) R ( 6) R ( 512) 08-15 R ( 256) S (4) R ( 6) R ( 512) 08-16 R ( 256) S (4) R ( 6) R ( 512) 08-20 R ( 256) S (4) R ( 6) R ( 512) 08-22 R ( 256) S (4) R ( 6) R ( 512) 08-23 R ( 256) S (4) R ( 6) R ( 512) 09-1 R ( 256) S (4) R ( 6) R ( 512) 09-2 R ( 256) S (4) R ( 6) R ( 512) 09-3 R ( 256) S (4) R ( 6) R ( 512) 09-4 R ( 256) S (4) R ( 6) R ( 512) 09-6 R ( 256) S (4) R ( 6) R ( 512) 09-7 R ( 256) S (4) R ( 6) R ( 512) 09-11 R ( 256) S (4) R ( 6) R ( 512) 09-13 R ( 256) S ( 2) R ( 6) R ( 512) 09-14 R ( 256) S (8) R ( 6) R ( 512) 09-16 R ( 256) S (4) R ( 6) R ( 512) 09-17 R ( 256) S (4) R ( 6) R ( 512) 09-18 R ( 256) S (4) R ( 6) R ( 512) 09-21 R ( 256) S (4) R ( 6) R ( 512) 09-25 R ( 256) S (4) R ( 6) R ( 512) 09-26 R ( 256) S (4) R ( 6) R ( 512) 09-29 R ( 256) S ( 2) R ( 6) R ( 512) 09-30 R ( 256) S (8) R ( 6) R ( 512) 09-32 R ( 256) S (4) R ( 6) R ( 512) 09-33 R ( 256) S (4) R ( 6) R ( 512) 10-1 R ( 256) S (4) R (7) R ( 512) 10-2 R ( 256) S (8) R (10) R ( 512) 10-3 R ( 256) S (4) R ( 6) R ( 512) 10-4 R ( 256) S (4) R ( 6) R ( 512) 10-5 R ( 256) S (8) R ( 6) R ( 512) 10-6 R ( 256) S (4) R ( 6) R ( 512) 10-7 R ( 256) S (4) R ( 6) R ( 512) 10-8 R ( 256) S (4) R ( 6) R ( 512) 10-12 R ( 256) S (4) R ( 6) R ( 512) 10-13 R ( 256) S (4) R ( 6) R ( 512) 11-4 R ( 256) S (4) R ( 6) R ( 512) 11-16 R ( 256) S (4) R ( 6) R ( 512) 11-21 R ( 256) S (4) R ( 6) R ( 512) 11-22 R ( 256) S (4) R ( 6) R ( 512)

24 Ji Youn Sung, et al. Antibiotic Susceptibility Testing Errors in A. baumannii 장비, 한천희석법, Etest 및디스크확산법에서모두내성으로판정되어동일한결과를보였다. Vitek 2 자동화장비에의한항균제감수성검사결과 40균주모두가 16 μg/ml 이상의 MIC 결과를보였으며한천희석법과 Etest에서도각각 512 μg/ml 이상과 256 μg/ml이상의 MIC 결과를나타냈다. 디스크확산법결과 40균주모두가 7 mm 이하의억제대를보여모두내성으로판정되었다. 고찰항균제감수성검사는감염균의치료효과가높은항균제를선택하는데도움이되며, 주로한천희석법혹은액체배지희석법등으로시행하도록권장하고있다. 해석기준은균종의 MIC를기초로 breakpoint ( 임계점 ) 를설정하여감수성, 중간내성혹은내성으로보고하고있다. 국내에서는미국기준인 CLSI 기준을이용하여판독하고있다 (CLSI, 2010). 그러나시간이많이걸리고검사과정이복잡한한천희석법이나액체배지희석법을이용하여항균제감수성검사를하기는쉽지않다. 국내에서도인건비등의이유로자동화장비만으로항균제감수성검사를실시하는병원이많을것으로보고있다. 따라서보편적으로사용되고있는자동화장비의 MIC 결과와다른항균제감수성검사법을통해얻은 MIC 결과의일치율을비교분석하여자동화장비의신뢰도를파악하는것은매우중요할것으로사료된다. 본연구에서는 Vitek 2 자동화장비에서검출된 gentamicin 내성이면서 amikacin 감수성인 A. baumannii 를대상으로 amikacin 에대한 MIC를한천희석법, Etest 및디스크확산법으로측정하여그결과를비교하였다. 자동화장비인 Vitek 2 자동화장비에서 amikacin 감수성으로판정되었던 A. baumannii 40균주모두한천희석법과 Etest에서각각 512 μg/ml와 256 μg/ml 이상의 MIC 값을보였다. 디스크확산법에서도모두내성으로판정되었다. 이렇게내성균주를감수성으로보고하는것을 very major error (VME) 라고하는데임상미생물검사실에서는절대로범해서는안될오류이다 (Woo 등, 2001). 이오류는특정항균제에내성인균주의감염증치료에임상의사가그항균제를사용하는결과를유발할수있으며, 이는감염증치료의실패와직결되므로특히주의해야한다. 그럼에도불구하고본연구에서는대상균주모두가 VME를나타냈다. Vitek 2 자동화장비결과의신빙성에문제가발생된것은여러문헌에서도밝혀진바있으며특히 amikacin의경우 Vitek 2 자동화장비의결과가다른항균제감수성검사방법에의한결과보다높은감수성률을보여신뢰하기어렵다는보고들이있어왔다 (Park 등, 2009). 본연구에서는이전의연구결과보다 VME의검출율이월등하게높았는데이는균주를선별하는과정에서 gentamicin 에내성인균주를대상으로하였기때문으로사료된다. 이는 gentamicin에대한항균제감수성검사결과가 amikacin에대한항균제감수성검사결과를판정하는데중요한인자로작용할수있음을시사한다. 따라서 A. baumannii를 Vitek 2 자동화장비로항균제감수성검사를했을때 aminoglycoside 계열의항균제인 getamicin에내성을보이면서 amikacin 에감수성을보인다면이는 VME를의심해보아야한다. 그리고반드시다른항균제감수성검사법으로 MIC 결과를확인하고보고해야할것이다. 본연구에서는보편적으로사용하고있는 Vitek 2 자동화장비의 amikacin에대한 MIC 결과와다른항균제감수성검사법을통해얻은 amikacin에대한 MIC 결과의일치율을비교분석하였다. Vitek 2 자동화장비로항균제감수성검사를시행했을때 gentamicin 내성이면서 amikacin 감수성인 A. baumannii 균주는한천희석법으로다시한번항균제의 MIC를확인하여보고해야할것이다. 그러나한천희석법이복잡하고시간이많이걸려시행하기가어렵다면, 한천희석법의감수성결과와높은일치도를보여주고, 검사방법이간편한디스크확산법이유용하게사용될수있다고사료된다. 참고문헌 Bergogne-Berezin E, Towner KJ. Acinetobacter spp. as nosocomial pathogens: microbiological, clinical, and epidemiological features. Clin Microbiol Rev. 1996, 9:148-165. CLSI. Performance standards for antimicrobial susceptibility testing; sixteenth informational supplement. CLSI document M100-S20. 2010, p52-53. Clinical and Laboratory Standards Institute, Wayne, Pennsylvania. D'Agata EM. Rapidly rising prevalence of nosocomial multidrug-resistant, Gram-negative bacilli: a 9-year surveillance study. Infect Control Hosp Epidemiol. 2004, 25:842-846. Fiebelkorn KR, Crawford SA, McElmeel ML, Jorgensen JH. Practical disk diffusion method for detection of inducible clindamycin resistance in Staphylococcus aureus and coagulase-negative staphylococci. J Clin Microbiol. 2003, 41:4740-4744. Foxman B. Epidemiology of urinary tract infections: incidence, morbidity, and economic costs. Am J Med. 2002, 113:5-13. Hsieh WS, Sung LL, Tsai KC, Ho HT. Evaluation of the VITEK 2 cards for identification and antimicrobial susceptibility testing of non-glucose-fermenting Gram-negative bacilli. APMIS. 2009, 117:241-247. Kim SJ, Lee JS. Antibiotic resistance patterns of Acinetobacter baumannii and Pseudomonas aeruginosa from a hospital in Daegu city area. Korean J Clin Lab Sci. 2008, 40:75-79. Ko KS, Suh JY, Kwon KT, Jung SI, Park KH, Kang CI, et al. High rates of resistance to colistin and polymyxin B in subgroups of Acinetobacter baumannii isolates from Korea. J Antimicrob Chemother. 2007, 60:1163-1167.

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