임상병리검사과학회지 : 제 31 권제 2 호 1999. 위궤양조직으로부터분리펀 Helicobacter pylori 의유전적다양성 광양대학임상병리과 서남대학교의과대학임상병리과 순천대학교생물학과 김양호 신명근백근식 ** 성치남 ** Genetic Diversity of Helicobacter pylori Isolated from Ulcer Tissue Kim, y, 없 19 Ho., Shin, Myuong Geun*., Baik, Keun Shik**., Seong, Chi Nam** Department 01 Clinical pathology, Kwang Yang C 이 lege, College 01 Medicine, Seonam Universitν* Department 01 Biologν, Sunchon National Universitν** Genetic diversity of Helicobacter pν ro1i isolated from ulcer tissue were determined using RAPD-PCR. Genomic DNAs extracted from pure isolates containing urea gene were amplified with random primers of OPA-07, OPA-10, OPA-11, and OPA-12. Amplified DNA products were compared, and their relationships were presented as similarity and dendrogrm. Similarity levels of isolates varied from 0.23 to 0.9 1. Twenty isolates were grouped as 3 domains at the similarity level of 0.6. Key Words : RAPD, He/icobacfer py/ori, Random primers, Silmilarify levels 1. 서론우리나라사람을대상으로 H. Pν 10ri에의한감염을조사한보고에의하면위염및위십이지장궤양환자의약 80-90% 가이세균에의해위질환이발생한다고알려져있다. 또한대부분의한국사람들은어린시절부터 H. Pν 10까에감염되어살아가는것으로보고되고있다 ( 김등, 1999). 따라서다양한변이종이나아형들이존재 할것으로보인다. H. Pν 10ri 의 다형성을파악하 기위해 H. Pν 10 까의항원분석을통한혈청형을결정하기위한많은노력이시도되고있다 (Lior, 1991). 지금까지확인된혈청형의수가적어다 른세균에서같은 serotyping 의의미가없고 phage typing 도마찬가지다. 최근 H. Pν 10ri 의 유전자를분석한연구에의하면분리균주에따른 - 105 -
유전자다양성이다른세균에비해높은것으로 동정된 H. Pν10ri의 분리주는 glycerol 이 20% 알려지고있으며, (Faxa1l, 1992) 이를이용함으 가첨가된 1 % peptone broth 에부유하여액체 로써분리주의동질성을조사할수있을것으로 질소에냉동보관하였다. 생각된다. 본연구의 목적은 RAPD 지문법을이용하여 3. H. pylori DNA 분리 H. Pν 10ri 분리주사이의 genomic diversity를분 석, 유전자형 (genotype) 을설정하고이를토대 액체질소에냉동보관된 H. Pν10바분리주를해 로균주동정법을확립하여 H. Pν 10ri의 균주를 동시켜 2ml의 Brain Heart Infusion broth 에 동정하고, 상관성을파악하여 감염 전파경로를 접종하여 35 0 C 에서배양하였다. 균부유액 1ml 역학적으로증명하기위한수단으로사용하고자 를 microcentrifuge tube 에 취하여 5,000 rpm 본연구를실시하였다. 으로 4 0 C 에서 5분간원심분리하여상층액은버 리고 균 침전물은 SE 완충액 (75mM NaCl, II. 실험재료및방법 25mM EDTA) 으로 1 회세척하였다. 세척한침전 물을 200μ 의 lysis 완충용액 (2mg of lysozyme 1. 위생검조직으로부터 H. pylori 분리 per ml, 1M NaCl, 10mM tris [ph 8. 이, 100mM EDTA, 0.5% sarkosyl) 으로 37 0 C 에서 위복통증세를보여병원을내원하는환자로부 30분간 배양한 후 500μ 의 ESP 완충용액 터 H. Pν 10ri를 분리하기 위하여 Olympus (0.5M EDTA, 1% sarkosyl, 1mg/ml protei XP-20 gatroscope을이용하여채취한위의 전 nase K) 으로 55 0 C 에서 2 시간배양하였고다시 정부의 상피조직 생검체를 즉시 vancomycin RN ase을 20μg/ml 되게 첨가하여 37 0 C 에서 1 10ug/ml, n떠 idixic acid 25ug/ ml, ampho- 시간 배양하였다. 이 용액에 동량의 phenol/ tericin B 1ug/ml, 10% 의 우혈청이 첨가된 chloroform/ isoamylalcohol (25:24: 1) 을넣고 Mueller-Hinton 한천배지에접종하였다. 12,000 rpm으로 4 0 C 에서 15분간원심분리하여 상층액을취하고이 과정을 1 회 더 반복한다음 2. 배양 2배량의 ethanol과 1/10 양의 3M sodium acetate를넣고 -20 0 C 에서하룻밤동안침전시킨 10% CO 2 와 100% 습도가유지되는 37 0 C 뒤 13,000 rpm으로 4 0 C 에서 20분간원침시켰 항온기에 1 주일간배양하였다. 배지에형성된집 다. 침전된 DNA는 1ml의 70% ethanol로세척 락을 10% urea배지에넣어 urease시험을실시, 하고즉시 진공건조시킨뒤 100μ 의 TE 완충액 1-2분이내에양성반응을보이는집락을선택한 (10mM tris[ph 8. 이, 1mM EDTA) 으로녹이고 후, 항생제가첨가되지않은 Mueller-Hinton 한 uv 분광광도계로측정하여 DNA농도를 50ng/ 천배지에계대배양하였다. 순수한집락을취하 μm로맞추었다. 여그람염색을실시하여그람음성의나선균을확 인하고, oxidase 양성, catalase 양성인지를확 4. UreA 유전자의중합효소연쇄반응 인하여, 모두양성으로판정되면 H. Pν 10까로동정하였다. UreA 유전자의 증폭을위해서는 H. Pν10비 - 106 -
Table 1. Primers used in the RAPD analysis of H. pν lori Primer Name 01igonucelotide sequence OPA-07 5 -GAAACGGGTG-3 OPA-10 5 -GTGATCGCAG-3' OPA-11 5 -CAATCGCCGT -3 OPA-12 5 -TCGGCGATAG-3 detection kit 를이용하여증폭하고 1.5% 6. 유사도분석 agarose gel 을이용하여전기영동한후 325bp 의 RAPD pro fi1 e은 band가있으면 1, 없으면 0" 으로계수화하여 character matrix를작성하였다. 작성된정보를통계프로그램인 NTSYS-pc (Numerical taxonomy system and mu1tivariate ana1ysis system, version 1.51, Applied Biostatistics Inc, USA) Program을이용하여 Dice 의 coefficient 법으로상사성지수 ( 잉mil없i.ty v. 려ue) 를구하고 UPGMA (unweighted pair-group arithmetic average analysis) 법으로군집분석을시행한다음 dendrogram을그려서균들간의유사성을표현했다. III. 결과 1. H. py/ori 의분리및 UreA 유전자확인 band을확인하였다 ( 김등, 1999). 5. RAPD PCR 용액은총 25μ 의양으로세균 genomic DNA 25ng, 3mM MgCb, single random primer 20pmoles, DynaZyme (Fin강me Inc., Finland) 1U, 각각의 dntp 250 μ M, 50mM KCl, 0.001% gelatin을넣어시행하였다. 이때사용한 primer는 4종의 10-mer oligonucleotide (Operon Co., USA; Kit A) 를사용하였다 (Table 1). PCR은 DNA therma1 cyc1er (Model 9600; Perkin-Elmer Cetus, USA) 를사용하였으며, 온도조건은 95 0 C 에서 5분간 predenaturation 시킨뒤 94 0 C 에서 30초간 denaturation, 35 0 C 에서 30 초간 annealing 그리고 72 0 C 에서 1 분간 elongating을한주기로 44 회반복하고 72 0 C 에서 5분간 postextension 시켰다. PCR이끝난후 1.8% agarose gel 에 PCR 산물 8μM를 loading한뒤 70V로 4시간동안전기영동하여 UV 광선을투과하여 polaroid camera로촬영하였다. 위궤양조직으로부터 207ß 의 H. pylo너를분리하였다 (Fig. 1). 분리균주들은모두그람음성나선균으로 urea배지에서 1-2분이내에양성반응을나타내었으며, oxidase, catalase 양성반응을보였다. 그들은모두 325bp의 UreA 유전자를가지고있었다 (Fig. 2). - 107 -
Fig 1. Photographs showing the ulcer tissue stained with hematoxylin eosin arrow indicates H. Pν lori. 0.5 - n u 1J 14 / R q ] ] /6 n 1 [<] 144 14 14 7/ 이 니QJ nu /0?/---14 nu 끼/ /4, 1 b 4 Q ] Fig 2. Dendrogram showing the relationships of H. pν roli analyzed by RAPD - 108 -
Table 2. Matrix of simi1arity values for 20 Helicobacter pν lori isolates by RAPD analysis 10 11 12 13 14 15 16 17 18 19 20 1 1.0000000 2 OMOOOOO 1.0000000 3 0.60869570.5454545 1.0000000 4 0.38095240.5에 00000.6666667 1. 0000000 0.7200000083333330.54545450.5000000 1.0000000 6 0.48000000.7500000 0.4545455 0.5애 00000.58333331 에00000 7 0.60869570.63636360.30000000.33333330.6363636 0.5454545 1.0000000 8 0.66666670.69565220.57142860.63157890.7826087 0.6956522 0.5714286 1.0000000 9 0.57142860.59259260.3200000 0.52173910.66666670.59259260.64000000.6153846 1.0000000 10 0.66666670.62068970.44444440.56000000.7586207 0.6206897 0.6666667 0.7142857 0.8750000 1.0000000 11 0.52173910.54545450.40000000.66666670.6363636 0.7272727 0.5000000 0.8571429 0.6400000 0.6666667 1.0000000 12 0.56000000.50000000.63636360.60000000.58333330 얘 666670.4 5454550.78260870.51851850.62068970.7 272727 1. 0000000 13 0.60869570.63636360.5애 O( 애 00.55555560.72727270.81818180.60000000.8571429 0.5600000 0.6666667 0.9000000 0.7272727 1.0000000 14 0.72000000.75000000.54545450.5에 00000.83333330.7 5애0000.63636360.86956520.59259260.68965520.8181818 0.7500000 0.9090909 1.0에 0000 15 0.2857143060000000.55555560.75000000.5000000 0.6000000 0.5555556 0.6315789 0.5217391 0.5600000 0.5555556 06000000 0.5555556 0.5000000 1.0000000 16 0.74074070.6923077 0.5000000 0.4545455 0.7692308 0.6153846 0.7500000 0.72에 0000.75862070.77419350.66666670.61538460.7500000 0.7692308 0.54545451 에 00000 17 0.59259260.53846150.58333330.54545450.6153846 0.4615385 0.5000000 0.6400000 0.55172410.58064520.66666670.76923080.5833333 0.6923077 0.4545455 0 6428571 1.0000000 18 0.40000000.52631580.58823530.66666670.5263158 0.4210526 0.2352941 0.5555556 0.3636364 0.3333333 0.4705882 0.5263158 0.4705882 0.5263158 0.5333333 0.4761905 0.4761905 1.0000000 19 0.69230770.6애 00000.60869570.66666670.64000000.56000000.5217391 0.66666670.64285710.73333330.60869570.5600000 0.6086957 0.6400000 0.5714286 0.6666667 0.6666667 0.5000000 1.0000000 20 0.62068970.57142860.6923077 0.5833333 0.5714286 0.5000000 0.5384615 0.5185185 0.5161290 0.6060606 0 53846150.57142860.53846150.64285710.50000000 에 000000.66666670.52173910.5517241 1.0000000 Abbreviation: RAPD, random amplified polymorphic DNA analysis. 2. RAPD 양상 OPA-07 primer를이용하여증폭시킨결과 235bp 에서 1,500bp 사이에 1-7개의 band를보였다. 한편 OPA-10 primer를이용한경우 18 번균주를제외하고모든균주들은 1,000bp 정도의공통 band를보였으며, 1-107R 의 band가 270bp에서 1,400bp 사이에서관찰되었다. OPA-11 primer를이용한경우에도 270bp에서 1,400bp 사이에 2-5개의 band가관찰되었다. OPA-12 primer를이용한경우에도 2-57R 의뚜렷한 band가 300bp와 1,400bp 사이에서관찰되었다 (Fig. 3). 3. 시험균주의유전적유사성 13 번및 14 번사이의유사성지수는 0.91 로유전적으로매우상동하였으며, 7번과 18주사이의유사성지수는 0.24로유전적유사성이다른균주사이보다낮았다. 4. 아형의분류 20주 H. pylori의 RAPD 결과를 UPGMA법으로군집분석하여 3 가지의형 (A- C) 으로분류하였다. 대상균주들은유사성지수 0.5 정도에서한개의군집으로무리지어졌고, 0.6 부끈에서 3 개의아형으로구분할수있었다.A형이 13주 (13/20, %) 로가장많았으며 B 형및 C 형은각각 4주 (4/20, %) 와 3주 (3/20, %) 였다 (Fig. 4). 시험균주사이의유사성지수의분포는 0.23 에서 0.91 사이로유전적으로다양하였다 (Table 2). A형에속한 13주의평균유사성지수는 0.84로다른형에비해유전적유사성이높았으며, 4주가속한 B 형의평균유사성지수는 0.72 이고, C 형의평균유사성지수는 0.6으로시험균주전체의평균유사성지수는 0.50 이었다. IV. 고찰 세균의분류, 특정규명및역학조사의방법으로최근들어분자생물학적인기법이많이이용되고있는데이중비교적초기에이용된 restriction fragment length polymorphism (RELP) 은각밴드사이의해상도가낮아결과의비교분 - 109 -
석이어렵다는단점이있다. 이를극복하기위하군집으로무리지어졌고, 유사도지수 0.6 부근에 여 pulse field gel electrophoresis (PFGE) 및서 3 개의아형으로구분할수있었다.A 형이 13 riboηping 등을이용하였는데이들역시시간과주 (13/2 이로가장많았으며 B 형및 C 형은각각 비용이많이사용되는단점을가지고있다 4 주 (4/20) 와 3 주 (3/2 이였다. 1990 년 Williams 등에의해 random amplified polymorphic DNA ( 없 PD) 분석법이소개되었 13 번및 14 번균주사이의유사도지수는 0.91 로유전적으로매우상동하였으며, 7 번과 다 (Williams et al., 199 이. 이는짧은길이의 18 주사이의유사도지수는 0.24 로유전적유사 primer 대개 10-mer) 를이용하여 genomic 성이다른균주사이보다낮았다. DNA 를증폭하고, genomic DNA 의 증폭된산물을전기영동하여 변이를알아내는방법으로, 더 욱신속하고비교적쉽게 genotyping 을알수 있는방법이다. 따라서없 PD 법은증폭하고자하 는부위의염기서열을알지못해도빠른시간내 에 비교적간단히세균을사이의분자생물학적인 정보를알수있다. 초기에 RAPD 분석법은식물 본연구에서수립한 RAPD 지문분석법을이용 한 H. pylori 의유전자형은 H. Pν lori 의 연구에그유용성이높다고사료된다. V. 결료르 L- 역학적인 위궤양조직으로부터분리한 H. Pν roli 의유전 병원균인 Fusarium solani 와 Leptosphaeria 적다양성을조사하였다. urea 유전자를가지고 ma 띠 lans 에적용되었으나그후많은균들에적있는 207~ 의분리균으로부터추출한염색체 용되어이균들의역학조사및균주의구분및 DNA 를 random primer 인 OPA-07, OPA-10, 염기서열의다양성규명등의분야에서사용되고 OPA-11 과 OPA-12 의 4 가지를이용하여증폭하 있다 (Binger et al., 1993; Goodwin et al., 였다. 증폭된 DNA 산물을비교하여분리균들사 1991; Lawrence et al., 1993; Wang et al., 이에유사도를구하였다. RAPD 분석에의한 20 1993; Welsh et al., 1990). 개의분리균들사이의유사도는 0.23 으로부터 H. Pν lori 의분리주사이의유전자의다양성이 0.19 로다양하였으며, 유사도상수 0.6 에서 3 개 높다고알려진반면에계대에따른유전자변화의아형으로군집화되었다. 가거의조사되지않는다는사실이보고됨으로써 H. Pν lori 의 genotyping 의중요성이대두되었다. 본연구에서는 H. Pν lo 애의분자역학적검색 을위해 RAPD 분석을시행하였다. 위궤양조직으 로부터분리된 20 개의 H. Pν lori 는 urease 를생 산하고있으며, 모두 UreA 유전자를가지고있 었다.4 가지의 primer 를이용한 RAPD Profile 을 Dice 의 coefficien t 로균주들사이에유사도를구 하고, 이유사도를 UPGMA 법으로군집분석하였 다. 시험균주사이의유사도지수의분포는 0.23 에서 0.91 사이로유전적으로다양하였다. 시험균주들은유사도지수 0.5 정도에서한개의 참고문헌 1. Bingen E, Boissinot C, Desjardins P, Cave H, Brahimi N, Lambert-Zechovsky N, Denamur E, Blot P, Elion J: Arbitrarily primed polymerase chain reaction provides rapid differentiation of Proteus mirabilis isolates from a pediatric hospit 려.J αin Microbiol 31: 1055-1059, 1993. 2. Crowhurst RN, Hawthome BT, Rikkerink EHA, Templeton MD: Differen- - 110 -
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