동의생리병리학회지제 22 권 5 호 Korean J. Oriental Physiology & Pathology 22(5):1276 1282, 2008 溫膽湯合聰明湯과導痰湯合聰明湯의 microglia 보호, 항산화및 acetylcholinesterase 억제효과 정명희 정인철 * 대전대학교한의과대학신경정신과학교실 Effects of OnDam-TanghapChongMyoung-Tang and DoDam-TanghapChongMyoung-Tang on Protecting Microglia and Inhibiting Acetylcholinesterase and Oxidants Myong Hee Cheong, In Chul Jung* Department of Oriental Neuropsychiatry, College of Oriental Medicine, Daejeon University This experiment was designed to investigate the effect of the ODTCMT and DDTCMT extract on protecting microglia and inhibiting acetylcholinesterase and oxidants. The effects of the ODTCMT and DDTCMT extract on cell death of BV2 microglial cell line treated by IFN-γ ; expression of NO, ROS in BV2 microglial cell line treated by lipopolysaccharide (LPS) ; AChE activity in PC-12 cell treated by NGF were investigated, respectively. The ODTCMT and DDTCMT extract significantly increased cell viability in BV2 microglial cell line treated with IFN-γ. The ODTCMT and DDTCMT extract suppressed the NO and ROS production in BV2 microglial cell line treated by LPS. The ODTCMT and DDTCMT extract groups also showed inhibition of AChE activity in PC-12 cell line. According to the above result, it is suggested that the ODTCMT and DDTCMT extract might be usefully applied for prevention and treatment of Alzheimer's disease. OnDam-TanghapChongMyoung-Tang (ODTCMT), DoDam-TanghapChongMyoung-Tang (DDTCMT), Microglia, acetylcholinesterase, ROS Key words : Eight Principle Pattern Identification, Sasang typology, Greater-Lesser-Yin-Yang 서론 치매는뇌의만성적진행성변성질환에의해흔히기억장애및기타지적기능의상실이일어나는임상증후군으로, 원인질환중알츠하이머병 (Alzheimer's disease; AD) 이가장흔하여전체원인질환의약 50 60% 를차지하고있다 1,2). AD는신경세포소실에따른전반적인뇌위축과노인반 (senile plaques), 신경섬유다발 (nurofibrillary tangle) 등의특징적인병리조직학적소견을보이며 3), 증상으로기억, 언어, 시 공간파악능력, 실행능력및판단력등인지능력의퇴화와망상, 의심, 환각, 우울증및인격의변화등행동장애가나타난다 4). 한의학에서痴呆는 景岳全書 5) 에서 癡獃 로, 石室秘錄 6), * 교신저자 : 정인철, 대전시동구용운동 96-3 대전대학교한의과대학 E-mail : npjeong@dju.ac.kr, Tel : 043-229-3727 접수 : 2008/08/21 수정 : 2008/09/11 채택 : 2008/09/22 辨證奇門 7) 에 呆病 으로언급되어왔고대표적인病機는肝腎不足, 氣血虧虛, 痰濁阻竅, 氣滯血瘀등이다 1). 聰明湯은 東醫寶鑑 內景篇 8) 에 治多忘, 久服能日誦千言 이라하여健忘을치료하는데사용한다고기술된이래, 健忘및痴呆등의병증에활용되고있다 9). 溫膽湯은孫 10) 의 千金要方 에처음으로收錄된處方으로, 二陳湯에行氣消積하는枳實 11) 과, 淸熱, 化痰, 止嘔하는竹茹 11) 를加味한것으로, 心膽虛怯으로인해痰熱이上搖하여發生 12) 하는觸事而驚 12,13), 夢寐不祥 12,14) 10,14), 虛煩不得眠등의症狀에使用된다. 實用中醫腦病學 15) 에서는痰濁壅盛阻蔽腦竅型의腦萎縮에서나타나는 神精淡漠呆滯 健忘 甚至完全痴呆 에溫膽湯을活用하고있다. 또한導痰湯은宋代嚴 16) 의濟生方에 5,17,18) 처음수록된處方으로中風과一切의痰飮을치료하는處方 으로기록되어왔으며痰濁이心竅를막아버린痰迷心竅의증상인神志錯亂, 意識不明, 神呆目滯, 昏倒於地등에도사용한다 19). - 1276 -
溫膽湯合聰明湯과導痰湯合聰明湯의 microglia 보호, 항산화및 acetylcholinesterase 억제효과 최근聰明湯및여러가지聰明湯加味方의痴呆치료와예방에관한연구 20-23) 가진행되고있고溫膽湯의항산화작용에대한연구결과 24) 가發表된바있다. 그러나溫膽湯및導痰湯과聰明湯을合方한處方들의痴呆와관련된實驗的硏究는아직접하지못하였다. 이에저자는상기처방들이 AD의병리에서중요한 acetylcholinestrate (AChE) 나 oxidants의증가등에도일정한효과가있을수있다고판단하여溫膽湯合聰明湯과導痰湯合聰明湯이 AD 병태모델에대한세포보호, 항산화및 AChE 억제효과를실험적으로규명하고자각처방추출물을시료로 BV2 microglial cell line에서세포생존율, nitric oxide (NO), reactive oxygen species (ROS) 의생성을관찰하고 PC12 cell line에서의 AChE의생성을측정하여유의한결과를얻었기에보고하는바이다. 실험 1. 재료 1) 시약및기기본연구에사용된시약은 AChE assay kit (EQM Research, USA), Dulbecco's phosphate buffered saline (D-PBS), penicillin, streptomycin, DNase typeⅠ ( 이상 Sigma, USA), Taq. polymerase, Deoxynucleotide triphosphate(takara, Japan), Dulbecco's Modified Eagle Medium (DMEM), Fetal bovine serum(fbs, Hyclone, USA), collagenase A (BM, USA), Agarose (FMC, USA) 등이고, 그외시약들은특급및일급을사용하였다. 본연구에사용된기기는 rotary vaccum evaporator (Büchi, B-480, Switzerland), freeze dryer (EYELA FDU-540, Japan), centrifuge (sigma, USA), bio-freezer (sanyo, Japan), Primus 96 thermocycler system (MWG Biotech., Germany), plate shaker (Lab-Line, USA), ice-maker ( 비전과학, Korea), ELISA reader (molecular devices, USA), homogenizer (OMNI, USA), VIDEOTRACK (Animal and human being behaviour analysis system, Viewpoint, France), phage contrast microscopy (Nikon, Japan), flow cytometer (Becton Dickinson, Co., USA) 등이다. 2) 세포 BV2 microglial cell line은 Tong H. Joh (Burke Institute, Cornell University, USA) 으로부터공급받아 37, 5 % CO 2 상태의배양기에서 10 % FBS DMEM으로배양하여사용하였고, PC-12 cell line은 rat의 adrenal pheochromocytoma로 DMEM에 10 % horse serum과 5 % FBS, penicillin(100 U/ ml ), streptomycin (100 μg / ml ), gentamycin (10 μg / ml ) 의이함유된배양액을넣고배양시켰다. 3) 약재溫膽湯合聰明湯 (OnDam-TanghapChongMyoung-Tang, ODTCMT) 과導痰湯合聰明湯 (DoDam-TanghapChongMyoung-Tang, DDTCMT) 은처방구성은 東醫寶鑑 8) 을기준으로하였고, 사용한약제는대전대학교부속대전한방병원에서구입한후정선하여사용하였다. 처방 1첩의내용과용량은다음과같다. Table 1. Prescription of OnDam-TanghapChongMyoung-Tang (ODTCMT) Herb Scientific Name Dose(g) 半 夏 Pinelliae ternata Breitenbach 8 陳 皮 Citrus unshiu L. 8 白茯笭 Poria cocos Walf 8 枳 實 Poncirus trifoliata Refinesque 8 竹 茹 Phyllostachys nigra var.henonis 4 白茯神 Poria cocos Walf 4 遠 志 Polygala tenuifolia 4 石菖蒲 Acori Gramineus Soland 4 甘 草 Glycyrrhiza uralensis Fisch. 2 Total amount 50 Table 2. Prescription of DoDam-TanghapChongMyoung-Tang (DDTCMT) Herb Scientific Name Dose(g) 半 夏 Pinelliae ternata Breitenbach 8 南 星 Arisaema amurense var. serratum 4 橘 紅 Citrus unshiu Markovich 4 枳 殼 Citrus aurantum L. 4 赤茯苓 Poria cocos Walf 4 甘 草 Glycyrrhiza uralensis Fisch. 4 白茯神 Poria cocos Walf 4 遠 志 Polygala tenuifolia 4 石菖蒲 Acori Gramineus Soland 4 Total amount 40 4) 검액의조제 溫膽湯合聰明湯 1첩분량 (50 g), 導痰湯合聰明湯 1첩분량 (40 g) 에각각증류수 1,300 ml을가하여열탕추출기에서 3시간추출하여얻은액을흡입여과하여이를감압증류장치로농축하고, 이를다시동결건조기를이용하여완전건조하여얻은溫膽湯合聰明湯추출물 (7.25 g), 導痰湯合聰明湯추출물 (5.25 g) 을냉동 (-84 ) 보관하면서실험에필요한농도로희석하여사용하였다. 2. 방법 1) 세포독성측정 (1) 세포배양 mlfc는 BALB/c 생쥐의정상폐조직을작은조각으로절단한후 conical tube (15 ml ) 에넣어 1,400 rpm에서 5 분간원심분리하여수세하였다. Tube에 DMEM를넣고 37 CO 2 배양기에서 2 시간동안배양하였다. 0.5 % trypsin-0.2 % EDTA를첨가한후 30 분간계속배양후 PBS로 2 회수세하고 DMEM-1 0% FBS에 1 주일동안배양하였다. (2) 세포독성및세포생존율측정 세포독성측정방법은 SRB assay법을약간변형하여실험에사용하였다. mlfc 세포는 37, 5 % CO 2 배양기에서자란것을 Trysin-EDTA 용액으로단일세포들이되도록떼어내고, 2.0 10 4 개의세포를 96 wells plate에분주하고배양기 (37, 5 % CO 2) 에서 2시간배양한후溫膽湯合聰明湯과導痰湯合聰明湯추출물 ( 최종농도 200, 100, 50, 10, 1 μg / ml ) 을각각 48시간동안처리하였다. BV2 microglial cell (1 10 5 cells/24 wells plate) 에 IFN-γ (20 U/ ml ) 과, 溫膽湯合聰明湯과導痰湯合聰明湯추출물 (100, 50, 10 μg / ml ) 을각각처리하고 48 시간동안동시배양하였다. 배양 - 1277 -
정명희 정인철 종료후에배양액을버리고 PBS로 2 회세척하였다. 각 well에 50 % TCA 50 μl를가하고 1 시간동안 4 에방치한후증류수로 5 회세척한다음 well plate를공기중에서건조하였다. SRB (0.4 % SRB/1 % acetic acid) 용액을 100 μl /well로가하고실온에서 30 분간염색하였고 0.1 % acetic acid 용액으로약 4~5 회세척한다음공기중에서건조하고 10 mm Tris Base로용해시켰다. 이 plate를 plate shaker에서 3.5 speed로 5 분간 shaking하고 ELISA reader로 540 nm에서흡광도를측정하여세포생존율을계산하였다. (3) BV2 microglial cell의형태학적인변화측정 BV2 microglial cell 의형태학적인변화는 BV2 microglial cell (1 10 5 cells/24 wells plate) 에 IFN-γ (20 U/ ml ) 과, 溫膽湯合聰明湯, 導痰湯合聰明湯추출물 (100 μg / ml, 50 μg / ml ) 을각각처리하여, 48시간동안배양하여위상차현미경으로관찰하였다. 3) BV2 microglial cell 배양액내 NO 생성량측정 BV2 microglial cell을 96 wells plate에 2 10 4 cells로분주하였다. 여기에溫膽湯合聰明湯과導痰湯合聰明湯추출물 (100, 50, 10 μg / ml ) 을처리하고 1 시간후 LPS (0.1 μg / ml ) 를각각의 well 에첨가하여 48 시간배양하였다. 배양종료후배양액을 2,000 rpm에서 5 분간원심분리하여상층액을회수한후여기에 Griess 시약용액 A (0.2 % naphthylethylene diamine dihydrochloride in D.W.) 와용액 B (2 % sulfonylamide in 5 % H3PO4) 를 1:1로혼합하여처리하였다. 다시배양상층액 100 μl를 96 wells plate에분주하고혼합용액 100 μl를처리한후 ELISA reader를사용하여 540 nm에서흡광도를측정하였다. 4) BV2 microglial cell 내 ROS의분석 BV2 microglial cell 내 ROS를측정하기위하여 24 wells plate 의각 well에 5 10 5 cells씩첨가하고, 溫膽湯合聰明湯과導痰湯合聰明湯추출물 (100, 50 μg / ml ) 을처리하고 1시간후 LPS (1 μg / ml ) 를처리한후 37 에서 48 시간배양하였다. 배양종료후 DCFH-DA 50 μm을처리하고 5 분간배양하고 2 회수세한후 flow cytometer 로세포내형광 ROS를측정하였다. 이때 Cyclosporine A를처리한군을만들어양성대조군으로사용하였다. 5) PC12 cell 에서 AChE activity 측정 PC-12 cell에溫膽湯合聰明湯과導痰湯合聰明湯추출물 (100, 50, 10 μg / ml ) 과 NGF를처리하여 24 시간배양한후 50 μl의 cell lysate lysis buffer {Tris-HCl (200 mm; ph 8.0), 200 mm NaCl, 0.5% (v/v) Nonidet P-40, 0.1 mm EGTA, 1 mm PMSF, 0.1 mm DTT, 10 μg / ml leupetin} 을혼합하여얼음에서 30 분간반응하였다. 그리고 5 분간원심분리하여 cell lysate를얻었다. Cell lysate를 labeling한후 sodium chloride solution 0.2 ml과혼합하였고각 tube에 3.0 ml water, nitrophenol solution 2 ml, acetylcholine chloride solution 0.2 ml을첨가하였다. 다시 5 분후 acetylcholine chloride solution을첨가하고시간을정확히기록하여 25 water bath에서 30 분간배양시킨후 ELISA reader로 420 nm에서흡광도를측정하였다. 3. 통계분석 실험에서얻은결과는 mean±standard deviation으로기록하였다. 각항목의유의성은일원배치분산분석 (ANOVA test) 로평가하였고, p<0.05 수준에서 Duncan's method로사후검정하였다. 성 적 1. 溫膽湯合聰明湯과導痰湯合聰明湯추출물의세포독성 mlfc의생존율은溫膽湯合聰明湯 1, 10, 50, 100, 200 μg / ml실험군에서각각 103.2±4.8, 98.0±1.2, 96.1±1.3, 89.6±0.5, 86.9±1.6, 導痰湯合聰明湯 1, 10, 50, 100, 200 μg / ml실험군에서각각 97.8±0.8, 94.8±1.2, 90.6±1.4, 84.8±1.7, 75.8±2.5 (%) 로導痰湯合聰明湯 200 μg / ml이외에는모두에서 80% 이상의생존율을나타냈다 (Fig. 1). Fig. 1. Cytotoxicity of ODTCMT & DDTCMT extract on mlfcs. mlfcs were treated with various concentrations of ODTCMT & DDTCMT extract. The results are expressed the mean±s.d. 2. BV2 microglial cell line의세포생존율과형태학적변화 BV2 microglial cell line에서생존율을측정한결과, 대조군은 20.5±2.5, 溫膽湯合聰明湯 100, 50, 10 μg / ml실험군은 97.3±0.7, 85.5±1.7, 70.3±7.8이었고, 導痰湯合聰明湯 100, 50, 10 μg / ml실험군은 95.8±1.5, 85.5±3.0, 64.1±2.1 (%) 로나타나대조군에비해溫膽湯合聰明湯과導痰湯合聰明湯실험군모두농도의존적으로유의성있는생존율의상승을보였고같은농도에서처방간생존율의유의한차이는없었다 (Fig. 2). Fig. 2. The effect of ODTCMT & DDTCMT extract on cell viability in IFN-γ-treated BV2 microglial cell line. A,B,C,D,E : Statistical difference between groups were tested by oneway ANOVA and Duncan's method is used for multiple comparisons. The different character indicates that a statistical difference is found under a significance level less than 0.05. - 1278 -
溫膽湯合聰明湯과導痰湯合聰明湯의 microglia 보호, 항산화및 acetylcholinesterase 억제효과 BV2 microglial cell line에 IFN-γ를처리하고 48 시간경과후대조군은정상군에비하여세포의사멸과형태의변화를나타낸것에비해溫膽湯合聰明湯과導痰湯合聰明湯실험군은세포의형태학적구조가비교적양호하게유지되었음을볼수있다 (Fig. 3). 5. PC-12 cell line에서 AChE activity 억제효과 PC-12 cell line에서 AChE activity를측정한결과, 정상군은 6.4±1.7, 대조군은 46.2±2.4, 溫膽湯合聰明湯 100, 50, 10 μg / ml실험군은각각 22.9±5.6, 31.4±4.4, 33.0±10.3, 導痰湯合聰明湯 100, 50, 10 μg / ml실험군은각각 16.0±6.2, 26.4±11.1, 33.0±4.7 (nm/mg/min) 로나타나溫膽湯合聰明湯과導痰湯合聰明湯실험군모두농도의존적으로유의성있는감소를보였고같은농도의처방간유의한차이는없었다 (Fig. 6). Fig. 3. The effect of ODTCMT & DDTCMT extract on cell morphology in IFN-γ-treated BV2 microglial cell line. A: Normal B: Control C: 100 μg / ml ODTCMT D: 500 μg / ml ODTCMT E: 100 μg / ml DDTCMT F: 50 μg / ml DDTCMT Cell morphology was observed using phase contrast microscopy. 3. BV2 microglial cell line 배양상층액에서 NO 생성량에미치는영향 BV2 microglial cell line의배양상층액에서 NO 생성량은정상군은 19.6±4.5, 대조군은 466.3±56.0, 溫膽湯合聰明湯 100, 50, 10 μg / ml실험군은각각 56.7±26.0, 125.5±41.9, 307.2±97.7, 導痰湯合聰明湯 100, 50, 10 μg / ml실험군은각각 70.4±30.7, 111.6±34.7, 247.0±63.9 (mm) 로나타나溫膽湯合聰明湯과導痰湯合聰明湯실험군모두농도의존적으로유의성있는감소를보였고같은농도의처방간유의한차이는없었다 (Fig. 4). BV2 Fig. 5. Inhibitory effect of ODTCMT & DDTCMT extract on the ROS production in BV2 microglial cell line. Fig. 6. Inhibitory effect of ODTCMT & DDTCMT extract on AChE activity in PC12 cell line. A,B,C,D : Statistical difference between groups were tested by oneway ANOVA and Duncan's method is used for multiple comparisons. The different character indicates that a statistical difference is found under a significance level less than 0.05. 고 찰 Fig. 4. Inhibitory effect of ODTCMT & DDTCMT extract on the NO production BV2 microglial cell line. A,B,C,D,E,F : Statistical difference between groups were tested by oneway ANOVA and Duncan's method is used for multiple comparisons. The different character indicates that a statistical difference is found under a significance level less than 0.05. 4. BV2 microglial cell 배양상층액에서 ROS 생성에미치는영향 Microglial cell의 ROS 생성을관찰한결과, 대조군에서비해溫膽湯合聰明湯과導痰湯合聰明湯실험군에서는농도의존적으로 ROS의생산이억제되었다 (Fig. 5). 치매란만성또는진행성뇌질환에의해서발병되며기억, 사고, 지남력, 이해, 계산, 학습, 언어, 판단등다수의고위대뇌기능장애로이루어진증후군으로성격변화, 불면, 행동장애등의증상도동반된다. 치매의임상유형중 AD가 50% 이상을, vascular dementia (VD) 가 20% 정도를차지하고있는데, 그중 AD는증상이서서히나타나고경과는점진적으로진행되며, 초기부터뚜렷한기명장애, 기억장애, 방향상실을보인다. 1,2). AD 유발에는 microglial cell과 astrocyte에서분비되는 IL-1 β, IL-6, TNF-α 등의 proinflammatory cytokine 25), AChE 26), free radicals 27), Aβ 28) 등의많은인자가관여하는것으로알려져있다. AD의주증상인기억력저하는 choline성신경계와밀접한 - 1279 -
정명희 정인철 관계가있는데 29), 특히 acetylcholine을생성하는세포의퇴행과 acetylcholine 분해효소인 AChE의증가로인해심화된다고한다 30). 비록원인요법은아니지만감퇴된 choline성신경계를보충해주고개선해줄수있는 galanthamine 31) 과같은 AChE의억제제가현재까지는가장효과적인 AD의치료제로사용되고있다 32). 또한신경세포의산화적손상은 AD를유발하는주요한원인이되는데, 이러한산화적손상을유발하는대표적인물질로 NO와 ROS가있다. NO는필요이상으로생성되면 shock에의한혈관확장, 염증반응으로유발되는조직손상, 신경조직의손상등을일으켜생체에유해한작용을나타내는것으로보고되었다 33). ROS는세포막의지질, 조직단백질또는효소, DNA에산화를유발시켜세포막의손상, 단백질의변형, DNA의손상을유발한다. 이들산화적손상은노화와파킨슨병, AD 등의퇴행성신경질환을포함하여다양한질병을유발한다 34). 韓醫學的으로痴呆는 呆病 5,6) 35,36), 健忘등의범주와유사하며, 景岳全書 癲狂痴獃 5) 에는痴呆와유사한개념으로 痴獃 가언급되었는데, 痴獃症,... 言辭顚倒, 擧動不經, 或多汗, 或善愁, 其症則千奇萬怪, 無所不至, 脈必或弦或數, 或大或小, 變易不常... 이라하였다. 痴呆의病因은年老體虛, 情志失調, 飮食失調, 中毒外傷, 痰濁등이고辨證類型은精氣不足, 脾腎虧虛, 痰濁阻竅, 氣滯血瘀, 熱毒熾盛, 氣血虛弱등이며, 補益精氣, 補腎健脾, 割痰化濁, 開竅醒神, 行氣活血, 通竅醒腦, 淸熱解毒, 益氣養血, 健腦益腎등의治法을응용하고있다 1). 溫膽湯은孫의 千金要方 에처음으로收錄된處方으로 治大病後虛煩不得眠, 此膽寒故也. 宜服溫膽湯方 이라하여和胃, 消積, 淸熱, 安神하는效能 15) 으로心膽虛怯 10,12-14), 觸事而驚 12,13), 夢寐不祥 13) 10,12,13), 虛煩不得眠등의症狀에使用하며, 燥濕化痰, 利氣和中하는效能이있어惡心嘔吐, 頭眩心悸, 舌苔白潤, 脈滑한症狀을治療하는二陳湯 12) 에行氣消積하는枳實 11) 과, 淸熱, 化痰, 止嘔하는竹茹 11) 를加味한處方이다 12). 특히 實用中醫腦病學 15) 에서는痰濁壅盛阻蔽腦竅型의腦萎縮에서나타나는 神精淡漠呆滯 不言不語 健忘 善怒無常, 欲哭欲笑, 妄聞妄見 漸至理解, 判斷, 記憶, 計算, 定向等知能全面減退 出現失語甚至完全痴呆 舌苔白膩, 脈滑. 에開鬱除痰, 化濁醒神의治法으로溫膽湯을活用하고있다. 또한導痰湯은宋代嚴 16) 의濟生方에 一切痰厥, 頭目旋暈, 痰飮留積不散, 胸膈痞塞, 脇肋脹滿, 頭痛吐逆, 喘急痰嗽, 坐臥不安, 飮食不思 라처음수록되었고明代薜 37) 은 痰涎壅盛, 胸膈痞塞, 或咳嗽惡心, 飮食少思를다스린다 라고한것을비롯해歷代의서에中風과一切의痰飮을치료하는處方 5,17,18) 으로기록되어왔다. 導痰湯은二陳湯에南星과枳殼을加味한處方으로薑半夏, 牛膽南星, 枳殼, 赤茯苓, 陳皮, 甘草, 生薑으로구성되어있고, 健脾化痰, 除濕養心, 行氣豁痰 14,38-41) 하는效能을갖고있기때문에痰涎壅盛할때나痰飮語澁하고頭目眩暈하며혹은胸膈留飮하여痰飮不通者에게先用하며 42), 痰濁이心竅를막아버린痰迷心竅의증상인神志錯亂, 意識不明, 神呆目滯, 昏倒於地등에도사용한다 19). 따라서痴呆의증상개선에溫膽湯, 導痰湯등이응용될수있을것으로사료되어溫膽湯및導痰湯에健忘의代表的處方인聰明湯을合方한溫膽湯合聰明湯과導痰湯合聰明湯을본실험약물로선택하여본硏究를시행하였다. 이에저자는溫膽湯合聰明湯과導痰湯合聰明湯이 BV2 microglial cell line에대한세포보호, 항산화및 AChE 억제효과를실험적으로규명하고자각처방추출물을시료로 BV2 microglial cell line에서세포생존율, ROS의생성과배양상층액에서 NO를관찰하고 PC12 cell line 에서의 AChE의생성을측정하였다. 먼저, mlfc의생존율은溫膽湯合聰明湯 1, 10, 50, 100, 200 μg / ml실험군에서각각 103.2±4.8, 98.0±1.2, 96.1±1.3, 89.6±0.5, 86.9±1.6, 導痰湯合聰明湯 1, 10, 50, 100, 200 μg / ml실험군에서각각 97.8±0.8, 94.8±1.2, 90.6±1.4, 84.8±1.7, 75.8±2.5 (%) 로導痰湯合聰明湯 200 μg / ml이외에는모두에서 80% 이상의생존율을나타내 (Fig. 1), 이후실험에서두약물모두 100 μg / ml이하의농도를사용하였다. IFN-γ는식세포작용의활성화와염증반응의조절 cytokine 으로 βa 축적에관여하고 microglial cell에서 NO, inos을유도한다고알려져있다 43,44). IFN-γ를처리한 BV2 microglial cell line에서생존율을측정한결과, 대조군은 20.5±2.5, 溫膽湯合聰明湯 100, 50, 10 μg / ml실험군은 97.3±0.7, 85.5±1.7, 70.3±7.8이었고, 導痰湯合聰明湯 100, 50, 10 μg / ml실험군은 95.8±1.5, 85.5±3.0, 64.1±2.1 (%) 로나타나대조군에비해溫膽湯合聰明湯과導痰湯合聰明湯실험군모두농도의존적으로유의성있는생존율의상승을보였고같은농도에서처방간생존율의유의한차이는없었다 (Fig. 2). BV2 microglial cell line에 IFN-γ를처리하고 48 시간경과후대조군은정상군에비하여세포의사멸과형태의변화를나타낸것에비해溫膽湯合聰明湯과導痰湯合聰明湯실험군은세포의형태학적구조가비교적양호하게유지되었음을볼수있다 (Fig. 3). 이러한결과로溫膽湯合聰明湯과導痰湯合聰明湯은상기의농도에서 IFN-γ로인해나타나는세포사멸을억제하는효과가있다고할수있다. BV2 microglial cell line의배양상층액에서 NO생성량을관찰한결과, 정상군은 19.6±4.5, 대조군은 466.3±56.0, 溫膽湯合聰明湯 100, 50, 10 μg / ml실험군은각각 56.7±26.0, 125.5±41.9, 307.2±97.7, 導痰湯合聰明湯 100, 50, 10 μg / ml실험군은각각 70.4±30.7, 111.6±34.7, 247.0±63.9 (mm) 로나타나溫膽湯合聰明湯과導痰湯合聰明湯실험군모두농도의존적으로유의성있는감소를보였고같은농도의처방간유의한차이는없었다 (Fig. 4). 또한 BV2 microglial cell에서 ROS 생성을관찰한결과, 대조군에서비해溫膽湯合聰明湯과導痰湯合聰明湯실험군에서는농도의존적으로 ROS의생산이억제되었다 (Fig. 5). 이결과로溫膽湯合聰明湯과導痰湯合聰明湯은산화적손상을유발하는 NO, ROS의생성을억제함으로써 AD의예방에활용될수있음을알수있다. 또한 PC-12 cell line에서 AChE activity를측정한결과, 정 - 1280 -
溫膽湯合聰明湯과導痰湯合聰明湯의 microglia 보호, 항산화및 acetylcholinesterase 억제효과 상군은 6.4±1.7, 대조군은 46.2±2.4, 溫膽湯合聰明湯 100, 50, 10 μg / ml실험군은각각 22.9±5.6, 31.4±4.4, 33.0±10.3, 導痰湯合聰明湯 100, 50, 10 μg / ml실험군은각각 16.0±6.2, 26.4±11.1, 33.0±4.7 (nm/mg/min) 로나타나溫膽湯合聰明湯과導痰湯合聰明湯실험군모두농도의존적으로유의성있는감소를보였고같은농도의처방간유의한차이는없었다 (Fig. 6). 따라서溫膽湯合聰明湯과導痰湯合聰明湯의투여가 AChE activity를억제함으로써 acetylcholine을증가시켜기억력의개선에도움을줄것으로기대된다. 이상의내용을총괄해보면溫膽湯合聰明湯과導痰湯合聰明湯은 IFN-γ를처리한 BV2 microglial cell line에서세포생존율을농도의존적으로유의하게상승시켰고 BV2 microglial cell line의배양상층액에서 NO와 ROS의생성을억제하였으며 PC-12 cell line에서 AChE activity를억제하였다. 그러나각실험항목에서처방간유의한효과의차이는없었다. 결과적으로溫膽湯合聰明湯과導痰湯合聰明湯은산화적스트레스와 choline성신경세포의퇴화에의한기억력저하에대한치료제로활용될수있을것으로판단되며, 향후본처방의기전탐구와임상연구가이루어져야할것으로사료된다. 결론 溫膽湯合聰明湯과導痰湯合聰明湯추출물의 AD 병태모델에대한세포보호, 항산화및 AChE 억제효과를실험적으로연구한결과, 다음과같은결론을얻었다. 溫膽湯合聰明湯과導痰湯合聰明湯은 IFN-γ를처리한 BV2 microglial cell line에서세포생존율을유의하게상승시켰고 BV2 microglial cell line의배양상층액에서 NO와 ROS의생성을억제하였으며 PC-12 cell line에서 AChE activity를억제하였다. 이상의결과로溫膽湯合聰明湯과導痰湯合聰明湯은 AD의치료에활용될수있을것으로판단된다. 참고문헌 1. 대한한방신경정신과학회편. 한방신경정신의학. 서울, 집문당, pp 311-316, 2005. 2. 조추용, 최현자역. 치매예방과케어. 서울, 창지사, p 49, 2002. 3. 이광우. 임상신경학. 서울, 고려의학, pp 203-208, 2002. 4. National Institute on Aging : National Institute on Health, Progress Report on Alzheimer's Disease, 1999. 5. 張介賓. 張氏景岳全書. 서울, 翰成社, pp 610-611, 1978. 6. 陳士鐸. 石室秘錄. 北京, 中國中醫藥出版社, p 125, 1991. 7. 錢鏡湖. 辨證奇問全書. 台北, 甘地出版社, pp 222-225, 233-235, 1990. 8. 許浚. 東醫寶鑑. 서울, 南山堂, p 116, 129, 366, 1994. 9. 李尙仁외. 漢藥臨床應用, 서울, 成輔社, pp 151-153, 308-313, 419-420, 426-428, 1990. 10. 孫思邈. 千金要方, 서울, 大星文化社, p 217, 1984. 11. 李尙仁외. 本草學. 서울, 영림사, pp 58-60, 61-63, 101-103, 137, 281-284, 303, 344-347, 348-349, 351, 354-356, 369-372, 401-403, 430-431, 440-441, 448, 459-460, 467, 541-542. 1990. 12. 李尙仁외編. 方劑學. 서울, 永林社, pp 528, 531-532, 1990. 13. 李載熙. 圖說韓方診療要方. 光州, 醫學硏究社, p 538, 1987. 14. 尹吉榮. 東醫臨床方劑學. 서울, 明寶出版社, p 99, 106, 1987. 15. 陳輝외. 實用中醫腦病學. 北京, 學苑出版社, pp 242-243, 791-797, 1993. 16. 嚴用和. 嚴氏濟生方. 北京, 人民衛生出版社, p 79, 1980. 17. 李中梓. 醫宗必讀. 臺北, 大方出版社, p 343, 1978. 18. 康命吉. 濟衆新篇. 서울, 杏林書院, p 83, 1971. 19. 金完熙, 崔達永. 臟腑辨證論治. 서울, 成輔社, pp 191-192, 1985. 20. 박지운, 정인철, 이상. 룡聰明湯과木槿皮聰明湯이 CT105와 βa로유도된 Alzheimer's Disease 病態모델에미치는영향. 동의신경정신과학회지 17(1):37-57, 2006. 21. 하수영, 정인철, 이상룡. 聰明湯과山査聰明湯이 Alzheimer's Disease 病態모델에미치는影響. 동의신경정신과학회지 17(1):59-78, 2006. 22. 최강욱, 이상룡, 정인철. 聰明湯과木槿皮聰明湯열수추출물, 초미세분말제형이 microglia 및기억력감퇴병태모델에미치는영향. 동의생리병리학회지 20(5):1200-1210, 2006. 23. 徐承浩, 鄭仁哲, 李相龍. 聰明湯和山査聰明湯熱水提取物. 超微細粉末劑型對 microglia 及記憶力減退病態模型的影響, 第 5 會天津國際中醫藥學術硏討會議論文集, pp 325-327, 2006. 24. 정인철, 이상룡. 溫膽湯이腦組織의酸化作用에미치는影響. 동의신경정신과학회지 8(2):51-62, 1997. 25. Cacquevel, M., Lebeurrier, N., Cheenne, S., Vivien, D. Cytokines in neuroinflammation and Alzheimer's disease. Current Drug Targets, 5(6):529-534, 2004. 26. Kuh,l D.E., Koeppe, R.A., Minoshima, S., Snyder, S.E., Ficaro, E.P., Foster, N.L., Frey, K.A., Kilbourn, M.R. In vivo mapping of cerebral acetylcholinesterase activity in aging and Alzheimer's disease. Neurology, 52(4):691-699, 1999. 27. Mhatre, M., Floyd, R.A., Hensley, K. Oxidative stress and neuroinflammation in Alzheimer's disease and amyotrophic lateral sclerosis : common links and potential therapeutic targets. Journal of Alzheimers disease, 6(2):147-157, 2004. 28. 안준익, 이용성. Beta-amyloid의분자생물학. 한양의대학술지 21(1):11-16, 2001. 29. Trabace, L., Cassano, T., Steardo, L., Pietra, C., Villetti, G., Kendrick, K.M., Cuomo, V. Biochemical and neurobehavioral profile of CHF2819, a novel, orally active acetylcholinesterase inhibitor for Alzheimer's disease. The Journal of Pharmacology and Experimental Therapeutics, 294(1): 187-194, 2000. 30. Kasa, P., Papp, H., Torok, I. Donepezil dose-dependently inhibits acetylcholinesterase activity in various areas and in - 1281 -
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