Korean Society for Biotechnology and Bioengineering Journal 31(4): 228-236 (2016) http://dx.doi.org/10.7841/ksbbj.2016.31.4.228 ISSN 1225-7117 / eissn 2288-8268 연구논문 녹차카테킨 EGCG 의노출에따른식중독세균인용혈성 Aeromonas sp. MH-8 의특성조사 김동민, 오계헌 * Characterization of Hemolytic Aeromonas sp. MH-8 Responding to the Exposure of Green Tea Catechin, EGCG Dong-Min Kim and Kye-Heon Oh* Received: 5 September 2016 / Revised: 24 November 2016 / Accepted: 25 November 2016 2016 The Korean Society for Biotechnology and Bioengineering Abstract: The aim of this study was to characterize the hemolytic Aeromonas sp. MH-8 exposed to green tea catechin, epigallocatechin gallate (EGCG). Initially, the hemolytic Aeromonas sp. MH-8 was enriched and isolated from stale fish. Bactericidal effects of MH-8 exposed to EGCG ranging from 1 mg/ml to 4 mg/ml were monitored, and complete bactericidal effects were achieved within 3 h at 3 mg/ml and higher concentrations. SDS-PAGE with silver staining revealed that the amount of lipopolysaccharides increased or decreased in the strain MH-8 treated to different concentrations and exposing periods of EGCG in exponentially growing cultures. The stress shock proteins (70-kDa DnaK and 60-kDa GroEL), which might contribute to enhancing the cellular resistance to the cytotoxic effect of EGCG, were induced at different concentrations of EGCG exposed to cell culture of MH-8. Scanning electron microscopic analysis demonstrated the presence of irregular rod shapes with umbilicated surfaces for cells treated with EGCG. 2-DE of soluble protein fractions from MH-8 cultures showed 18 protein spots changed by EGCG exposure. These proteins involved in chaperons (e.g., DnaK, GroEL and trigger factor), enterotoxins (e.g., aerolysin and phospholipase C precursor), LPS synthesis (e.g., LPS biosynthesis protein and outer membrane protein A precursor), and 순천향대학교생명시스템학과 Department of Life Science and Biotechnology, Soonchunhyang University, Asan 31538, Korea Tel: +82-41-530-1353, Fax: +82-41-530-1493 e-mail: kyeheon@sch.ac.kr various biosynthesis and energy metabolism were identified by peptide mass fingerprinting using MALDI-TOF. In consequence, EGCG was found to have substantial antibacterial effects against food-poisoning causing bacterium, hemolytic Aeromonas sp. MH-8. Also the results provide clues for understanding the mechanism of EGCG-induced stress and cytotoxicity on Aeromonas sp. MH-8. Keywords: Aeromonas sp. MH-8, Hemolysis, Green tea catechin, EGCG 1. INTRODUCTION 녹차는우리나라뿐만아니라일본, 중국등을포함하는전세계적으로음용되어지는가장대중적인차의한종류로서, 폴리페놀, 카페인, 아미노산, 비타민, 무기질등의여러성분으로구성되어있다 [1]. 최근연구를통해녹차에포함된카테킨의항산화효과, 혈당감소효과, 노화방지효과, 살균효과등의다양한효과가있는것으로알려지고있어음료로서의녹차뿐만아니라다양한기능성에대하여주목받고있다 [2-4]. 녹차에포함된주요카테킨에는 epigallocatechin gallate (EGCG), epigallocatechin (EGC), epicatechin gallate (ECG), epicatechin (EC), gallocatechin gallate (GCG) 등이있다. 특히이들가운데 EGCG는카테킨의 40% 이상을차지하며, 강한생리활성이있는것으로알려져있다 [4]. EGCG는 E. coli, B. cereus, S. mutans, MRSA 등의식중독및구강미생물, 항생제
EGCG 에노출된 Aeromonas sp. MH-8 의특성조사 229 내성균주등에대하여강력한살균효과에대하여보고된바있어이에대한활용에관심이집중되고있다 [4-7]. Aeromonas 는그람음성의간균으로자연계에널리분포되어있으며, 의학및수의학적병원체로관심받고있는세균이다. Bacillus, Clostridium, Escherichia, Listeria, Salmonella, Staphylococcus, Vibrio 등과함께식중독을유발하는세균으로알려져있으나, 다른세균과는달리 Aeromonas 에의한식중독발생기작은충분히규명되지않아서예방및관리에있어서문제가되고있다. 최근연구에따르면 Aeromonas 속의일부균주가장독소 (enterotoxin), 세포독소 (cytotoxin), 용혈독소 (hemolysin) 등을생성하여위장관등을감염시킬수있으며, 상피세포에침입할수있는능력을지니고있는것으로보고되어중요한장병원체 (enteropathogen) 로인식되고있다 [8]. Aeromonas 는국내의양식장에서주로발견되며어류의양식에있어서수온, 고밀도사육, 수중유기물등의여러환경적요인에의해손상된조직에감염되어어류의집단폐사를일으키는것으로보고되었으며 [9], 경제적손실을비롯한많은문제점이발생되어이를해결하기위한방안및대안의필요성이제시되고있다 [10]. 이를해결하기위하여양식업에서는합성항생물질이나소독제를사용하여, Aeromonas 의감염예방을위하여노력하고있으나항생제의과다사용으로인하여 Aeromonas 뿐만아니라, Vibrio, Enterobacter, Citrobacter 등의세균에서도여러항생제에대하여다재내성발생이보고되고있는실정이다 [11]. 또한항생제사용으로인한추가적인환경오염이나항생제내성균주에오염된생선을섭취함으로서건강상의문제를일으킬수있는등의 2 차피해가우려되고있다. 본연구에서는상한생선에서 Aeromonas sp. MH-8 을분리하고, 분리세균이 EGCG 에노출되었을때일어나는여러가지세포반응및프로테옴분석을실시하였다. 먼저 EGCG 에노출되었을때의분리세균의생존율을조사하였으며, SDS- PAGE 와 silver staning 을통해 LPS 의변화를관찰하였다. SDS-PAGE 와 Western blot 을이용하여분리세균이아치사량의 EGCG 에노출되었을때유도발현되는스트레스충격단백질 (SSPs) 의변화와주사전자현미경을이용하여노출에따른세포외부형태의변화를관찰하였다. 또한 EGCG 에노출되었을때일어나는다양한프로테옴변화를 2-DE 와 MALDI- TOF 분석을통하여확인하였다. 2. MATERIALS AND METHOD 2.1. 균주의확보및배양조건본연구에사용된균주는상한생선에서농화배양기법을이용하여분리하였다. 시료약 5 g 을채취하여 100 ml 의생리식염수가담긴플라스크에넣고교반시킨후, 상등액 100 µl 를취하여 5% sheep blood agar (Difco Co, Sparks, USA) 배지에평판도말하고, 30 o C 에서 24 시간배양하였다. 용혈능을가지는세균을분리하기위하여배양과정에서집락주변에투 명대 (clear zone) 을생성하는균주를선별하였으며, 선별된균주를혈액평판배지에 3 회에걸친도말평판법을이용한순수배양기법으로세균을분리하였다. 2.2. EGCG 노출에대한분리세균의생존율조사분리세균의 EGCG 노출에의한생존율을알아보기위하여분리세균을 LB 액체배지에배양하여, 파장 660 nm 에서혼탁도가 1.0 일때, 배양액을 4 o C 를유지하며 13,000 rpm 에서 5 분간원심분리하였다. 얻어진균체를 PBS (ph 7.4) 로 3 회세척하고, 다시원심분리를실시하여얻어진균체에다양한농도의 EGCG 에노출시켰다. 30 분간격으로 LB 고체평판배지에 100 µl 씩평판도말하여 30 o C 에서 24 시간배양한후, 형성된집락을계수하여 EGCG 의농도와노출시간에따른분리세균의생존율을조사하였다. 2.3. 분리세균의 LPS 의추출 EGCG 의농도와노출시간에따른분리세균의 LPS 변화를관찰하기위하여 EGCG 를농도별 (0~4 mg/ml) 로 3 시간동안노출시킨균체와 3 mg/ml 의동일한농도에서 30 분간격으로노출시간의변화를주어최대 180 분까지노출시킨균체를원심분리하여 (4 o C, 13,000 rpm) 얻었다. 얻어진모든균체를각각 PBS 로 3 회세척하여 phenol-water 추출법 [13] 에근거한 LPS Extraction kit (Intron, Korea) 를사용하여분리세균의 LPS 를추출하였다. 균체에 lysis buffer 를넣어완전히현탁시킨후, chloroform 을첨가하여 10~20 초간교반하고실온에서 5 분간반응시켰다. 반응시킨균체를 13,000 rpm 에서 10 분간원심분리한후상등액을새로운튜브에옮기고, purification buffer 를넣고혼합하여 -20 o C 에서 10 분간반응시켰다. 반응시킨혼합액을 4 o C 를유지하면서 15 분간원심분리하여균체를회수하고 70% ethanol 을첨가하여균체를세척한후완전히건조시켰다. 건조시킨균체에 10 mm Tris-HCl buffer (ph 8.0) 를넣고 45 분간반응시켜 LPS 를추출하였다. 고순도의 LPS 를얻기위해추출한 LPS 에 proteinase K 를첨가하여 60 o C 에서 1 시간반응시켜 LPS 를정제하였다. 2.4. SDS-PAGE 와 silver staining LPS 의변화를 Fomsgaard 의방법 [14] 에따라 SDS-PAGE 및변형된 silver staining 을통하여확인하였다. SDS-PAGE 의 separating gel 은 12% acrylamide gel 을사용하였으며, stacking gel 은 5% acrylamide gel 을사용하였다 [15]. 전기영동한 gel 은고정용액 (25% isopropyl alcohol, 7% acetic acid) 으로 4 o C 에서 1 시간동안처리하였다. 처리한 gel 을증류수로세척한후산화용액 (0.7% periodic acid, 3% ethanol, 0.1% acetic acid) 을첨가하여 5 분간반응시킨후, 증류수로 30 분씩 3 회세척하였다. Silver stain 용액 (1.3% ammonium hydroxide, 18.6% 0.1 N NaOH, 0.67% silver nitrate) 에 10 분간반응시키고, 증류수로 5 분씩 3 회세척하였다. 현상액 (0.1% citric acid, 0.05% formaldehyde) 에서밴드가뚜렷하게나타날때까지반응시키고, 정지용액 (0.8% acetic acid) 을넣어반응을정지시킨후
230 Korean Society for Biotechnology and Bioengineering Journal 31(4): 228-236 (2016) 증류수로세척하여 EGCG 에노출시킨분리세균의 LPS 변화를관찰하였다. 2.5. 주사전자현미경을이용한세포외부형태관찰 EGCG 에노출된분리세균의세포외부형태변화를주사전자현미경으로정상세포와비교, 관찰하였다. 분리세균을 24 시간동안배양시킨후, 원심분리하여얻어진균체를 PBS 로 3 회세척하여준비하였다. 이균체를 3 mg/ml 농도의 EGCG 에각각 90 분, 180 분동안노출시킨후, 배양액을원심분리하여균체를회수하고, 여과지에부착하여 2.5% glutaraldehyde (Sigma, St. Louis, MO, USA) 와 1% osmium tetroxide (Sigma, USA) 로각각 2 시간처리하여고정을실시하였다. 다양한농도의 ethanol (50, 60, 70, 80, 95, 100%) 을준비하여, 저농도로부터점차농도를높여가면서각농도별로 10 분씩연속적으로탈수시켰다. 마지막으로 100% ethanol 에 30 분씩 2 회탈수하고, hexamethyldisilazane (EMS, Fort Washington, PA, USA) 에 20 분간반응시켜공기중에서건조시켰다. 건조된 membrane filter 를 slide glass 상에부착시키고, sputter coater (IB-3, Giko Engineering Co., Japan) 를사용하여, 2 ma 로 3 분간 gold coating 하여주사전자현미경 (LEO 1455VP, ZEISS, Germany) 으로관찰하였다. 2.6. 분리세균의단백질획득및정량분리세균 MH-8 을 EGCG 에노출시킨후, 4 o C 를유지하면서 13,000 rpm 에서 10 분간원심분리하여얻어진균체를 10 mm PBS 로 3 회세척하여시료를준비하였다. 이후 PRO-PREP TM Protein extraction solution (Intron, Korea) 에균체를현탁하여 4 o C 에서 30 분간반응시켜단백질을추출하였다. 현탁된세포는 30 분간원심분리 (4 o C, 13,000 rpm) 한후단백질을포함하고있는상등액을취하여 SMART TM BCA Protein assay kit (Intron, Korea) 을사용하여단백질을정량하였다. 2.7. SDS-PAGE 및 Western blotting 분석분리세균이 EGCG 에노출이되었을때스트레스충격단백질의변화를조사하기위하여 SDS-PAGE 와 Western blot 을실시하였다. SDS-PAGE 는 Bollag 등 [15] 의방법에따라수행하였으며, Separating gel 은 12% acrylamide gel 을사용하였으며, stacking gel 은 4% acrylamide gel 을사용하였다. 전기영동후 gel 은 2.5% Coomassie brilliant blue staining solution (Bio-Rad Co., Hercules, CA, USA) 1 시간동안염색하였고, destaining solution (30% methanol, 7% acetic acid) 로 1 시간동안탈색하였다. EGCG 에의한스트레스충격단백질 (stress shock proteins, SSPs) 을분석하기위하여 Sambrook 등 [16] 의방법에따라 Western blot 을실시하였다. 1 차항체는 anti-dnak 와 anti- GroEL (StressGen Biotechnologies Corp., Victoria, Canada) 을사용하였으며, 2 차항체는 anti-mouse IgG HRP conjugate (Promega, Madison, USA) 를사용하였다. 항원항체반응을검출하기위해 ECL kit (Amersham internation plc. Buckinghamshire, England) 를사용하여 X- 선필름 (AGFA, Belgium) 에현 상한후, SSPs 의발현을분석하였다. 2.8. 2- 차원전기영동 (2-DE) 분리세균이 EGCG 에노출되었을때발현되는단백질변화를분석하기위하여대상균주를 3 mg/ml 농도의 EGCG 에 2 시간동안배양한후획득한단백질시료와대조군으로서 EGCG 에노출되지않은균주에서얻은단백질시료를각각준비하였다. 단백질시료는각각 180 µg/ml 의농도로준비하여, TCA 침전법으로시료를정제한후, 기존에기술된방법으로이차원젤전기영동 (2-DE) 을수행하였다 [17]. 전기영동이완료된 gel 은 silver stain 하기위하여고정용액 (10% acetic acid, 40% ethanol) 으로 1 시간동안고정시키고, 감광용액 (30% ethanol, 6.8% sodium acetate, 0.02% sodium thiosulfate) 에 30 분동안 gel 을반응시켰다. 반응시킨 gel 을증류수로 5 분간 3 회세척한후, sliver stain solution (0.25% sliver nitrate, 0.04% formaldegyde) 에 30 분반응시키고, 증류수로 1 분씩 2 회세척하였다. 현상용액 (2.5% sodium carbonate, 0.04% formaldehyde) 에서단백질 spot 이관찰되면정지용액 (1.4% EDTA) 으로반응을정지시켰다. 2.9. MALDI-TOF/MS 를이용한 peptide sequencing Peptide sequencing 을위한 gel digestion 은이전에기술된방법에따라실시되었다 [18]. 농축된 peptide 시료를 Matrix buffer (50% ACN, 0.1% TFA) 1 ml 에녹인후, 0.01 g 의 CHCA (α-cyano-4-hydroxyciannamic acid) 를첨가하여분석용시료를만들었다. 준비된시료를 PTFE (polytetrafluoroethylene) 필름으로코팅된 96 well plate (Applied Biosystems Inc., Germany) 에 1 µl 씩주입하여 peptide 를분석하였다. MALDI- TOF/MS 로분석된단백질의분자량을 Mascot (http://www. matrixscience.com) 의 NCBI (http://www.ncbi.nlm.nih.gov) 와 MS-FIT (www.prospector.ucsf.edu) database 에근거하여단백질을동정하였다. 3. RESULTS AND DISCUSSION 3.1. EGCG 노출에따른분리세균의생존율조사 MH-8 균주의 EGCG 의농도와노출시간에따른생존율을알아보기위한실험을실시하였다. EGCG 에노출된세균은노출농도와시간이증가함에따라점차생존율이감소하였다. 4 mg/ml 의농도의 EGCG 에노출된세균은빠르게집락의수가감소되어 150 분에집락이발견되지않았으며, 3 mg/ml 의농도에서는 180 분에집락이관찰되지않았다 (Fig. 1). EGCG 의살균효과는여러연구결과들을통해보고된바있다. Hara 등 [19] 은 Aeromonas, Vibrio, E. coli, B, cereus, Plesiomonas shigelloides 등식중독 - 원인세균에대하여 MIC 시험을진행하여 EGCG 의최소억제농도를측정한결과, Aeromonas 및대부분의세균에서 1 mg/ml 의농도에서 24 시간배양시균주의생장이억제됨을확인하였다. Yu 등 [6] 은구강세균인 Strep-
EGCG 에노출된 Aeromonas sp. MH-8 의특성조사 231 Fig. 1. Bactercidal rate of hemolytic Aeromonas sp. MH-8 following exposure to EGCG. MH-8 cells were maintained at the concentrations of 0 mg/ml ( ), 1 mg/ml ( ), 2 mg/ml ( ), 3 mg/ml ( ), and 4 mg/ml ( ) EGCG. At intervals, the numbers of colonies (CFU/mL) were measured. Error bars represent standard deviations based on three independent replicates. tococcus 속 (S. mutans, S. sobrinus) 과 Lactobacillus 속 (L. acidophilus, L. plantarum) 대하여 EGCG 의살균력실험을실시하였으며, Streptococcus 속은 8 시간이내, 그리고 Lactobacillus 속은 4 시간이내완전히제거되는것을관찰하였다. 선행연구및본연구결과에서보는바와같이 EGCG 는다양한세균에서뛰어난살균효과를가지고있어식중독세균을예방, 제어하거나산업적으로응용가치가있을것으로판단된다. 본연구에서는생존율조사실험에근거하여분리세균이아치사조건의 EGCG 에노출되었을때일어나는다양한세포반응을조사하기위하여 3 mg/ml 농도의 EGCG 에서다양한실험들을수행하였다. 3.2. EGCG 에노출된분리세균의 LPS 변화관찰분리세균인 MH-8 에 EGCG 를노출농도와시간을달리하여, EGCG 노출에따른 LPS 의변화를 SDS-PAGE 와 silver staining 을통해조사하였다. 추출된 LPS 의크기를확인하기위하여마커를사용하였으며, gel 상에서나타난약 24 kda 의밴드가 LPS 인것으로확인되었다. 분리세균에다양한농도의 EGCG 를노출시켜 LPS 의변화를관찰한결과, LPS 의양적변화는노출농도가증가함에따라상대적으로증가하였으나, 3 mg/ml 의농도에서는 LPS 가현저히감소하였으며, 4 mg/ml 의농도에서는완전히사라지는것이관찰되었다 (Fig. 2A). 분리세균을 3 mg/ml 농도의 EGCG 에서 180 분동안노출시켜 LPS 의변화를확인한결과, 노출 90 분이후부터 LPS 가점차감소하였으며, 180 분경과후, EGCG 에노출되지않은세균보다 LPS 의양이적게관찰되었다 (Fig. 2B). 살균효과조사실험결과에따르면 3 mg/ml 의 EGCG 에서 180 분동안노출되었을때, 세균이완전히사멸되는것이관찰되었는데, 동일조건하에서 LPS 의양적변화를관찰한결과분리세균의세포사멸이발생되어 LPS 의양이감소한것으로사료된다. EGCG 노출에따른 Aeromonas 속의 LPS 합성억제에대한기작에관한연구는보고된바없으나, Hajime 등 [20] 은 EGCG 가 E. coli 와 S. aureus 에서세포벽의지질이중층에손상을주어세균의생존에영향을준다는결과를보고하였다. 이들연구에따르면, EGCG 에노출된그람음성세균의경우그람양성세균에비해낮은세포사멸률을보이는데, 이는그람음성세균의 LPS 에의해 EGCG 와같은외부살균물질의유입을억제하기때문이라고제시하였다. 본연구의결과와비교하여볼때, MH-8 균주가치사량이상의 EGCG 에노출되어세포내로 EGCG 가침투되어세포손상이발생한결과 LPS 합성이억제되어결국세포가사멸되는것이라고사료된다. Fig. 2. Silver stained SDS-PAGE gel profiles of LPS extracted from hemolytic Aeromonas sp. MH-8, (A) cells treated with different concentrations of EGCG for 2 h; 0 mg/ml (lane 1), 1 mg/ml (lane 2), 2 mg/ml (lane 3), 3 mg/ml (lane 4), 4 mg/ml (lane 5), (B) cells treated with 3 mg/ml EGCG for different exposure times.
232 Korean Society for Biotechnology and Bioengineering Journal 31(4): 228-236 (2016) 3.3. 주사전자현미경을이용한 EGCG 에노출된세균의외부형태관찰살균효과실험에근거한아치사농도의 EGCG 를처리하였을때일어나는 MH-8 의세포외부형태의변화를주사전자현미경으로관찰하였다. EGCG 에노출되지않은 MH-8 세포는정상적인모습의세포표면이매끄러운간균의형태를나타내었다 (Fig. 3A). 그러나 3 mg/ml 의 EGCG 에노출된세균에서는노출되지않은세균과비교하여볼때, 세포의크기가비대해지고정상적인간균의형태를잃어버렸으며, 외형의변화가관찰되었다 (Fig. 3B). 동일조건하에서 LPS 및 SSPs 의발현이증가한점과결부시켜볼때, 세포생존을위하여 LPS 의증가로세포외부의형태와표면의변화가발생한것으로판단된다. 동일농도에서 180 분동안처리된세포들은세포의표면이거칠어지고심각한찌그러짐과구멍, 움푹패인형태가관찰되었다 (Fig. 3C). EGCG 노출에따른세포외부형태의변화는균주의종류에따라다양하게관찰되는것으로보고되었다. Shigemune 등 [21] 은 EGCG 에노출된 B. cereus JCM2152 의세포표면이심하게주름이지고, 찌그러지는모습을관찰하였으며, Cho 등 [7] 은 EGCG 에노출된 imipenem- 저항성인 Klebsiella pneumonia 의세포표면의천공과뭉그러짐을관찰하였다. 본연구의여러실험에서얻어진결과에근거하여볼때, MH-8 이 EGCG 에단시간노출되었을때, EGCG 의유입을억제하기위하여 LPS 의양이증가되어세포의표면이변화되었으나, 장시간에노출이되었을때는세포외막의 LPS 가파괴되어 EGCG 가세포내로유입되어세포사멸에영향을미치는것으로판단된다. EGCG 노출에의해세포사멸이일어나는기작에대하여, Hajime 등 [20] 은녹차카테킨의주성분인 EGCG 가지질이중층에손상을주어세균의생존에영향을준다는결과를발표하였으며, Shimamura 등 [22] 은카테킨의주성분인 EGCG 가직접적으로펩티도글리칸에결합하여세포벽을손상시키고, 세포벽의생합성을방해한다고보고하였다. 그러나 EGCG 노출에따른세포외부형태의변화와세포사멸이 LPS 손상에의한것인지, 세포막의손상에의한것인지에대한보다명확하고구체적인기작 에대한연구가있어야할것으로사료된다. 3.4. SDS-PAGE 및 Western blotting 분석 SDS-PAGE 와 Western blotting 은분리세균의 EGCG 노출에따른스트레스충격단백질 (SSPs) 인 Dnak 와 GroEL 분석을위해수행되었다. 다양한농도의 EGCG (1~4 mg/ml) 에노출된분리세균의 SSPs 의발현은노출농도가증가함에따라감소하는것으로관찰되었다 (Fig. 4A). 또한 EGCG 노출시간에따른 SSPs 의발현을조사한결과, Dnak 와 GroEL 은노출후초기부터 60 분까지점차발현이증가하였으나, 그후로는점차감소하였으며, 120 분이경과한후에는노출이되지않은세균보다도발현양이현저히감소한것을확인하였다 (Fig. 4B). SSPs 인 DnaK 와 GroEL 은그람음성세균인 E. coli 에서처음발견되어가장널리연구되어왔으며, 손상된단백질의구조를정상적으로회복시키는역할을하는것으로보고되었다 [23]. 또한, E. coli 뿐만아니라 Pseudomonas, salmonella, B. cereus 등다양한균주에서도발현이되며온도, H 2 O 2, NaCl, ph 등세포외부환경변화에의해발현이유도되는것으로보고되었다 [23,24]. 따라서분리세균에서 EGCG 에의해발현의증감을보인 SSPs 의변화는 EGCG 가세포사멸을유도한결과분리세균이생존을위해발현의변화를보인것으로판단되며, 세균의종류와특성에따라 SSPs 의발현정도에차이가있는것으로사료된다. 3.5. 2-DE 와 peptide sequencing 분리세균 MH-8 의 EGCG 노출에의해나타난다양한단백질의변화를이차원전기영동 (2-DE) 을통하여비교관찰하였다. 3 mg/ml 의 EGCG 에서 2 시간동안배양된 MH-8 균주의프로테옴발현변화양상을관찰한결과, ph 4~7 범위에서약 18 개의프로테옴스팟 (spots) 의증감이관찰되었다 (Fig. 5). 확인된프로테옴스팟의동정은 MALDI-TOF 에의한 peptide fingerprinting 을이용하여동정되었으며, 그분석결과는 Table 1 에요약되었다. 이들프로테옴은세포에서다양한기능을수행하는단백질임이확인되었다. 특히 Chaperon (DnaK, Fig. 3. Scanning electron micrographs of hemolytic Aeromonas sp. MH-8. (A) untreated cells, (B) cells treated with 3 mg/ml EGCG for 90 min, and (C) cells treated with 3 mg/ml EGCG for 180 min.
EGCG 에노출된 Aeromonas sp. MH-8 의특성조사 233 Fig. 4. Induction of stress shock protein (SSPs) in hemolytic Aeromonas sp. MH-8 treated with different EGCG concentrations for 3 h (A) and during different exposure times at 3 mg/ml EGCG (B). The SSPs were analyzed by SDS-PAGE and western blot with anti-dnak, anti-groel and monoclonal antibodies, respectively. Fig. 5. Two-dimensional gel electrophoresis pattern of total hemolytic Aeromonas sp. MH-8 proteins in Luria-Bertani broth without broth EGCG (A) or in the presence of 3 mg/ml EGCG for 2 h (B). The number associated with MALDI-TOF/MS identified spots is listed in Table 1. GroEL, trigger factor) 의증가가확인되었는데, 이들단백질은세포가온도, ph, NaCl, 독성화학물질등다양한형태의스트 레스에대한반응기작으로신속히유도및합성되어손상된단백질의구조를정상적으로회복시키는기능을한다 [23,
234 Korean Society for Biotechnology and Bioengineering Journal 31(4): 228-236 (2016) Table 1. Proteins identified by MALDI-TOF/MS fingerprinting Spot No. Identified protein Accession Sequence coverage (%) Chaperone 1 Chaperone protein, DnaK WP_043125071 47 2 Chaperone protein, GroEL EZH83780 52 3 Trigger factor WP_060389204 32 Enterotoxins 4 Aerolysin, AerA WP_060390531 69 5 Phospholipase C precursor AGM42437 29 Energy metabolism, pathway factors 6 2,3-Bisphosphoglycerate-independent phosphoglycerate mutase WP_026080439 38 7 Histidine kinase WP_025202170 71 8 Polyamine ABC transporter substrate-binding protein, PotA WP_043850629 38 Cell envelope 9 Lipopolysaccharide biosynthesis protein, RfbH KHA55667 46 10 Outer membrane protein A precursor ADA57643 49 11 Signal transduction protein ALQ62075 55 Biosynthesis 12 30S ribosomal protein S1 KWR68570 92 13 NAD + synthase WP_060390400 42 14 Sulfatase WP_011704465 54 15 Methenyltetrahydrofolate cyclohydrolase AJQ54388 52 16 Thioredoxin ALQ64408 36 DNA, RNA metabolism 17 DNA polymerase WP_043168615 48 18 DNA-directed RNA polymerase subunit omega EZH80716 70 Fold change 24]. 본연구의결과, EGCG 노출에의해증가된이들단백질은외부화학물질에대하여세포를방어하거나생존을돕는데중요한역할을하는것으로사료된다. EGCG 노출을통해서나타난또다른중요한발견은장독소 (enterotoxin) 및물질대사에관여하는 aerolysin (AerA), phospholipase C precursor 등의프로테옴의감소이다. AerA 는 Aeromonas 에서관찰되는독특한독소로알려져있는데, Howard 등 [25] 은 Aeromonas 로인한설사및상처감염에있어서주요독소라는것을보고하였다. 또한본연구에확인된 phospholipase C precursor 는 Aeromonas 뿐만아니라, 용혈성을지닌 E. coli O157, B. cereus 등에서도발견되며용혈현상 (hemolysis) 에관여하는주독소라고보고된바있다 [26,27]. Flores 등 [28] 은 Clostridium perfringens 에의해발병되는가스괴저 (gas gangrene) 에 phospholipase C precursor 가필요한독성요소로작용하는것을보고하였다. EGCG 에의해본독소들이억제되는기작에대한연구결과는아직보고된바없다. 따라서 EGCG 에의해 Aeromonas 에서생성되는독소의발현이억제되는것이관찰된것은흥미로운내용이며, 향후 EGCG 에의한독소억제기작을밝히는연구가수행되어야할것이다. 또한세포외막인 LPS 합성에관여하는프로테옴들이증가하는것으로확인되었다. 특히 lipopolysaccharide biosynthesis protein (RfbH) 은 LPS 의핵심다당류합성에관여하는단백질로알려져있다. 따라서 EGCG 노출에의해분리세균에서 LPS 합성에관여하는단백질의증가는 LPS 를생합성하여세포막의안정화를돕고, 외부유해물질의유입을막아세포를보호하는장벽역할을할수있도록발현이증가한것으로사료된다. Aeromonas 는담수, 오염된물, 양식장, 어패류등에서주로발견되며, 특히 Aeromonas 로인한식중독은그기작이알려지지않아국민건강에큰위협이되고있다. 또한양식업에서 Aeromonas 감염인한어패류의대량폐사발생으로심각한경제적손실을일으킬수있기때문에, 이를해결하기위한대안이필요한상황이다. 따라서이를극복하기위한몇가지대안이제기되고있으나, 화학물질이나항생제등의사용은환경오염및생물농축등의우려가제기되고있다. 이를해결하기위하여최근천연물이다양한기능적측면에대하여관심을받게되었으며, EGCG 가이를위한새로운대체물질로서제시되고있다. 녹차및녹차추출물을다양한분야에서이용하려는노력이많이이루어지고있으나, 식중독및병원성원인세균등을제어하거나산업적으로응용하려는연구는여전히미진한편이다. 따라서본연구에서는용혈활성을가진 Aeromonas 에대한녹차카테킨인 ECGC 노출에따른다양한특성조사를실시하였다. 향후이들결과를바탕으로 Aeromonas 의식중독기작과 EGCG 에의해억제되는독성단백질의저해기작을규명하는방향으로연구가진행되어야할것이다.
EGCG 에노출된 Aeromonas sp. MH-8 의특성조사 235 4. CONCLUSION 본연구는녹차카테킨인 epigallocatechin gallate (EGCG) 에노출된용혈성 Aeromonas sp. MH-8 의특성을조사하기위하여실시하였다. 먼저용혈성의 Aeromonas sp. MH-8 을상한물고기로부터농화, 분리하였다. 1~4 mg/ml 범위의 EGCG 에노출된 MH-8 균주의생존율을조사하였으며, EGCG 에노출된분리세균은 3 mg/ml 이상의농도에서 3 시간이내에완전히살균되었다. EGCG 의노출농도와시간에따라분리세균 MH-8 의 LPS 의양적변화를 SDS-PAGE 와 silver staining 을통하여관찰하였으며, EGCG 에노출된세균의 LPS 는 EGCG 에노출되지않은세균의 LPS ( 대조군 ) 보다상대적으로그양이증가하였으나, 일정농도이상의 EGCG 에노출된분리세균의 LPS 는현저히감소하거나사라지는것이관찰되었다. EGCG 의세포독성효과에저항성을증진시키는데기여하는스트레스충격단백질 (70-kDa DnaK and 60-kDa GroEL) 이 MH-8 의세포배양에다양한농도의 EGCG 에노출됨으로서유도되었다. 주사전자현미경을이용하여 EGCG 에노출시킨세균의외부형태를분석한결과, 움푹패이고불규칙적인형태가관찰되었다. EGCG 에노출된 MH-8 배양의수용성단백질부분에대한 2-DE 에서 18 개의단백질스팟이 EGCG 노출에의해크게변화하는것이확인되었다. Chaperon ( 예, DnaK, GroEL), 장독소 ( 예, aerolysin, phospholipase C precursor), LPS 합성 ( 예, LPS biosynthesis protein, outer membrane protein A precursor), 생합성및에너지대사등에수반되는이들단백질은 MALDI-TOF 를사용한 peptide mass fingerprinting 에의해동정되었다. 결론적으로 EGCG 는식중독원인세균인 Aeromonas sp. MH-8 에대하여상당한항세균효과를가지는것으로밝혀졌다. 또한얻어진결과들은 Aeromonas sp. MH-8 대한 EGCG- 유도스트레스와세포독성의기작을이해하는데중요한단서를제공하게될것이다. Acknowledgements 본연구는순천향대학교학술연구비지원사업의일부지원으로수행되었습니다. REFERENCES 1. Graham, H. N (1992) Green tea composition, consumption, and polyphenol chemistry. Prev. Med. 21: 334-350. 2. Alessio, H. M., A. E. Hagerman, M. Romanello, S. Carando, M. S. Threlkeld, J. Rogers, Y. Dimitrova, S. Muhanned, and R. L. Wiley (2002) Consumption of green tea protects rats from exercise-induced oxidative stress in kidney and liver. Nutr. Res. 22: 1177-1188. 3. Hamilton-Miller, J. M. (1995) Antimicrobial properties of tea (Camella sinensis, L). Antimicrob. Agents Chemother. 39: 2375-2377. 4. Cowan, M. M (1999) Plant products as antimicrobial agents. Clin. Microbiol. Rev. 12: 564-582. 5. Hu, Z. Q., W. H. Zhao, N. Asano, Y. Yoda, Y. Hara, and T. Shimamura (2002) Epigallocatechin gallate synergistically enhances the activity of carbapenems against methicillin-resistant Staphylococcus aureus. Antimicrob. Agents Chemother. 46: 558-560. 6. Yu, M. O., J. W. Chun, and K. H. Oh (2004) Effect of tea catechin, EGCG (epigallocatechin gallate) on killing of oral bacteria. Kor. J. Microbiol. 40: 364-366. 7. Cho, Y. S., J. J. Oh, and K. H. Oh (2011) Synergistic anti-bacterial and proteomic effects of epigallocatechin gallate on clinical isolates of imipenem-resistant Klebsiella pneumoniae. Phytomedicine 18: 941-946. 8. Janda, J. Michael and S. L. Abbott (2010) The genus Aeromonas: taxonomy, pathogenicity, and infection. Clinic. Microbiol. Rev. 23: 35-73. 9. McGarey, D. J., L. Milanesi, D. P. Foley, B Reyes, L. C. Frye, and D. V. Lim (1991) The role of motile aeromonads in the fish disease, ulcerative disease syndrome (UDS). Experientia 47: 441-444. 10. Rahman M., P. C. Navarro, I. Kühn, G. Huys, J. Swings, and R. Möllby (2002) Identification and characterization of pathogenic Aeromonas veronii biovar sobria associated with epizootic ulcerative syndrome in fish in Bangladesh. Appl. Environ. Microbiol. 68: 650-655. 11. Jang, E. H., S. J. Lim, and T. H. Kim (2011) Distribution of antibiotic resistant microbes in aquaculture effluent and disinfection by electron beam irradiation. J. Kor. Soc. Environ. Eng. 33: 492-500. 12. Baek, H., M. S. Choi, and K. H. Oh (2012) Characterization and antibacterial activity of Lactobacillus casei HK-9 isolated from Korean rice wine, makgeolli. KSBB J. 27:161-166. 13. Johnson, K. G. and M. B. Perry (1976) Improved techniques for the preparation of bacterial lipopolysaccharides. Can. J. Microbiol. 22: 29-34. 14. Fomsgaard, A., M. A. Freudenberg, and C. Galanos (1990) Modification of the silver staining technique to detect lipopolysaccharide in polyacrylamide gels. J. Clin. Microbiol. 28: 2627-2631. 15. Bollag, D. M., M. D. Rozycki, and S. J. Edelstein (1996) Protein methods. 2nd ed. New York, Wiley-Liss, USA. 16. Sambrook, J., E. Fritsch, and T. Maniatis (1989) Molecular clonin: A Laboratory Manual. 2nd ed., pp. 23-38. Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, New York, USA. 17. Ho, E. M., H. W. Chang, S. I. Kim, H. Y. Kahng and K. H. Oh (2004) Analysis of TNT (2,4,6-trinitrotoluene)-inducible cellular responses and stress shock proteome in Stenotrophomonas sp. OK- 5. Curr. Microbiol. 49: 346 352. 18. Choi, H. K. and K. H. Oh (2012) Cellular responses of Salmonella typhimurium exposed to the exposure of green tea polyphenols. Kor. J. Microbiol. 48: 87-92. 19. Hara, Y., F. Shahidi, and C. T. Ho (1999) Phytochemicals and phytopharmaceuticals. pp. 214-221. AOCS Press, Champaign, IL, USA. 20. Hajime, I., T. Nakae, Y. Hara, and T. Shimamura (1993) Bactericidal catechins damage the lipid bilayer. Biochim. Biophys. Acta. 1147: 132-136. 21. Shigemune, N., M. Nakayama, T. Tsugukuni, J. Hitomi, C. Yoshizawa, Y. Mekada, M. Kurahachi, and T. Miyamoto (2012) The mechanisms and effect of epigallocatechin gallate (EGCg) on the ger-
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