< 최종보고서 > 목재종식별을위한주요유통수종의 DNA 분석방안마련및검증 2017 년 10 월 31 일 국민대학교산학협력단 한국임업진흥원

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1 < 최종보고서 > 목재종식별을위한주요유통수종의 DNA 분석방안마련및검증 2017 년 10 월 31 일 국민대학교산학협력단 한국임업진흥원

2 < 최종보고서 > 목재종식별을위한주요유통수종의 DNA 분석방안마련및검증 2017 년 10 월 31 일 국민대학교산학협력단 한국임업진흥원

3 제출문 한국임업진흥원장김남균귀하 이보고서를 목재종식별을위한주요유통수종의 DNA 분석방안마련및검증 과제의최종보고서로제출 합니다 주관사업기관명 : 국민대학교산학협력단 주관사업책임자 : 참여연구원 : 국민대학교김태종 국민대학교이자민

4 요약문 Ⅰ. 제목 목재종식별을위한주요유통수종의 DNA 분석방안마련및검증 Ⅱ. 사업배경및목적 l 한국임업진흥원에서수행하고있는임업시험중수종감정은, 국내에서유일하게진행하고있는시험임 - 국내산목재공급실적증가에따른국산재이력관리에활용 - 목재이용량확대에따라목재수입량이매년증가하는추세로, 수입수종에대한정밀식별필요 l 현미경을통한수종감정은목재세포의종류와배열등을파악 - 같은속 ( 屬, genus) 에속하는목재수종중종 ( 種, species) 단위까지불가한경우가있음 l 목재문화재분야및불법벌채목재와관련하여수종감정의중요성이대두되고있음 - 문화재수리표준시방서 상에서목재문화재의복원과수리에사용되는목재는기존목재와동일한국산재수종을사용할것을원칙으로함 - 개발도상국목재의불법벌채가증가함에따라종및산지를식별할수있는기술개발이필요함 l 기존에개발된기술을활용하여목재유통시문제가되고있는수종에대 한종식별방법마련이시급함 * 목재수종감정및종식별을위한 DNA 분석방법타당성조사 (2016 년용역 ) 에서개발한 DNA 추출기술활용 수종감정고도화로의뢰인의불만해소및불법벌채목재의유통질 서확립 - 1 -

5 Ⅲ. 사업내용 l DNA 분석도입이필요한문제유통수종선별 -진흥원에의뢰되는수종중문제되는수종선별및 DNA 정보수집 * Eucalyptus diversicolor, Eucalyptus marginata, Pinus rigida, Pinus palustris, Chamaecyparis obtusa (5수종) l 문제유통수종의 DNA분석유전자 ( 분석마커 ) 도출및개발 -NCBI 정보및문헌조사를통한같은수종간에식별을위한분석유전자발굴 * NCBI (National Center for Biotechnology Information) 미국국립생물정보센터 l 도출된유전자 ( 분석마커 ) 를이용한목재 DNA 분석검증 - DNA 분석검증을통한재현성및실용성확인 - 2 -

6 Ⅳ. 사업결과 가. 문제유통수종의 DNA 분석유전자 ( 분석마커 ) 도출및개발 1) 문제유통수종선별및수종에대한 DNA 정보수집 Eucalyptus 속과 Fokienia hodgisii 수종은전체 chloroplast 유전자가등록. 그외의수종은엽록체유전자가 partial DNA로등록됨. P. resinosa 는 NCBI 에등록된 DNA의수가 13,497개이지만, 그에비하여등록된엽록체 DNA의개수는 partial DNA로 19개에불과. Acer 속과 Chamaecyparis 속, 그리고 Thuja 속또한 partial DNA 로등록. Pinus 속들은 partial DNA라고해도그크기가약 120,000bp, 이에비하여활엽수종들은평균약 2,000bp로매우작은크기만이 partial DNA로등록. Acer saccharinum 는 1,095개의 DNA 중 1,067개의엽록체 DNA가등록되었으나모두 partial DNA 등록. (113p~114p, 표 15) 2) NCBI 정보및문헌조사를통한수종식별을위한분석유전자발굴 32편의문헌검색을통하여 trnl intron, trnl-trnf intergenic spacer, trnk/matk intron 영역들은특정계통에대해서분류학적으로만족스러운정보를나타내며, 그외의그룹에대해서는식물분류학적으로낮은분해능이나타난다는점을확인. 또한특정한몇개의유전자부위에대한연구는그외의다양한유전자부위에대한데이터가부족함확인. (28-29p) 42편의문헌검색과 NCBI 데이터를바탕으로 P. densiflora와 P. resinosa 시료에대한 rpl20 - rps18 non-coding 유전자, P. palustris 와 P. rigida 시료에대한 trnd GUC - trny GUA non-coding 유전자,C. obtusa 와 T. occidentalis 시료에대한 petg trnp non-coding 유전자, E. diversicolor 와 E. marginata 시료에대한 trnw psaj non-coding 유전자, A. saccharum 과 A. saccharinum 시료에대한 trnh-psba non-coding 유전자발굴

7 나. 도출된유전자 ( 분석마커 ) 를이용한목재 DNA 분석방법검증 1) DNA 분석검증을통한재현성및실용성확인 가. 수종간차이를확인하기위하여본실험에서얻은 P. densiflora와 P. resinosa 시료에대한 rpl20 - rps18 유전자의염기서열을비교한결과 2개의부위에서차이가존재하는것을확인.( 그림52) 연구에사용된 P. densiflora와 P. resinosa 의목재시료로부터 DNA의안정적추출확인과동시에 DNA분석방법을이용하여 P. densiflora 와 P. resinosa 시료의구분가능확인. (119p ~ 120p) 나. 수종간의차이를확인하기위하여 P. palustris 와 P. rigida 시료에서얻은 trnd GUC - trny GUA 유전자의염기서열을비교한결과 1개의염기서열에서차이가있음을확인.( 그림 57) 본연구에사용된 P. palustris와 P. rigida 의목재시료로부터 DNA의안정적추출확인과동시에 DNA분석방법을이용하여 P. palustris 와 P. rigida 시료의구분가능확인.(128p) 다. 수종간의차이를확인하기위하여 C. obtusa 와 T. occidentalis 시료에서얻은 petg-trnp 유전자의염기서열을확인할수있음. 각수종의목재시료의안정적 DNA추출, 염기서열분석을위한유전자증폭재현성확인.( 그림 60, 61) 두수종의식별가능한지표유전자제시에따른향후수종식별기술확보. (136p) 라. 두수종간차이를확인하기위하여 E. diversicolor 와 E. marginata 시료에대한 trnw psaj PCR product sequence를비교한결과대부분의염기서열이불치함확인. ( 그림 67) 두목재시료로수종으로부터 DNA의추출, 유전자증폭, 염기서열분석, 시료구분가능.(145p) 마. 수종간의차이를확인하기위하여 A. saccharum 과 A. saccharinum 시료에대한 trnh-psba PCR 유전자의염기서열을비교한결과 4개의서열에서차이가있음을확인.( 그림 72) 두목재시료로수종으로부터 DNA의추출, 유전자증폭, 염기서열분석, 시료구분가능.(153p) - 4 -

8 다. 결과산출물 Ÿ 목재종식별을위한주요유통수종의 DNA 분석방안마련및검증 최종 보고서 Ÿ 특허출원 (1 건 ) - 사포를이용한목분의 DNA 분리방법, 대한민국특허출원번호 : , 2017 년 04 월 07 일 Ÿ 포스터발표 (1건) - 분자생물학적분석을활용한수종감정에서 DNA 추출의효율성증대를위한목재의전처리, 이자민, 오정애, 손석규, 김태종, 2017 한국목재공학회춘계학술대회, 전북대학교, 전주, 대한민국 (2017년 4월 14 15일 ) Ÿ 홍보 (1 건 ) 2017 년 05 월 31 일 순번언론사제목 1 내일신문낡은목재도 DNA 로수종분석 2 이코노믹톡뉴스국내최초, 목재에서 DNA 추출기술개발해특허출원까지 3 동아일보국민대임산생명공학과, 국내최초로 ' 목재 DNA' 추출기술개발 - 5 -

9 < 목차 > < 표차례 > 10 < 그림차례 > 사업의개요 17 가. 사업배경및필요성 17 나. 사업목적 사업의범위및수행방법 20 가. 문헌정보분석을통한수종식별분석유전자선별 20 나. 수종식별을위한선별유전자의확보 21 다. 확보된유전자분석및평가 연구결과 27 가. 목재의수종식별을위한국내외유전자분석사례 27 1) Chloroplast DNA 27 2) Non-coding region 28 3) 수종별분석유전자부위조사 30 나. 소나무 (Pinus densiflora) 를이용한수종식별을위한다양한유전자검증 34 1) trnh GUG psba 37 가 ) Primer 디자인 37 나 ) DNA 추출및유전자증폭 37 다 ) 소나무 (Pinus densiflora) 의 trnh GUG - psba 염기서열 40 라 ) 소나무 (Pinus densiflora) 의 trnh GUG - psba 염기서열분석 41 2) matk 44 가 ) Primer 디자인 44 나 ) DNA 추출및유전자증폭 44 3) trns GCU 5 trng 46 가 ) Primer 디자인 46 나 ) DNA 추출및유전자증폭 46 4) 5 trng 3 trng UUC 48 가 ) Primer 디자인

10 나 ) DNA 추출및유전자증폭 48 다 ) 소나무 (Pinus densiflora) 의 5 trng 3 trng UUC 염기서열 51 라 ) 소나무 (Pinus densiflora) 의 5 trng 3 trng UUC 염기서열분석 52 5) rpob trnc GCA 54 가 ) Primer 디자인 54 나 ) DNA 추출및유전자증폭 54 6) psbm trnd GUC 57 가 ) Primer 디자인 57 나 ) DNA 추출및유전자증폭 57 다 ) 소나무 (Pinus densiflora) 의 psbm trnd GUC 염기서열 60 라 ) 소나무 (Pinus densiflora) 의 psbm trnd GUC 염기서열분석 61 7) trnd GUC trne UUC 63 가 ) Primer 디자인 63 나 ) DNA 추출및유전자증폭 63 다 ) 소나무 (Pinus densiflora) 의 trnd GUC trne UUC 염기서열 66 라 ) 소나무 (Pinus densiflora) 의 trnd GUC trne UUC 염기서열분석 67 8) trnd GUC trny GUA 68 가 ) Primer 디자인 68 나 ) DNA 추출및유전자증폭 68 다 ) 소나무 (Pinus densiflora) 의 trnd GUC trny GUA 염기서열 71 라 ) 소나무 (Pinus densiflora) 의 trnd GUC trny GUA 염기서열분석 71 9) trnfm CAU trns UGA 73 가 ) Primer 디자인 73 나 ) DNA 추출및유전자증폭 73 다 ) 소나무 (Pinus densiflora) 의 trnfm CAU - trns UGA 염기서열 76 라 ) 소나무 (Pinus densiflora) 의 trnfm CAU - trns UGA 염기서열분석 77 10) 5 trnl UAA trnt UGU 79 가 ) Primer 디자인 79 나 ) DNA 추출및유전자증폭 79 다 ) 소나무 (Pinus densiflora) 의 5 trnl UAA trnt UGU 염기서열 82 라 ) 소나무 (Pinus densiflora) 의 5 trnl UAA - trnt UGU 염기서열분석 82 11) 3 trnl UAA - trnl5 - UAA 85 가 ) Primer 디자인

11 나 ) DNA 추출및유전자증폭 85 12) 5 rps12 rpl20 87 가 ) Primer 디자인 87 나 ) DNA 추출및유전자증폭 87 다 ) 소나무 (Pinus densiflora) 의 5 rps12 rpl20 염기서열 90 라 ) 소나무 (Pinus densiflora) 의 5 rps12 rpl20 염기서열분석 91 13) psbb psbh 93 가 ) Primer 디자인 93 나 ) DNA 추출및유전자증폭 93 14) rpl16 95 가 ) Primer 디자인 95 나 ) DNA 추출및유전자증폭 95 다 ) 소나무 (Pinus densiflora) 의 rpl16 염기서열 98 라 ) 소나무 (Pinus densiflora) 의 rpl16 염기서열분석 99 15) rpl20 rps 가 ) Primer 디자인 102 나 ) DNA 추출및유전자증폭 102 다 ) 소나무 (Pinus densiflora) 의 rpl20 - rps18 염기서열 105 라 ) 소나무 (Pinus densiflora) 의 rpl20 - rps18 염기서열분석 ) 수종분석을위한다양한유전자분석 108 다. 다양한수종에서의 DNA 안정적추출검증및염기서열분석 111 1) Pinus densiflora와 Pinus resinosa의비교 115 가 ) Primer 디자인 115 나 ) DNA 추출및유전자증폭 115 다 ) rpl20 - rps18 염기서열 118 라 ) rpl20 - rps18 염기서열분석 119 2) Pinus palustris와 Pinus rigida의비교 124 가 ) Primer 디자인 124 나 ) DNA 추출및유전자증폭 124 다 ) trnd GUC - trny GUA 염기서열 127 라 ) trnd GUC - trny GUA 염기서열분석 128 3) Chamaecyparis obtusa와 Thuja plicata의비교 132 가 ) Primer 디자인

12 나 ) DNA 추출및유전자증폭 132 다 ) petg trnp 염기서열 135 라 ) petg trnp 염기서열분석 135 4) Eucalyptus diversicolor와 Eucalyptus marginata의비교 140 가 ) Primer 디자인 140 나 ) DNA 추출및유전자증폭 140 다 ) trnw psaj 염기서열 143 라 ) trnw psaj 염기서열분석 144 5) Acer saccharum와 Acer saccharinum의비교 149 가 ) Primer 디자인 149 나 ) DNA 추출및유전자증폭 149 다 ) trnh psba 염기서열 152 라 ) trnh psba 염기서열분석 153 6) 목재의유전자식별을위한다양한수종에서의 DNA 안정적추출검증 및염기서열분석결론 과제수행달성도 159 가 ) 문제유통수종의 DNA 분석유전자 ( 분석마커 ) 도출및개발 159 나 ) 도출된유전자 ( 분석마커 ) 를이용한목재 DNA 분석방법검증 정책제안 162 가 ) 산학연협약을통한유전자분석을통한목재수종식별서비스구축 162 나 ) 유전자분석을통한지표유전자발굴방안 164 참고문헌

13 < 표차례 > 표1. 다양한목본수종의계통발생및분류연구에사용되는유전자부위 31 표 2. primer 3 version 0.4.0을이용하여디자인된 P. densiflora의 non-coding 유전자부위 primer 목록 36 표 3. trnh-gug와 psba primer로증폭한유전자의염기서열을 NCBI data base 에검색한결과 41 표 4. 5 trng-2s와 3 trng-uuc primer로증폭한유전자의염기서열을 NCBI data base에검색한결과 52 표 5. psbmf와 trnd-guc primer로증폭한유전자의염기서열을 NCBI data base에검색한결과 61 표 6. trnd-guc와 trne-uuc primer로증폭한유전자의염기서열을 NCBI data base에검색한결과 66 표 7. trnd-guc와 trny-gua primer로증폭한유전자의염기서열을 NCBI data base에검색한결과 71 표 8. trnfm-cau와 trns-uga primer로증폭한유전자의염기서열을 NCBI data base에검색한결과 77 표 9. 5 trnl-uaa와 trnt-ugu primer로증폭한유전자의염기서열을 NCBI data base에검색한결과 82 표 rps12와 rpl20 primer로증폭한유전자의염기서열을 NCBI data base에검색한결과 91 표 11. rpl16f와 rpl16r primer로증폭한유전자의염기서열을 NCBI data base에검색한결과 99 표 12. rpl20-rps18f와 rpl20-rps18r primer로증폭한유전자의염기서열을 NCBI data base에검색한결과 105 표 13. 각 primer에따른유전자증폭여부및염기서열분석여부, NCBI blast 검색결과요약 110 표 14. 해부학적식별의한계가있는유통수종선별 111 표 15. 수종별유전정보수집 114 표 16. P. densiflora와 P. resinosa 시료에대한 rpl20-rps18f, rpl20-rps18r primer로증폭한유전자의염기서열을 NCBI data base에검색한결과

14 표 17. P. palustris와 P. rigida 시료에대한 trnd-guc, trny- GUA primer로증폭한유전자의염기서열을 NCBI data base에검색한결과 128 표 18. C. obtusa와 T. plicata시료에대한 petg, trnp primer로증폭한유전자의염기서열을 NCBI data base에검색한결과 136 표 19. E. diversicolor와 E. marginata 시료에대한 trnw, psaj primer로증폭한유전자의염기서열을 NCBI data base에검색한결과 144 표 20. A. saccharum과 A. saccharinum 시료에대한 trnh, psba primer로증폭한유전자의염기서열을 NCBI data base에검색한결과

15 < 그림차례 > 그림 1. 염기서열분석의뢰결과로분석된각각염기서열의 sequencing 정확도를확인하는데이터결과예 25 그림 2. 양방향으로읽힌염기서열을 align한결과의예 25 그림 년에서 2002년사이에 American Botany, Systematic Botany, Molecular Phylogenetics and Evolution, Plant Systematics and Evolution에게재된 cpdna matk 및 non coding 영역을이용한 445건의계통발생연구추세 [3] 29 그림 4. 담배엽록체의 21가지 non-coding 유전자부위 [3] 35 그림 5. P. densiflora 의 trnh GUG -psba 유전자서열과디자인한 primer의위치 38 그림 6. trnhgug와 psba primer를이용하여소나무시료로부터얻은 DNA의 1차 PCR한결과 (A) 와 2차 PCR한결과 (B) 39 그림 7. NCBI에등록된 P. densiflora 염기서열과 trnh-gug와 psba primer로증폭한유전자의염기서열을 align한결과 42 그림 8. NCBI에등록된여러개의 P. densiflora 염기서열과본실험에서얻은유전자의염기서열을 align한결과 (primer를디자인한보고된유전자이외에 NCBI data base에검색되는 P. densiflora 의 trnh GUG -psba 유전자들을 align) 43 그림 9. P. densiflora의 matk 유전자서열과디자인한 primer의위치 45 그림 10. P. densiflora의 trns GCU 5 trng 유전자서열과디자인한 primer 의위치 47 그림 11. P. densiflora의 5 trng 3 trng UUC 유전자서열과디자인한 primer의위치 49 그림 12. P. densiflora 시료로부터얻은 DNA를 template로하여 primer trng F와 trng-uuc로 1차 PCR한결과 (A) 와 2차 PCR한결과 (B) 50 그림 13. NCBI에등록된 P. densiflora 염기서열과 trng F와 trng-uuc primer로증폭한유전자의염기서열을 align한결과 53 그림 14. P. densiflora의 rpob trnc GCA 유전자서열과디자인한 primer의위치 55 그림 15. P. densiflora 시료로부터얻은 DNA를 template로하여 primer rpob 와 trnc-gca로 1차 PCR한결과 (A) 와 2차 PCR한결과 (B)

16 그림 16. P. densiflora의 psbm trnd GUC 유전자서열과디자인한 primer의 위치 58 그림 17. P. densiflora 시료로부터얻은 DNA를 template로하여 primer psbmf와 trnd-guc-r로 1차 PCR한결과 (A) 와 2차 PCR한결과 (B) 59 그림 18. NCBI에등록된 P. densiflora 염기서열과 psbmf과 trnd-guc primer 로증폭한유전자의염기서열을 align한결과 62 그림 19. P. densiflora의 trnd GUC trne UUC 유전자서열과디자인한 primer의 위치 64 그림 20. P. densiflora 시료로부터얻은 DNA를 template로하여 primer trnd-guc-f와 trne-uuc로 1차 PCR한결과 (A) 와 2차 PCR한결과 (B) 65 그림 21. NCBI에등록된 P. densiflora 염기서열과 trnd-guc와 trne-uuc primer로증폭한유전자의염기서열을 align한결과 67 그림 22. P. densiflora의 trnd GUC trny GUA 유전자염기서열과디자인한 primer의위치 69 그림 23. P. densiflora 시료로부터얻은 DNA를 template로하여 primer trnd-guc-f와 trny-gua로 1차 PCR한결과 (A) 와 2차 PCR한결과 (B) 70 그림 24. NCBI에등록된 P. densiflora 염기서열과 trnd-guc와 trny-gua primer로증폭한유전자의염기서열을 align한결과 72 그림 25. P. densiflora의 trnfm CAU - trns UGA 유전자서열과디자인한 primer 의위치 74 그림 26. P. densiflora 시료로부터얻은 DNA를 template로하여 primer trnfm-cau와 trns-uga로 1차 PCR한결과 (A) 와 2차 PCR한결과 (B) 75 그림 27. NCBI에등록된 P. densiflora 염기서열과 trnfm-cau와 trns-uga primer로얻은유전자의염기서열을 align한결과 78 그림 28. P. densiflora의 5 trnl UAA trnt UGU 유전자서열과디자인한 primer의위치 80 그림 29. P. densiflora 시료로부터얻은 DNA를 template로하여 primer 5 trnl-uaa와 trnt-ugu로 1차 PCR한결과 (A) 와 2차 PCR한결과 (B) 81 그림 30. NCBI에등록된 P. densiflora 염기서열과 5 trnl-uaa와 trnt-ugu primer로증폭한유전자의염기서열을 align한결과 83 그림 31. NCBI에등록된여러개의 P. densiflora 염기서열과본실험에서얻 은유전자의염기서열을 align한결과 (primer를디자인한보고된유전자이 외에 NCBI data base에검색되는 P. densiflora의 5 trnl UAA trnt UGU 유전 자의 align)

17 그림 32. P. densiflora의 3 trnl UAA - trnl5 UAA 유전자서열과디자인한 primer의위치 86 그림 33. P. densiflora의 5 rps12 - rpl20 유전자서열과디자인한 primer의 위치 88 그림 34. P. densiflora 시료로부터얻은 DNA를 template로하여 primer 5 rps12와 rpl20로 1차 PCR한결과 (A) 와 2차 PCR한결과 (B) 89 그림 35. NCBI에등록된 P. densiflora 염기서열과 5 rps12와 rpl20 primer로 증폭한유전자의염기서열을 align한결과 92 그림 36. P. densiflora의 psbb psbh 유전자서열과디자인한 primer의위 치 94 그림 37. P. densiflora의 rpl16 염기서열과디자인한 primer의위치 96 그림 38. P. densiflora 시료로부터얻은 DNA를 template로하여 primer rpl16f와 rpl16r로 1차 PCR한결과 (A) 와 2차 PCR한결과 (B) 97 그림 39. NCBI에등록된 P. densiflora 염기서열과 rpl16f와 rpl16r primer로 얻은유전자의염기서열을 align한결과 100 그림 40. NCBI에등록된여러개의 P. densiflora 염기서열과본실험에서얻 은유전자의염기서열을 align한결과 (primer를디자인한보고된유전자이 외에 NCBI data base에검색되는 P. densiflora의 rrpl16 non-coding 유전자 의 align) 101 그림 41. P. densiflora의 rpl20 - rps18 유전자서열과디자인한 primer의위 치 103 그림 42. P. densiflora 시료로부터얻은 DNA를 template로하여 primer rpl20-rps18f와 rpl20-rps18r로 1차 PCR한결과 (A) 와 2차 PCR한결과 (B) 104 그림 43. NCBI에 등록된 P. densiflora 염기서열과 rpl20-rps18f와 rpl20-rps18r primer로증폭한유전자의염기서열을 align한결과 106 그림 44. NCBI에등록된여러개의 P. densiflora 염기서열과본실험에서얻 은유전자의염기서열을 align한결과 (primer를디자인한보고된유전자이 외에 NCBI data base에검색되는 P. densiflora의 rpl20 - rps18 non-coding 유전자의 align) 107 그림 45. 세포의종류와구조가유사하여현미경상의식별이어려운수종의 현미경사진 ( 접선단면 ) (A) P. plaustris (B) P. rigida 112 그림 46. 세포의종류와구조가유사하여현미경상의식별이어려운수종의 현미경사진 ( 횡단면 ) (A) E. diversicolor (B) E. marginata

18 그림 47. 세포의종류와구조가유사하여현미경상의식별이어려운수종의현미경사진 ( 횡단면 ) (A) C. obtusa (B) T. plicata 113 그림 48. 목재시편에서얻은 DNA를 template로하여 rpl20 - rps18f와 rpl20-rps18r primer로증폭하여얻은유전자 (a) P. densiflora; (b) P. resinosa 116 그림 49. NCBI에등록되어있는 P. densiflora와 P. resinosa의 rpl20 rps18 non-coidng 유전자의염기서열비교및 primer 디자인 117 그림 50. NCBI에등록된 P. densiflora의 rpl20 - rps18 non-coding 염기서열과본실험에서 P. densiflora로부터얻은유전자염기서열의 align한결과 121 그림 51. NCBI에등록된 P. resinosa의 rpl20 - rps18 non-coding 염기서열과본실험에서 P. resinosa로부터얻은유전자염기서열의 align한결과 122 그림 52. 본실험에서 P. densiflora와 P. resinosa로부터얻은유전자염기서열의 align한결과 123 그림 53. 목재시편에서얻은 DNA를 template로하여 trnd-guc와 trny-gua primer로증폭하여얻은유전자 (a) P. palustris; (b) P. rigida 125 그림 54. NCBI에등록되어있는 P. palustris와 P. rigida의 trnd GUC - trny GUA non-coding 유전자의염기서열비교및 primer 디자인 126 그림 55. NCBI에등록된 P. palustris의 trnd GUC - trny GUA non-coding 염기서열과본실험에서 P. palustris로부터얻은유전자염기서열의 align한결과 129 그림 56. NCBI에등록된 P. rigida의 trnd GUC - trny GUA non-coding 염기서열과본실험에서 P. rigida로부터얻은유전자염기서열의 align한결과 130 그림 57. 본실험에서 P. palustris와 P. rigida로부터얻은유전자염기서열의 align한결과 131 그림 58. 목재시편에서얻은 DNA를 template로하여 petg와 trnp primer 로증폭하여얻은유전자 (a) C. obtusa (b) T. plicata 133 그림 59. NCBI에등록되어있는 C. obtusa와 T. occidentalis의 petg - trnp non-coding 유전자의염기서열비교및 primer 디자인 134 그림 60. NCBI에등록된 C. obtusa 의 petg - trnp non-coding 염기서열과본실험에서 C. obtusa로부터얻은유전자염기서열의 align한 137 그림 61. NCBI에등록된 T. occidentalis의 petg - trnp non-coding 염기서열과본실험에서 T. plicata로부터얻은유전자염기서열의 align한결과

19 그림 62. 본실험에서 C. obtusa와 T. plicata로부터얻은유전자염기서열의 align한결과시료에대한 139 그림 63. NCBI에등록되어있는 E. diversicolor와 E. marginata의 trnw psaj 유전자간의염기서열비교및 primer 디자인 141 그림 64. 목재시편에서얻은 DNA를 template로하여 trnw, psaj primer로증폭하여얻은유전자 (a) E. diversicolor (b) E. marginata 142 그림 65. NCBI에등록된 E. diversicolor의 trnw psaj non-coding 염기서열과본실험에서 E. diversicolor로부터얻은유전자염기서열의 align한결과 146 그림 66. NCBI에등록된 E. marginata의 trnw psaj non-coding 염기서열과본실험에서 E. marginata로부터얻은유전자염기서열의 align한결과 147 그림 67. 본실험에서 E. diversicolor와 E. marginata로부터얻은유전자염기서열의 align한결과 148 그림 68. NCBI에등록되어있는 A. saccharum과 A. saccharinum의 trnh - psba 유전자의염기서열비교및 primer 디자인 150 그림 69. 각수종으로부터얻은 DNA를 template로하여 trnh, psba primer로증폭하여얻은유전자 (a) A. saccharum (b) A.saccharinum 151 그림 70. NCBI에등록된 A. saccharum 의 trnh - psba non-coding 염기서열과본실험에서 A. saccharum로부터얻은유전자염기서열의 align한결과 154 그림 71. NCBI에등록된 A. saccharinum의 trnh - psba non-coding 염기서열과본실험에서 A. saccharinum로부터얻은유전자염기서열의 align한결과 155 그림 72. A. saccharum과 A. saccharinum로부터얻은유전자염기서열의 align한결과

20 1. 사업의개요 가. 사업배경및필요성 목재의수종식별은다음과같은목적에서필요하다. l l l l l l 목재활용을위한필수기초자료로이용이용목적에부합하는목재사용판별목조문화재의복원을위한동일한목재수종검증 ( 목재문화재는복원과수리를위해기존목재와동일한국내산수종으로대체해야함 ( 문화재수리표준시방서, 2014)) 법률적관리가필요한목재수종의관리목재한약재의감정목재의산지를식별 한국임업진흥원에서는목재의수종감정서비스를국내유일하게제공하고있다. 2014년에수종감정서비스가수요가 1,540건이었던것이 2015 년에 2,682건으로급격히 (74%) 증가하고있다. 현재의목재수종감정은현미경을이용하여해부학적으로목재가가지고있는세포조직의종류와배열등을관찰하고이를비교하여식별하는방법으로이루어지고있다. 이러한방법은가까운수종끼리식별하기어려운경우가일부발생하고있다. 이러한해부학적목재식별방법의한계를보완하기위한방안으로분자생물학적기술을이용한유전자분석을통하여수종을식별하는연구가주목받고있다. 그러나과거에는목재로부터 DNA를추출하고이를활용하여원하는유전자의염기서열을안정적으로얻을수없었다. 본연구에서는현재해부학적목재식별방법에의해감정이어려운 5쌍 (10종) 의수종을선정하여유전자를분석을통해주어진비교목재시료사이의식별이가능한지실증하고자한다. 이는선행연구 ( 용역과제계약번호 : ) 에서제안한목재로부터 DNA를추출하는새로운방법을다양한다른수종에적용하여실증함으로써제안된새로운 DNA 추출방법의가능성을확대하여실증한다. 비록많은수종의경우대표성을가지는충분한유전자가확보되지못해상

21 업적목재의수종식별을위한지표유전자가제안되지못하고있으나, 일부수종의경우지표유전자가제안되고있으며꾸준한연구를통해목재수종식별을위한기반자료가축적되고있다. 향후상업적수종식별을위한지표유전자가제안된다면본연구의결과를이용해다양한목재에서 DNA를추출하고유전자분석을통해목재의수종식별을위한가능성을제시하고자한다. 목재는이미죽은세포로다양한환경에오랜시간노출되어세포내의 DNA가절편화되어있으며추출하기에어려운상태이다. 이와같은이유로유전자분석을통하여수종을식별하는연구가주목받고있음에도불구하고상업적수종식별을위한방법의개발에진전이없었으며목재의식별을위한지표유전자의발굴에도실용성의한계때문에연구투자가미흡하였다. 본연구를통해다양한목재시료로부터안정적으로 DNA를추출하고, 이를통해원하는유전자의염기서열을확보될수있으며확보된염기서열을비교하여목재시료간의식별이가능함을실증하고자한다. 이는분자생물학적유전자분석에의한목재수종식별을위한방법의개발에있어가장큰문제였던목재로부터 DNA의추출방법을제시하여해결함으로써유전자분석에의한목재수종식별의실용성을제안한다. 본연구의실증을통해목재수종식별을위한지표유전자의발굴에많은연구가진행되고향후한국임업진흥원에서해부학적목재수종식별의보완방법으로유전자분석을통한목재수종식별서비스제공을위한계기가될수있을것이다

22 나. 사업목적 l 앞선용역과제 목재수종감정및종식별을위한 DNA 분석방법타당성 조사 의성공적인수행을통해유전자를이용한목재의수종식별타당성 확인 l 본연구에서는앞선용역과제의타당성결과를이용하여현재수종분석서비스가제공되고있으나, 해부학적수종식별에어려움이있는수종을중심으로 DNA에의한목재수종감정을실증하고서비스에적용하는기초가되고자함

23 2. 사업의범위및수행방법 가. 문헌정보분석을통한수종식별분석유전자선별 한국임업진흥원에의뢰되는여러수종중해부학적으로세포의종류와그배열이비슷하여현미경관찰을통한식별이어려운수종을 5쌍 (10종) 을선정하였다. 1991년부터 2014년도까지의목본식물의계통발생과식물분류에활용된유전자연구의참고문헌을조사하여현재계통분류학적으로활용되는유전자부위와그한계를확인하였다. Non-coding부위의 trnt, trnl-trnf, atpb-rbcl intergenic spacer, trnk/matk intron 부위의연구가많이이뤄졌으나특정수종에대해서만분류학적으로적절한정보를제공하며, 그외의여러수종에대해서는낮은분해능으로인하여추가적인유전자부위의연구가필요하다. 선정된두수종 (5쌍) Eucalyptus 속, Pinus 속, Acer 속, Thuja 속, Chamaecyparis 속관련하여분자생물학적인방법으로각쌍의두수종을식별하기위한유전자부위에대하여조사하였다. Pinus 속의경우식물계통, 분류학적연구가다른속에비하여비교적많은연구가되어있었지만그외의수종에대한연구는부족하였다. 또한각속수준에서특정수종에대해서만연구가주로되어있었고, 그외의종에대한연구는부족하였다. 이는유전자의염기서열을확인하여종수준의식별을하기위한분자생물학적연구가다양한종에이뤄지지않고있음을확인할수있고, 따라서보다나은분자생물학적방법을이용한수종감정을위해서는다양한수종에대한여러유전자부위의확인및그검증이필요하다

24 나. 수종식별을위한선별유전자의확보 많은식물의분류연구에상호비교에많은장점을가지고있는엽록체유전자를이용하고있으며, 이를통해많은엽록체유전자정보가축적되어가고있다. 목재식별을위한유전자를선정하는데이와같은유리한점이있는엽록체유전자를이용하는것이바람직하다. 또한, 목재는이미죽은세포로건조되어오랜시간동안다양한환경에노출된다. 이로인해목재안에존재하는 DNA는대부분손상되고절편화되어있다. 따라서수종식별을위한유전자는하나의세포에한쌍씩만존재하는 chromosomal DNA보다는많은수가존재하는엽록체의 DNA를확보하는것이보다안정적인목재식별을위해유리하다. 일반적으로수종식별을위한분석유전자는엽록체 DNA에서생물학적기능에관련되지않는염기서열인 non-coding 부위를이용한다. 그이유는생물학적기능과관련된유전자는염기서열변화 ( 돌연변이 ) 에의해기능이상실될가능성이있으며, 이로인해세포가사멸하게되어다양한염기서열의변화를관찰하기어려운문제점이발생하기때문이다. 그러나유전자를 non-coding하는부위는염기서열의변화를쉽게받아들일수있다. 하지만무엇보다식별이필요한두수종간의관계에따라 coding 부위와 non-coding 부위를적절히선택하여이용하는것이바람직하다. 목재의수종을식별하기위해서는시료의관계가중요하다. 비교하고자하는목재수종의관계에따라분석하는유전자를달리하여야하며, 동일한목재의시료를식별할때, 시료사이의분류학상차이가속 (genus) 간인지, 종 (species) 간인지, 아종간인지, 지역의집단간인지, 개체간인지에따라분석하여야하는유전자가달라져야한다. 따라서다양한수종식별을위한분석유전자를결정하기위해서는충분히많은대표성을가지는시료를확보하고이들의유전정보를체계적으로정리하여지표유전자를도출하는것이바람직하며이를위해많은연구가필요하다. 본연구에서는추후의연구에의해수종식별을위한적절한지표유전자가제시되면본연구그룹이새로이제안한특허방법에의해목재시료로부터유전자의확보가가능하다는것을확증하고자한다. 이에본실험에서는상업적으로이용가능한지표유전자를제시하지않지만문헌을통해제시된유전자를선정하고이를이용하여본연구에서주어진 5쌍의시료가유전자분석에의해수종식별이가능한지실증하였다. 이를위해다음과같은연구단계를수행하였다

25 l l l l 문헌분석을통해선별된유전자증폭을위한 primer 제작목재로부터 DNA 추출중합효소연쇄반응 (Polymerase Chain Reaction) 을이용한유전자증폭증폭된유전자의크기를이용한확보유전자의평가 구체적인실험방법은다음과같다. 1. 시료준비 1) 60grit 사포를이용하여멸균된시편의여섯면을사포질통하여표면을 두께약 0.1cm 제거하고, 사용한사포와시료를모두버린다. 2) 70% ethanol 을이용하여실험대의불순물을제거, 세척한다. 3) 멸균된새로운사포한장을꺼내어시편의횡단면방향으로갈아준다. 4) 분쇄한시료를 1.5ml 에펜튜브에 20mg 씩소분한다. 5) 수화를위해멸균된 3 차증류수 200 μl를첨가하여 vortex 한다. 6) 2 일동안 4 냉장고에서수화시키고, 24 시간마다 vortexing 하여시료 와용액이혼합되도록한다. 2. DNA 추출 _ Qiagen DNeasy Plant Mini kit (Cat. No ) 1) 4 냉장고에서꺼내어 3 차증류수를처리한시료에 Ap1 buffer 600 μl, RNase A 6 μl (100mg/ml) 를첨가한다. 2) Vortexing 을강하게하여모든시료가충분히섞이도록한다. 3) 65 에서 10 분간반응시키면서 2 분간격으로꺼내어위아래로뒤집으

26 며섞는다. 4) P3 buffer 260 μl를넣고위아래로뒤집으며섞는다. 5) 충분히섞인시료는 5 분간얼음속에넣어정치시킨다. 6) 13,500rpm 으로 10 분간원심분리한다. 7) 끝을자른팁을이용하여상층액만취한후 QIAspin column 에옮겨담 은후 13,500rpm 으로 2 분간원심분리한다. 8) Collection tube 에모인용액을새로운에펜튜브 (#1) 에옮겨담는다. 9) 7) 번과정을반복하여, 또다른새로운에펜튜브 (#2) 에옮겨담는다. 10) 얻어진용액의 1.5 배의 AW1 buffer 를각에펜튜브에첨가한후바로 끝이잘린팁을이용하여피펫팅을한다. 11) 650 μl를따서 DNeasy Mini spin column 에옮겨담는다. 12) 8,000rpm 에서 1 분간원심분리를한다. 13) 흘러내려온용액은버리고, 나머지용액을 column에넣은후 8,000rpm 에서 1분간원심분리를한다. ( 에펜튜브 #1, #2에들어있는모든용액을하나의 DNeasy Mini spin column에 11~13번과정으로반복하여진행한다.) 14) Column 에새로운 collection tube 를장착한후 column 에 AW2 buffer 를 500 μl넣고 8000rpm 에서 1 분간원심분리한다. 15) 흘러내려온용액만버리고 collection tube 를재장착한후, AW2 buffer 500 μl를넣고 13,500rpm 에서 2 분간원심분리를한다. 16) 흘러내려온용액과 collection tube 를버리고새로운에펜튜브를장착

27 한후킴테크를덮어놓고상온에서 column 40 분동안건조시킨다. 17) AE buffer 50 μl를 column 중앙에직접적으로분지하고 5 분간정치한 다. 18) 8,000rpm 에서 1 분간원심분리한다. 19) -20 냉동보관한다. 3. Primer 디자인및유전자증폭 1) NCBI 데이터를바탕으로 primer3 (V.0.4.0) 를이용하여디자인한다. ( 2) DNA template, dntp, buffer, taq polymerase, primer forward, primer reverse 를혼합한다. 3) 일반적으로타겟으로하는유전자부위에 primer가붙을수있는적정온도는디자인된 primer 마다다르다. 이에맞는온도조건을조정하여 PCR을진행한다. ( 실험에서진행된온도조건은아래에구체적으로서술해놓았음.) 4) 전기영동 (electrophoresis) 을통하여타겟으로하는유전자가증폭되었 는지확인한다. 4. 염기서열분석의뢰 1) 증폭시킨유전자산물의염기서열분석을의뢰한다. 2) 결과데이터인염기서열 text file과 chromatogram file을비교를통하여염기서열분석시이뤄지는오류를확인한다. ( 일반적으로서열의초반 50bp까지는분석이깨끗하게이뤄지지않기때문에인위적으로삭제해주며, 이를보완하기위하여양방향으로염기서열분석을의뢰한다.)

28 그림 1. 염기서열분석의뢰결과로분석된각각염기서열의 sequencing 정 확도를확인하는데이터결과예. 3) Vector NTI 프로그램을활용하여분석된양방향의염기서열을 align 한 다. 그림 2. 양방향으로읽힌염기서열을 align 한결과의예 4) Align 된염기서열을 assemble 하여하나의염기서열을만든다

29 다. 확보된유전자분석및평가 행하였다. 확보된염기서열의분석을위해다음과같은 4 단계의비교분석을수 Ÿ Ÿ Ÿ Ÿ 유전자의비교분석을위해선별된유전자의 Data base (NCBI 자료 ) 상의염기서열을두시료의등록된염기서열을비교분석하여원하는염기서열의차이가무엇인지제시하였다. 확보된비교수종 1번의유전자염기서열을이용하여기존의 Data base (NCBI 자료 ) 에서등록된유전자를탐색하여유사유전자들을도출하였으며이들의비교를통해수종을확인하였다. 확보된비교수종 2번의유전자염기서열을이용하여기존의 Data base (NCBI 자료 ) 에서등록된유전자를탐색하여유사유전자들을도출하였으며이들의비교를통해수종을확인하였다. 확보된비교수종 1번의유전자염기서열과확보된비교수종 2번의유전자염기서열을비교하여두수종간의유전자차이를확인하고앞서제시된기존의 Data base (NCBI 자료 ) 에서제시된차이점과비교하였다. 이를통해본연구에서제시된두수종간유전자염기서열을비교하 여수종식별가능성을평가하였다

30 3. 연구결과 가. 목재의수종식별을위한국내외유전자분석사례 1) Chloroplast DNA 대표적으로식물의식별을위한유전자로 chloroplast DNA (cpdna), mitochondria DNA, nuclear DNA의연구가이뤄지고있다.[30] 그중 cpdna 는식물이살아가는데필수적인유전자로써식물식별및식물종간의유전적관계를확립하기위한도구로광범위하게사용되고있다.[1,2] 서로다른엽록체의유전자좌 (locus) 는진화적으로가깝고, 먼거리에있는식물종을구별하기위해사용되어왔지만모든식물종을구별할수있는단일유전자좌는발견되지않은것으로알려져있다.[1] 이러한엽록체 DNA는다른 DNA에비하여단일세포당많은 copy수를가지고있기때문에상대적으로잔존되어있을확률이높은장점이있으며, 침엽수를제외한수종에서는모계유전이이뤄지고, 돌연변이가낮으며, 감수분열에의한교차가없기때문에과 (family), 강 (order) 수준에서고등식물에대한계통발생학적인정보를제공하기에적절한유전자라고알려져있다.[30] 초기의식물분자연구는이러한엽록체 DNA를이용한제한효소다형성연구를통하여식물분자수준의연구를진행하였으나 DNA sequencing 기술이가능해짐에따라 cpdna의유전자서열에대한비교연구가시작되었다.[7,8,9] 1993년, rbcl (ribulose-1,5-bisphosphate carboxylase) 의서열을이용하여속 (genus) 보다상위분류에대한연구가진행되었다.[10] 이유전자는광합성에중요한역할을하는유전자서열로이를이용한 DNA 종의식별에서식물의 과 와 강 을확인하는데사용되나대부분의식물에똑같은유전자염기서열이존재하기때문에보다자세한식물의식별이어렵다는단점이있었다.[30]

31 2) Non-coding region 대부분의식물의분류학적으로낮은수준의종간관계를해결하기위한 coding (genic) DNA의한계로인하여엽록체의 non-coding 시퀀스의비교분석을통한식물분류학연구에대한관심이증가하고있다.[3,6] ( 그림3) 이러한 non-coding 부위는염기서열의돌연변이발생빈도가높고, coding (genic) 부위에비해진화의속도가빠르다는특징을가지고있기때문에, 진화연구와종간유전자마커개발에많이활용되고있고, 실제로상당수 non-coding 영역의계통발생학연구에서잠재적인유용성을입증하였다.[4,5] 이러한 non-coding 영역은 trnt, trnl-trnf, atpb-rbcl intergenic spacer, trnk/matk intron 영역이우선적으로연구가되었고, 그림3 에서확인할수있듯이, 445건의연구중 342건 (77%) 이 trnk/matk intron영역또는 trnl-trnf intergenic space영역을이용하여식물분류학연구를진행하고있다. 이는엽록체 DNA를이용한계통발생연구가매년증가함에따라특정유전자부위에대한의존도역시증가하고있음을의미한다. 다시말해, 특정유전자에대한연구가편중되어있고, 이에비해다른유전자부위는느린속도로진행되고있음을의미한다. 문제는 trnl intron, trnl-trnf intergenic spacer, trnk/matk intron 영역들은특정계통에대해서분류학적으로만족스러운정보를나타내며 [11], 그외의그룹에대해서는식물분류학적으로낮은분해능이나타난다는점이다 [39]. 또한특정한몇개의유전자부위에대한연구는그외의다양한유전자부위에대한데이터가부족하다는것을의미한다

32 그림 년에서 2002년사이에 American Botany, Systematic Botany, Molecular Phylogenetics and Evolution, Plant Systematics and Evolution에게재된 cpdna matk 및 non coding영역을이용한 445건의계통발생연구추세 [3]

33 3) 수종별분석유전자부위조사 1991년부터 2014년도까지의목본식물의계통발생과식물분류에활용된유전자연구의참고문헌을조사한결과, 32편의문헌중활엽수를대상으로연구된결과가주를이루었으나연구된수종이다양하지않음을확인할수있었다. 침엽수를대상으로한유전자연구는 12편에불과하였다. 주로연구가되고있는 non-coding 영역인 trnt, trnl-trnf, atpb-rbcl intergenic spacer, trnk/matk intron 부위에관련한연구논문은 32편의중 22편에서확인할수있었고, 그외의유전자부위에대한연구는미비한것을확인할수있었다. 이는각수종의다양한유전자에대한연구가아직부족함을의미한다. 이번과제에서연구될수종에따라살펴보면, Eucalyptus 속, Pinus 속, Acer 속, Thuja 속, Chamaecyparis 속중, Pinus 속과 Acer 속에관한유전자연구가가장많았으나본연구에서사용될수종에대한구체적논문은 Acer 속에서찾아보기어려웠다. 이는속수준의연구는비교적많이이뤄지고있으나다양한수종에대해서는연구가미비함을의미한다. Eucalpytus 속은대부분의연구된수종이 Eucalyptus globulus 로매우제한적이었다. 또한 Thuja 속, Chamaecyparis 속에관한연구논문이가장미비한것으로나타났다. 결론적으로같은속에대해서다양한수종에대한연구가미비할뿐만아니라한수종에대한식별가능한여러유전자부위의연구또한부족한것을확인할수있다

34 표 1. 다양한목본수종의계통발생및분류연구에사용되는유전자부위 수종유전자참고문헌 Pinus nigra ( 유럽곰솔 ) trnl gene, trnt trnl 5' exon, trnl 3' exon, trnf 5 Cunninghamia Lanceolata ( 넓은잎삼나무 ) psbc and trns intergenic spacer, ycf3 intron, trnn - trnr intergenic spacer Aquilaria malaccensis ( 침향속 ) trnl-trnf intergenic spacer 26 Pinus sp. ( 소나무속 ) rbcl, matk, trnh -psba 27 Cryptomeria japonica ( 삼나무 ) rbcl 침엽수 C. pisifera, C. obtusa, C. lawsoniana, C. formosensis, C. taiwanensis, C. thyoides, C. nootkatensis, Thuja occidentalis, Platycladus orientalis, Cupressus cashmeriana,calocedrus formosana, Juniperus chinensis trnv intron, petg - trnp intergenic spacer Thuja plicata ( 서약측백나무 ) microsatellit 34 P. densiflora, P. densiflora for. multicaulis, P. sylvestris, P. rigida, P. rigitaeda, P. koraiensis, P. bungeana Pinus densiflora, Pinus sylvestris, Thuja plicata, Acer carpinifolium. Juniperus ( 노간주나무속 ), Picea ( 가문비나무 ), Pinus sp. ( 피너스속 ) trnt(ugu) - trnl(uaa) intergenic spacer 35 trns gene and the adjacent psbc gene 38 matk Mexican pine species, Picea species (Pinus nelsonii, P. pinceana, P. hartwegii ) trnl gene, trnt trnl 5' exon, trnl 3' exon, trnf 40 Strobus,Cathaya argyrophylla, Larix decidua, Pseudolarix amabilis, Keteleeria rbcl, matk, trnv intron, rpl20-rps

35 davidiana, Abiesnumidica, Pinaceae Ginkgo biloba ( 은행나무 ), Salix babylonica ( 수양버들 ), Robinia pseudacacia ( 아까시나무 ), A. pseudoplatanus ( 개버즘단풍 ), A. platanoides ( 노르웨이단풍 ) trnl gene, trnt trnl 5' exon, trnl 3' exon, trnf 5 활엽수 Cyclobalanopsis species ( 가시나무아속 ) trnl-trnt intergenic spacer 13 Quercus petraea ( 페트라참나무 ) trnd - trnt, 5S ribosomal DNA, mitochondrial: cox2-1/2 nad4-3/4 14 Quercus ( 상수리나무 ) trnd - trnt intergenic spacer, trnc - trnd intergenic spacer, trnk intron 15 Quercus ( 상수리나무 ) trnl intron trnd - trnt intergenic spacer French oak populations (comprising Quercus robur trnd - trnt intergenic regions, tnrc and Quercus petraea) ( 참나무 ) -trnd intergenic regions, trnk intron Shorea selanica, Shorea leprosula, Shorea parvifolia trnk intron, 5 trns, trng intron, ORF77 ( 사라수속 ), Dryobalanobs, Hopea plagata, Dipterocarpus - ORF82 intergenic, rpl2-rps19 kerrii intergenic, rpl2-rps19 intergenic spacer Quercus ( 상수리 ) trnt - trnf intergenic spacer, trnd - trnt intergenic spacer Olive wood trnt-trnl spacer, ITS1 20 Quercus robur ( 상수리 ) trnd-trnt intergenic spacer, trnc - trnd intergenic spacer, psa-trns intergenic spacer Cannabis sativa ( 대마, 뽕나무과의 1 년생식물 ) Nuclear and chloroplast DNA: Inter Transcribed spacer(its) region of the ribosomal DNA ITS4, ITS5, trnl - trnf intergenic spacer

36 Dipterocarpaceae ( 이엽시과식물 ), dipterocarp wood, non-dipterocarp wood trnl - trnf intergenic spacer 23 Catalpa bungei ( 오동나무 ), Fraxinus chinesis ( 물푸레나무 ) psbc and trns intergenic spacer, ycf3 intron, trnn - trnr intergenic spacer 24 Shorea species ( 이엽시과 ) trnl intron, trnl - trnf intergenic spacer, trnh - trnk intergenic spacer, trnk - psbc intergenic spacer Quercus petraea rbcl, matk, trnh -psba 27 Sandal wood ( 단향속 ) rbcl, matk, trnh-psba 28 Eucalyptus globulus microsatellites Eucalyptus globulus, E. dalrympleana, E. archeri, E. morrisbyi, E. vernicosa Aceraceae (Acer palmatum,a. robustum, A. miaotaiense, A. negundo, A. truncatum ) rpl2 - trnh, rpl2 - rpl22 32 matk, rbcl, ITS, trns-trng 36 Blank mape, sugar maple ndha intron 37 Acer and Dipteronia ( 칠엽수아과 ) psbm-trnd and trnd-trnt intergenic spacer 42 Acer pycnanthum ( 꽃단풍 ) trnl - trnf intergenic spacer, atpb-rbcl intergenic spacer, trnh-psba intergenic spacer

37 나. 소나무 (Pinus densiflora) 를이용한수종식별을위한다양한유 전자검증 선행연구 ( 용역과제계약번호 : ) 에서새로운방법에의해엽록체유전자가추출되고확보된소나무 (P. densiflora) 목재로부터 DNA 를추출하는새로운방법을제안하고이를활용하여 3가지수종 ( 소나무, 구주적송, 해송 ) 을성공적으로식별할수있음을보여주었다. 2005년발표된논문에서담배로부터 21개의다양한엽록체 non-coding 부위를유전자로분석하여계통학적분석에이용한연구가보고되었다.[3] 이에본연구에서는제안된 21개의유전자부위를 National Center for Biotechnology Information의 data base에등록되어있는소나무 (P. densiflora) 엽록체의전체유전자 (NCBI 등록번호 : JN854210) 와그림 4의 noncoding 부위를비교하여 15개의유전자부위를확인하였다. 이 15개소나무유전자를 P. densiflora 목재시료로부터확보할수있는지확인하기위하여제안된새로운방법을이용하여 DNA를추출하고이를 template로이용하여중합효소연쇄반응을수행하여유전자를확보하였다. 확인된 15개유전자부위를증폭하기위해소나무 (P. densiflora) 엽록체의전체유전자 (NCBI 등록번호 : JN854210) 를바탕으로 primer 3 version 0.4.0을이용하여 primer를디자인하였다.( 표 2) 증폭하고자하는유전자의크기는 1,000개의염기쌍이하이었으며 15개유전자의평균염기서열크기는 630개의염기쌍이었다. Primer 의 melting 온도 (Tm) 는 60 부근이었다. GC 함량 (GC%) 은 36 63% 로분석하고자하는유전자의부위에따라다양하였으나대부분은 45 55% 범위의 GC 함량을나타냈다

38 그림 4. 담배엽록체의 21 가지 non-coding 유전자부위 [3]

39 표 2. primer 3 version 을이용하여디자인된 P. densiflora 의 non-coding 유전자부위 primer 목록 연번 유전자부위 방향 Primer 이름 염기서열 (5 3 ) T m GC% 크기 (bp) 1 trnh GUG - psba F trnh-gug ttggtccacttggctacgtc R psba atgcacgaacgtaatgctca matk F matk cagaaatttgatccgggttg R matk ttcctggcaaaagatacagga trns GCU - 5'trnG F trns-gcu gtccgctcagccatctctc R trng R ctatacccgccacgatctga 'trnG - 3'trnG UUC F trng F cagatcgtggcgggtatagt R trng-uuc cgttagcttggaaggctagg rpob - trnc GCA F rpob ggattgtaaacgctccctca R trnc-gca gaactggggatggaggattt psbm - trnd GUC F psbm actggccgttttgacgtaag R trnd-guc R agagtaccgccctgtcaaga trnd GUC - trne UUC F trnd-guc F cagggcggtactctaaccaa R trne-uuc tctctttcaaggaggcaacg trnd GUC - trny GUA F trnd-guc cagggcggtactctaaccaa R trny-gua atgcccgagtggttaatgag trnfm CAU - trns UGA F trnfm-cau acgggttcaaatcctgtctc R trns-uga cattaaccactcggccatct trnl UAA - trnt UGU F 5 trnl-uaa ccgtagcgtctaccaattcc R trnt-ugu tgcgatgctctaacctctga trnl UAA - trnl5' UAA F 3 trnl-uaa gacttgaaccctcacggtct R trnl5'-uaa ggaattggtagacgctacgg rps12 - rpl20 F rps12 ctcctgctcttcgaggatgt R rpl20 ttccgacgttttcgagctat psbb - psbh F psbb tccaaaaactgggagatcca R psbh tggcgtggttttggaagtat rpl16 F rpl16f tgcttagtgtgcgactcgtt R rpl16r tcctttcattcttcccctatg rpl20 - rps18 F rpl20-rps18f ccaaatcgtaaaacacttgcac R rpl20-rps18r ttatccggccgagtgaatag

40 1) trnh GUG - psba 가 ) Primer 디자인 이두유전자사이에존재하는 non-coding region은비교적평균유전자길이가짧기때문에대부분의계통에서유전자증폭과염기서열분석이다고보고되어있다.[3] 이에본연구에서는그림 5와같이 P. densiflora의 NCBI data base를바탕으로, trnh GUG 와 psba coding region에서 primer를디자인하였으며, 이를이용하여두유전자사이의 non-coding region을증폭하여염기서열을분석하였다. primer에대한정보는표 2에정리하였다. 나 ) DNA 추출및유전자증폭 선행연구에서도출된 목재 DNA 추출기본매뉴얼 을토대로 P. densiflora로부터 DNA를추출하였다. 이를 template로하여유전자증폭을실시하였다. 멸균된 PCR tube에 3차증류수 13.9μl, 10x Taq reaction buffer 2 μl, 10mM dntp mix 0.4μl, primer 10pmole/ μl의 trnh-gug와 psba를각각 0.8μl씩첨가해주었다. 마지막에 Taq polymerase (5U/ μl BioFACT ) 0.1μl, DNA template 2μl순으로첨가하여총 20μl의용량으로 Thermal cycler (GenePro Thermal Cycler TC-E-48D) 를이용하여 PCR을진행하였다. Pre-denaturation 단계는 94 에서 5분, denaturation 단계는 94 에서 30초, annealing 단계는 52 에서 30초, extension 단계는 72 에서 30초로하여, denaturation 단계부터 extension 단계를 35회반복하였다. 그후 72 에서 10분을 1회추가하였다. 실험결과는 1.5% agarose gel에 marker와 PCR product 모두 2μl씩 loading하여전기영동하여확인하였다. 그림6 (A) 에서확인할수있듯이약 600bp에서증폭하고자하는유전자부위사이즈의밴드를확인할수있었으나그농도가매우약하여염기서열분석이어렵다고판단되었다. 이에그림6 (A) 의화살표로표시된증폭된유전자부위를분리정제하고, 이를 template로하여 2차 PCR을진행하였다. 1차 PCR 조건과동일하되증폭된 PCR product를 100배희석하여 template로사용하고 denaturation 단계부터 extension 단계를 35회에서 27회로변경하여진행하였다. 그림6 (B) 에서증폭하고자하는유전자크기인약 600bp에서농도가충분히확보되어염기서열을분석하였다

41 그림 5. P. densiflora 의 trnh GUG -psba 유전자서열과디자인한 primer 의위치

42 그림 6. trnh-gug 와 psba primer 를이용하여소나무시료로부터얻은 DNA 의 1 차 PCR 한결과 (A) 와 2 차 PCR 한결과 (B)

43 다 ) 소나무 (Pinus densiflora) 의 trnh GUG -psba 염기서열 실험에서 trnh-gug와 psba primer를이용하여증폭된유전자를양방향으로각각염기서열을분석한결과를 vector NTI program을통하여 align한후에 assemble 하였다. 이를통해얻어진유전자의염기서열은다음과같다. TTTGGTCCACTTGGCTACGTCCGCCCCGGAAAAAACCAATTTATCTATCTACAG TCATTTCTTCCAAGAATAAAAAATGAGCTAACGTTTGTTCTTATGTGGGTCGGT GACCTCTGATAGGGGATCAAAGCAAGATCGATGACTAACTCTCAACTCTCGAA CAAGTTGTATGGCTTATTATCAAATTAATTCAATGAAATGTTATTTGAATGTCT ATTGAGAATATTTGACATGAATCAAGTATGAGAGAAAGAATGTAAATGGGTCC CAATCCCGAACTACCCAAATTTAGATCTGAGTCTATACTCATATTATAGAATGA ATATGTTGATGATCTTTATCCAGCATCCATGGCTGAATGGTTAAAGCGCCCAAC TCATAATTGGCGAACTCGCGGGTTCAATTCCTGCTGGATGCAGCGGAACTGCA CATATCCATTATTGATGGAATGGGAAGAAGTATGAAGAATAACACCAAACAAT TGAAGCATACCAAGCCTTTCAATAAAATGAATGAAAGGCTTGGTATGCTTCAAT TAAGCAATACACGATAACAATCCATCAGAGTATTATCCACCTATTGAAATAGAT TCAACAGCGGCTAGATCCAGAGGAAAGTTGTGAGCATTACTTTTCGTGCAT

44 라 ) 소나무 (Pinus densiflora) 의 trnh GUG -psba 염기서열분석 얻어진 trnh GUG -psba의염기서열을 NCBI의 nucleotide blast에서검색한결과, 표 3과같이 Pinus taeda가 query coverage 99%, identities 100% 로검색되었다. 한편연구에사용된목재인 P. densiflora는 query coverage 98%, identities 97% 로검색되었다. 표 3. trnh-gug와 psba primer로증폭한유전자의염기서열을 NCBI data base 에검색한결과 Description Query coverage Identities Pinus taeda 99% 100% Pinus taeda, psba-trnh 96% 100% Pinus rigida, psba gene 97% 99% Pinus latteri, psba gene 98% 99% Pinus latteri, psba gene 98% 99%... Pinus densiflora, psba gene 98% 97% NCBI에등록되어있는 P. densiflora의 trnh GUG -psba non-coding 염기서열 (NCBI 등록번호 : JN854210) 과 PCR을통해증폭된 PCR product의염기서열을 align 하여비교하였다. 그림 7에서확인할수있듯이붉은색화살표로표시한 11개의염기서열부위에서서로불일치하는것을확인할수있었다. 이렇게불일치하는서열의개체간차이를확인하기위하여 primer를디자인한 base data외에 NCBI에서추가로검색되는다른 P. densiflora 의 trnh GUG -psba 유전자 data base와 align 하여비교하였다. 그결과앞서 NCBI 에등록되어있는 trnh GUG -psba 유전자 base는모두일치하나분석된시료의 PCR product 유전자와는동일하게 11개의염기서열부위에서불일치함을확인할수있었다.( 그림8) 이와같은불일치부위의존재는본연구에서사용한소나무시료가 NCBI에등록되어있는소나무와분류학상어느수준에서의차이인지는 ( 종간의차이인지개체간의차이인지 ) 밝히기위해서는추가적인연구가필요하다. 본연구에서 non-coding 부위에서제작한 primer를이용하여유전자증폭을통해소나무의 trnh GUG -psba 유전자를확보할수있음을보여주었다

45 그림 7. NCBI 에등록된 P. densiflora 염기서열과 trnh-gug 와 psba primer 로 증폭한유전자의염기서열을 align 한결과

46 그림 8. NCBI에등록된여러개의 P. densiflora 염기서열과본실험에서얻은유전자의염기서열을 align한결과 (primer를디자인한보고된유전자이외에 NCBI data base에검색되는 P. densiflora 의 trnh GUG -psba 유전자들을 align)

47 2) matk 가 ) Primer 디자인 MaturaseK (matk) 유전자는식물색소체유전자로써 intron maturase 를암호화하는유전자부위이다. 따라서식물계통학적으로매우잘보존되어있다고알려져있다.[44] 이에본연구에서는그림 9와같이 P. densiflora 의 NCBI data base를바탕으로, matk primer를디자인하였으며, 이를이용하여 non-coding region을증폭하여염기서열을분석하였다. primer에대한정보는표 2에정리하였다. 나 ) DNA 추출및유전자증폭 디자인한 primer를이용하여유전자를증폭후염기서열분석하기위하여선행연구에서제안된 목재 DNA 추출기본매뉴얼 을토대로 P. densiflora로부터 DNA를추출하였다. 이를 template로하여유전자증폭을실시하였다. 멸균된 PCR tube에 3차증류수 13.9μl, 10x Taq reaction buffer 2 μl, 10mM dntp mix 0.4μl, primer 10pmole/ μl의 matkf와 makr을각각 0.8 μl씩첨가해주었다. 마지막에 Taq polymerase (5U/ μl BioFACT ) 0.1μl, DNA template 2μl순으로첨가하여총 20μl의용량으로 Thermal cycler (GenePro Thermal Cycler TC-E-48D) 를이용하여 PCR을진행하였다. Pre-denaturation 단계는 94 에서 5분, denaturation 단계는 94 에서 30초, annealing 단계는 51 ~59 에서 30초, extension 단계는 72 에서 30초로하여, denaturation 단계부터 extension 단계를 35회반복하였다. 그후 72 에서 10분을 1회추가하였다. 실험결과는 1.5% agarose gel에 marker와 PCR product 모두 2μl씩 loading하여전기영동하여확인하였지만 51 ~ 59 의모든온도조건에서유전자가증폭되지않았다. 따라서유전자염기서열분석이불가능하였다

48 그림 9. P. densiflora 의 matk 유전자서열과디자인한 primer 의위치

49 3) trns GCU - 5 trng 가 ) Primer 디자인 그림 10과같이 P. densiflora 의 NCBI data base를바탕으로, trns GCU - 5 trng coding region에 primer를디자인하였으며, 이를이용하여 non-coding region을증폭하여염기서열을분석하였다. primer에대한정보는표 2에정리하였다. 나 ) DNA 추출및유전자증폭 디자인한 primer를이용하여유전자를증폭후염기서열분석하기위하여선행연구에서도출된 목재 DNA 추출기본매뉴얼 을토대로 P. densiflora로부터 DNA를추출하였다. 이를 template로하여유전자증폭을실시하였다. 멸균된 PCR tube에 3차증류수 13.9μl, 10x Taq reaction buffer 2 μl, 10mM dntp mix 0.4μl, primer 10pmole/ μl의 trns-gcu와 5 trng를각각 0.8μl씩첨가해주었다. 마지막에 Taq polymerase (5U/ μl BioFACT ) 0.1μl, DNA template 2μl순으로첨가하여총 20μl의볼륨으로 Thermal cycler (GenePro Thermal Cycler TC-E-48D) 를이용하여 PCR을진행하였다. Pre-denaturation 단계는 94 에서 5분, denaturation 단계는 94 에서 30초, annealing 단계는 51 ~59 에서 30초, extension 단계는 72 에서 30초로하여, denaturation 단계부터 extension 단계를 35회반복하였다. 그후 72 에서 10분을 1회추가하였다. 실험결과는 1.5% agarose gel에 marker와 PCR product 모두 2μl씩 loading하여전기영동하여확인하였지만 51 ~59 모든온도조건에서유전자가증폭되지않았다. 따라서유전자염기서열분석이불가능하였다

50 그림 10. P. densiflora 의 trns GCU - 5 trng 유전자서열과디자인한 primer 의위치

51 4) 5 trng 3 trng UUC 가 ) Primer 디자인 그림 11과같이 P. densiflora 의 NCBI data base를바탕으로, 5 trng 3 trng UUC coding region에 primer를디자인하려했으나 5 trng coding region에적절한 Tm값또는 GC content를갖는 primer가검색되지않았다. 따라서 5 trng exon 부근에서 non-coding region을포함하는 primer를디자인하였다이를이용하여 non-coding region을증폭하여염기서열을분석하였다. primer에대한정보는표 2에정리하였다. 나 ) DNA 추출및유전자증폭 디자인한 primer를이용하여유전자를증폭후염기서열분석하기위하여선행연구에서도출된 목재 DNA 추출기본매뉴얼 을토대로 P. densiflora로부터 DNA를추출하였다. 이를 template로하여유전자증폭을실시하였다. 멸균된 PCR tube에 3차증류수 13.9μl, 10x Taq reaction buffer 2 μl, 10mM dntp mix 0.4μl, primer 10pmole/ μl의 trng F와 trng-uuc를각각 0.8μl씩첨가해주었다. 마지막에 Taq polymerase (5U/ μl BioFACT ) 0.1μl, DNA template 2μl순으로첨가하여총 20μl의볼륨으로 Thermal cycler (GenePro Thermal Cycler TC-E-48D) 를이용하여 PCR을진행하였다. Pre-denaturation 단계는 94 에서 5분, denaturation 단계는 94 에서 30초, annealing 단계는 57 에서 30초, extension 단계는 72 에서 30초로하여, denaturation 단계부터 extension 단계를 35회반복하였다. 그후 72 에서 10분을 1회추가하였다. 실험결과는 1.5% agarose gel에 marker와 PCR product 모두 2μl씩 loading하여전기영동하여확인하였다. 그림 12(A) 에서약 700bp에서증폭하고자하는유전자를확인할수있었으나그농도가매우약하기때문에유전자서열분석이어렵다고판단되어 1차 PCR product를 template로하여 2차 PCR을진행하였다. 1차 PCR 조건과동일하되증폭된 PCR product를 100배희석하여 template로사용하고 denaturation 단계부터 extension 단계를 35회에서 27회로변경하여진행하였다. 그림 12(B) 에서약 700bp에서증폭하고자하는유전자를확인할수있었고, 이를염기서열분석하였다

52 그림 11. P. densiflora의 5 trng 3 trng UUC 유전자서열과디자인한 primer의위치

53 그림 12. P. densiflora 시료로부터얻은 DNA 를 template 로하여 primer trng F 와 trng-uuc 로 1 차 PCR 한결과 (A) 와 2 차 PCR 한결과 (B)

54 다 ) 소나무 (Pinus densiflora) 의 5 trng 3 trng UUC 염기서열 증폭된 PCR product 를 trng F 와 trng-uuc primer 를이용하여양방 향염기서열분석을하였고, 그결과를 vector NTI 를통하여 align 한후에 assemble 하였다. 이를통해얻어진유전자의염기서열은다음과같다. ACGTCAGATCGTGGGCGGGTATAGTTTAGTGGTAAAAGTGTGATTCGTTACAT TATCAACTCGAATAGTTGAAGGATCTTTTACATGGATCTTTGATCCATCTAAAG CTCTATTTCCAGATAGGTTCAAAACCTTCCCTATGAATACCCAGGAATAGCATA CCTTCTCGTAATCTGGGTCTGAAATGATGAAAGAAAGATAAACACATTTTTGGT TCCAAGATAGCGACACAGAATGTTTGAAAGGTTAGATAAATTACAGATCTATG GGGAAGATATTTTTTCATCGTGACTAAACCTTCAAATTATGGATGAAAGGACCC CAGGTTGAAGCCGAATAGCTATAGAACTATGACTTTTGTTTACTTGGGTTATCG GCATTTCGTTCGAGCTCGGTGGAATTTGTTCTCCTAGGGATCAGAATCAGTAG AAATAGGGAACGAAGTAACTAGAAAGATTTGTGATTATTTGAAACTTTTCAAAT TGATCTTTCTATCAGGATCATCTAGAAAGTGAGTAAGTATTCTACGATTTTGGG CCCTTCACTAAAAAAAGAGAATAAACTGACGTAGATGCCATGGGTACGATAAG AATTTAGGGTTTTATTAGAAAAAAAAAAAAGGAAAAAGAAAGGAATTTTAAAT TCCTTTCAAAAAAATTTGATATAAATACTCCGCTTCTTCCCTCATACCGCTCTCT ATCTCCCATGAAGGAGCCAAATGACATGAAATTCTCAGGTTCGGTTCTGAATTA GAGACATTGAATAATCAATGTCAACTATAACCCCTAGCCTTCCAAAGCTAAGGA

55 라 ) 소나무 (Pinus densiflora) 의 5 trng 3 trng UUC 염기서열분석 얻어진염기서열을 NCBI의 nucleotide blast 검색을하였고, 표4와같이 Pinus taeda가 query coverage 99%, identities 99% 로검색되었다. 한편연구에사용된샘플인 P. densiflora는 query coverage 99%, identities 96% 로검색되었다. 표 4. trng F와 trng-uuc primer로증폭한유전자의염기서열을 NCBI data base에검색한결과 Description Query coverage Identities Pinus taeda, complete genome 99% 99% Pinus clausa isolate CLAU02 99% 99% Pinus rigida isolate RIGI01 99% 99% Pinus pungens isolate PUNG01 99% 99% Pinus sabiniana isolate SABI04 99% 99%. Pinus densiflora isolate DENS02 99% 96% NCBI에등록되어있는 P. densiflora의 5 trng 3 trng UUC 유전자간 non-coding 염기서열 (NCBI 등록번호 :JN854210) 과앞서증폭된 PCR product의염기서열을 align하였다. 그림13에서확인할수있듯이화살표로표시한염기서열에서 NCBI data와 22개의부위에서염기서열이불일치되는것을확인할수있었다. 이렇게불일치되는서열의개체간차이를확인하기위하여 primer를디자인한유전자이외에 NCBI에추가로검색되는 P. densiflora의 5 trng 3 trng UUC 유전자 base data를검색하였으나 P. densiflora의다른개체의 5 trng 3 trng UUC 유전자부위는등록되지않은것을확인할수있었다. 따라서본연구를통해소나무 (P. densiflora) 의 5 trng 3 trng UUC 유전자가확보될수있음을보여주고이는소나무의분류학상차이 ( 종간, 개체간 ) 연구의하나의자료가될수있음을보여준다

56 그림 13. NCBI 에등록된 P. densiflora 염기서열과 trng F 와 trng-uuc primer 로증폭한유전자의염기서열을 align 한결과

57 5) rpob trnc GCA 가 ) Primer 디자인 그림14와같이 P. densiflora 의 NCBI data base(ncbi 등록번호 : JN854210) 를바탕으로, rpob trnc GCA coding region 에 primer를디자인하였으며, 이를이용하여 non-coding region을증폭하고염기서열을분석하였다. primer에대한정보는표 2에정리하였다. 나 ) DNA 추출및유전자증폭 디자인한 primer를이용하여유전자를증폭후염기서열분석하기위하여선행연구에서도출된 목재 DNA 추출기본매뉴얼 을토대로 P. densiflora 로부터 DNA를추출하였다. 이를 template로하여유전자증폭을실시하였다. 멸균된 PCR tube에 3차증류수 13.9μl, 10x Taq reaction buffer 2μl, 10mM dntp mix 0.4μl, primer 10pmole/ μl의 rpob와 trnc-gca를각각 0.8μl씩첨가해주었다. 마지막에 Taq polymerase (5U/ μl BioFACT ) 0.1μl, DNA template 2μl순으로첨가하여총 20μl의볼륨으로 Thermal cycler (GenePro Thermal Cycler TC-E-48D) 를이용하여 PCR을진행하였다. Pre-denaturation 단계는 94 에서 5분, denaturation 단계는 94 에서 30초, annealing 단계는 59 에서 30초, extension 단계는 72 에서 30초로하여, denaturation 단계부터 extension 단계를 35회반복하였다. 그후 72 에서 10분을 1회추가하였다. 실험결과는 1.5% agarose gel에 marker와 PCR product 모두 2μl씩 loading하여전기영동하여확인하였다. 그림 15(A) 에서약 500bp에서증폭하고자하는유전자를확인할수있었으나그농도가매우약하기때문에유전자서열분석이어렵다고판단되어 2차 PCR을진행하였다. 1차 PCR 조건과동일하되증폭된 PCR product 를 100배희석하여 template로사용하고 denaturation 단계부터 extension 단계를 35회에서 27회로변경하여진행하였다. 그림 15(B) 에서약 500bp의크기의유전자를확인할수있었고, 밴드의농도가충분히높아염기서열분석을수행하였으나, 염기서열분석결과를얻지못하였다. 이는염기서열분석시염기서열상의 A와 T 염기가반복되는서열을가지고있어서 slippage현상이일어나염기서열을읽는데어려움이있는것으로판단된다

58 그림 14. P. densiflora의 rpob trnc GCA 유전자서열과디자인한 primer의위치

59 그림 15. P. densiflora 시료로부터얻은 DNA 를 template 로하여 primer rpob 와 trnc-gca 로 1 차 PCR 한결과 (A) 와 2 차 PCR 한결과 (B)

60 6) psbm trnd GUC 가 ) Primer 디자인 그림 16과같이 P. densiflora 의 NCBI data base를바탕으로, psbm trnd GUC coding region에대한 primer를디자인하였으며, 이를이용하여 non-coding region을증폭하여염기서열을분석하였다. primer에대한정보는표 2에정리하였다. 나 ) DNA 추출및유전자증폭 디자인한 primer를이용하여유전자를증폭후염기서열분석을하기위하여선행연구에서도출된 목재 DNA 추출기본매뉴얼 을토대로 P. densiflora로부터 DNA를추출하였다. 이를 template로하여유전자증폭을실시하였다. 멸균된 PCR tube에 3차증류수 13.9μl, 10x Taq reaction buffer 2 μl, 10mM dntp mix 0.4μl, primer 10pmole/ μl의 psbmf와 trnd-guc-r를각각 0.8μl씩첨가해주었다. 마지막에 Taq polymerase (5U/ μl BioFACT ) 0.1μl, DNA template 2μl순으로첨가하여총 20μl의볼륨으로 Thermal cycler (GenePro Thermal Cycler TC-E-48D) 를이용하여 PCR을진행하였다. Pre-denaturation 단계는 94 에서 5분, denaturation 단계는 94 에서 30초, annealing 단계는 59 에서 30초, extension 단계는 72 에서 30초로하여, denaturation 단계부터 extension 단계를 35회반복하였다. 그후 72 에서 10분을 1회추가하였다. 실험결과는 1.5% agarose gel에 marker와 PCR product 모두 2μl씩 loading하여전기영동하여확인하였다. 그림 17(A) 에서약 670bp에서증폭하고자하는유전자를확인할수있었으나그농도가매우약하기때문에유전자서열분석이어렵다고판단되어 2차 PCR을진행하였다. 1차 PCR 조건과동일하되증폭된 PCR product 를 1000배희석하여 template로사용하고 denaturation 단계부터 extension 단계를 35회에서 33회로변경하여진행하였다. 그림 17(B) 에서약 670bp에서증폭하고자하는유전자를확인할수있었고, 밴드의농도가충분히진하기때문에염기서열을분석하였다

61 그림 16. P. densiflora 의 psbm trnd GUC 유전자서열과디자인한 primer 의위치

62 그림 17. P. densiflora 시료로부터얻은 DNA 를 template 로하여 primer psbmf 와 trnd-guc-r 로 1 차 PCR 한결과 (A) 와 2 차 PCR 한결과 (B)

63 다 ) 소나무 (Pinus densiflora) 의 psbm trnd GUC 염기서열 증폭된 PCR product 를 psbmf 와 trnd-guc-r primer 를이용하여양 방향으로염기서열을분석하였고, 그결과를 vector NTI 를통하여 align 후 assemble 하였다. 이를통해얻어진유전자의염기서열은다음과같다. ACTGGCCGTTTTGACGTAAGGGATAAGTAGAAAAGCAGTAGGAACTGCAAGGA ACAGTAGAACAGCAATAAATGCAAGGGTATTTACTTCCATGATCTCCTTATTTT AACTTTGTTCAAAAATAGCTCGAGATTTGATCTCATTTTGATCTCATTTTGATC TCATAGAGATGAATGAATCTTTCTTTCAAGATCCATGAAATAGATGTATGTCAT TGATAGAATTGGTTCGAGTAACGGAATCTAACTAATGGATTGAATGAATTCTT CGATGGAAATAGTATAACCTAATACGATCACTTTTGATAAGACTAGTAGTAAAA ACTTACGTGCATCAGAAAACGTTCCGATCAACACATGTCTGGTATAATTTCGAA AGAATAGGATTCGTACGAATAAGAACCTTATGCTCCTCCAGAAGACGTTCGTC AGACATGAGAGATATTTTGCTTGGATCTCCACGATTTAGATGGAATTGTGAAT CTATCCCGCTTCGGTGATGATATAGAAAGAAGTATCCCATATCGAATTTATCCA GAGGCCCACCCATGACCCTGGAATGATAAGGACTAGTCCGTCCAGATCCTGAC ATGATCATTCACAGTTCACTTACTATTGGATCGGGACTGACGGGACTCGAACCC GCAACTTCCGTCTTGACAGGGCGGTACTCT

64 라 ) 소나무 (Pinus densiflora) 의 psbm trnd GUC 염기서열분석 얻어진염기서열을 NCBI 의 nucleotide blast 검색을하였고, 표 5 와같 이 P. densiflora 가 query coverage 100%, identities 100% 로검색되었다. 표 5. psbmf와 trnd-guc primer로증폭한유전자의염기서열을 NCBI data base에검색한결과 Description Query coverage Identities Pinus sylvestris, complete genome 100% 100% Pinus taiwanensis, complete genome 100% 100% Pinus massoniana, complete genome 100% 100% Pinus densiflora isolate DENS02 100% 100% Pinus massoniana isolate MASS02 100% 100% NCBI에등록되어있는 P. densiflora의 psbm trnd GUC non-coding 염기서열과증폭된유전자의염기서열을 align하였다. 그림 18에서확인할수있듯이모든서열이일치하였다. 따라서본연구를통해소나무 (P. densiflora) 의 psbm trnd GUC non-coding 유전자가확보될수있음을보여주고, 소나무시료에대한종식별후보유전자가될수있음을확인하였다

65 그림 18. NCBI 에등록된 P. densiflora 염기서열과 psbmf 과 trnd-guc primer 로증폭한유전자의염기서열을 align 한결과

66 7) trnd GUC trne UUC 가 ) Primer 디자인 그림 19와같이 P. densiflora 의 NCBI data base를바탕으로, trnd GUC trne UUC coding region에 primer를디자인하였으며, 이를이용하여 non-coding region을증폭하고염기서열을분석하였다. primer에대한정보는표 2에정리하였다. 나 ) DNA 추출및유전자증폭 디자인한 primer를이용하여유전자를증폭후염기서열분석하기위하여선행연구에서도출된 목재 DNA 추출기본매뉴얼 을토대로 P. densiflora로부터 DNA를추출하였다. 이를 template로하여유전자증폭을실시하였다. 멸균된 PCR tube에 3차증류수 13.9μl, 10x Taq reaction buffer 2 μl, 10mM dntp mix 0.4μl, primer 10pmole/ μl의 trnd-guc, trne-uuc를각각 0.8μl씩첨가해주었다. 마지막에 Taq polymerase (5U/ μl BioFACT ) 0.1μl, DNA template 2μl순으로첨가하여총 20μl의볼륨으로 Thermal cycler (GenePro Thermal Cycler TC-E-48D) 를이용하여 PCR을진행하였다. Pre-denaturation 단계는 94 에서 5분, denaturation 단계는 94 에서 30초, annealing 단계는 53 에서 30초, extension 단계는 72 에서 30초로하여, denaturation 단계부터 extension 단계를 35회반복하였다. 그후 72 에서 10분을 1회추가하였다. 실험결과는 1.5% agarose gel에 marker와 PCR product 모두 2μl씩 loading하여전기영동하여확인하였다. 그림 20(A) 에서약 470bp에서증폭하고자하는유전자를확인할수있었으나그농도가매우약하기때문에유전자서열분석이어렵다고판단되어 2차 PCR을진행하였다. 1차 PCR 조건과동일하되증폭된 PCR product 를 10,000배희석하여 template로사용하고 denaturation 단계부터 extension 단계를 35회에서 32회로변경하여진행하였다. 그림 20(B) 에서약 470bp에서증폭하고자하는유전자를확인할수있었고, 이유전자의염기서열을분석하였다

67 그림 19. P. densiflora 의 trnd GUC trne UUC 유전자서열과디자인한 primer 의위치

68 그림 20. P. densiflora 시료로부터얻은 DNA 를 template 로하여 primer trnd-guc-f 와 trne-uuc 로 1 차 PCR 한결과 (A) 와 2 차 PCR 한결과 (B)

69 다 ) 소나무 (Pinus densiflora) 의 trnd GUC trne UUC 염기서열 PCR 로증폭된유전자를 trnd-guc 와 trne-uuc primer 를이용하여 양방향으로염기서열을분석하였다. 그결과를 vector NTI 를통하여 align 후 assemble 하였다. 이를통해얻어진유전자의염기서열은다음과같다. TTCTCTTTCAAGGAGGCAACGGGGATTCAACTTCCCCTGGGGGTACCATGATC CATTCGTTAGGTATCCTAAATAATTTTCAATTACTGTCTTGTTCCTGGGTCGAT GCCCGAGTGGTTAATGAGGACGGACTGTAAATCCGTTGGCAATATGCCTACGC TGGTTCAAATCCAGCTCGACCCAACCAATATCATCAATACCAATCTATCGGTAT GGTTATATTCATGCTAATCATGAATGAAAAGATAATTGGTTATTGAACCCCGGC ATCGATATCTATTCATATCGTAGATGCCCGATTCCGTATGAATCGATACATTTC AAAAATGAAAGAGAAGATTAAGATATTTAATCGACCTAGCACTCGCATAATCTA TATGACCTATCTAGCACCTATCATGGAATAAATATTATCCAATAGTAGGTGAAC TGTACTGTATTGGGATTGTAGCTCAATTGGTTAGAGTACCGCCCT 라 ) 소나무 (Pinus densiflora) 의 trnd GUC trne UUC 염기서열분석 얻어진염기서열을 NCBI의 nucleotide blast 검색을하였고, 표6과같이 Pinus taeda가 query coverage 99%, identities 100% 로검색되었다. 한편연구에사용된샘플인 P. densiflora는 query coverage 99%, identities 99% 로검색되었다 표 6. trnd-guc와 trne-uuc primer로증폭한유전자의염기서열을 NCBI data base에검색한결과 Description Query coverage Identities Pinus taeda, complete genome 99% 100% Pinus cubensis isolate CUBE01 99% 100% Pinus echinata isolate ECHI01 99% 100% Pinus elliottii isolate ELLI01 99% 100% Pinus densiflora isolate DENS02 99% 99%

70 NCBI에등록되어있는 P. densiflora 의 trnd GUC trne UUC non-coding 염기서열 (NCBI 등록번호 : JN854210) 과증폭된유전자의염기서열을 align하였다. 그림 21에서확인할수있듯이화살표로표시한염기서열에서 NCBI data 5개의부위에서염기서열이불일치되는것을확인할수있었다. 이렇게불일치되는서열의개체간차이를확인하기위하여 primer를디자인한 base data외에 NCBI에추가로검색되는다른 P. densiflora의 trnd GUC - trne UUC 유전자 data base를검색하였으나다른개체의 trnd GUC - trne UUC 유전자부위는등록되지않은것을확인할수있었다. 따라서본연구를통해소나무 (P. densiflora) 의 trnd GUC - trne UUC 유전자가확보될수있음을보여주고이는소나무의분류학상차이 ( 종간, 개체간 ) 연구의하나의 base data 가될수있음을보여준다. 그림 21. NCBI 에등록된 P. densiflora 염기서열과 trnd-guc 와 trne-uuc primer 로증폭한유전자의염기서열을 align 한결과

71 8) trnd GUC trny GUA 가 ) Primer 디자인 그림 22과같이 P. densiflora의 NCBI data base를바탕으로, trnd GUC trny GUA coding region에서 primer를디자인하였으며, 이를이용하여 non-coding region을증폭하고그염기서열을분석하였다. primer에대한정보는표 2에정리하였다. 나 ) DNA 추출및유전자증폭 디자인한 primer를이용하여유전자를증폭후염기서열분석하기위하여선행연구에서도출된 목재 DNA 추출기본매뉴얼 을토대로 P. densiflora로부터 DNA를추출하였다. 이를 template로하여유전자증폭을실시하였다. 멸균된 PCR tube에 3차증류수 13.9μl, 10x Taq reaction buffer 2 μl, 10mM dntp mix 0.4μl, primer 10pmole/ μl의 trnd-guc와 trny-gua를각각 0.8μl씩첨가해주었다. 마지막에 Taq polymerase (5U/ μl BioFACT ) 0.1 μl, DNA template 2μl순으로첨가하여총 20μl의볼륨으로 Thermal cycler (GenePro Thermal Cycler TC-E-48D) 를이용하여 PCR을진행하였다. Pre-denaturation 단계는 94 에서 5분, denaturation 단계는 94 에서 30초, annealing 단계는 57 에서 30초, extension 단계는 72 에서 30초로하여, denaturation 단계부터 extension 단계를 35회반복하였다. 그후 72 에서 10분을 1회추가하였다. 실험결과는 1.5% agarose gel에 marker와 PCR product 모두 2μl씩 loading하여전기영동하여확인하였다. 그림 23(A) 에서약 350bp에서증폭하고자하는유전자를확인할수있었으나그농도가매우약하기때문에유전자서열분석이어렵다고판단되어 2차 PCR을진행하였다. 1차 PCR 조건과동일하되증폭된 PCR product 를 100배희석하여 template로사용하고 denaturation 단계부터 extension 단계를 35회에서 37회로변경하여진행하였다. 그림 23(B) 에서약 350bp에서증폭하고자하는유전자를확인할수있었고, 밴드의농도가충분히진하기때문에염기서열을분석하였다

72 그림 22. P. densiflora 의 trnd GUC trny GUA 유전자염기서열과디자인한 primer 의위치

73 그림 23. P. densiflora 시료로부터얻은 DNA 를 template 로하여 primer trnd-guc-f 와 trny-gua 로 1 차 PCR 한결과 (A) 와 2 차 PCR 한결과 (B)

74 다 ) 소나무 (Pinus densiflora) 의 trnd GUC trny GUA 염기서열 증폭된유전자를 trnd-guc 와 trny-gua primer 를이용하여양방향으 로염기서열분석을하였다. 그결과를 vector NTI 를통하여 align 후 assemble 하였다. 이를통해얻어진유전자의염기서열은다음과같다. TCAGGGCGGTACTCTAACCAATTGAGCTACAATCCCAATACAGTACAGTTCACC TACTATTGGATAATATTTATTCCATGATAGGTGCTAGATAGGTCATATAGATTA TGCGAGTGCTAGGTCGATTAAATATCTTAATCTTCTCTTTCATTTTTGAAATGT ATCGATTCATACGGAATCGGGCATCTACGATATGAATAGATATCGATGCCGGG GTTCAATAACCAATTATCTTTTCATTCATGATTAGCATGAATATAACCATACCG ATAGATTGGTATTGATGATATTGGTTGGGTCGAGCTGGATTTGAACCAGCGTA GGCATATTGCCAACGGATTTACAGTCCGTCCTCATTAACCACTCGGGCATATG 라 ) 소나무 (Pinus densiflora) 의 trnd GUC trny GUA 염기서열분석 얻어진염기서열을 NCBI의 nucleotide blast 검색을하였고, 표 7과같이 Pinus taeda가 query coverage 98%, identities 100% 로검색되었다. 한편연구에사용된샘플인 P. densiflora는 query coverage 98%, identities 98% 로검색되었다. 표 7. trnd-guc와 trny-gua primer로증폭한유전자의염기서열을 NCBI data base에검색한결과 Description Query coverage Identities Pinus taeda, complete genome 98% 100% Pinus cubensis isolate CUBE01 98% 100% Pinus echinata isolate ECHI01 98% 100% Pinus elliottii isolate ELLI01 98% 100% Pinus greggii isolate GREG02 98% 100% Pinus densiflora isolate DENS02 98% 98%

75 NCBI에등록되어있는 P. densiflora의 trnd GUC trny GUA non-coding 염기서열 (NCBI 등록번호 : JN854210) 과앞서증폭된유전자의염기서열을 align하였다. 그림 24에서확인할수있듯이화살표로표시한 4개의염기서열부위에서불일치되는것을확인할수있었다. 이렇게불일치되는서열의개체간차이를확인하기위하여 primer를디자인한 base data외에 NCBI에추가로검색되는다른 P. densiflora 의 ttrnd GUC trny GUA 유전자 base data 를검색하였으나 P. densiflora의다른개체의 trnd GUC trny GUA 유전자부위는등록되지않은것을확인할수있었다. 따라서본연구를통해소나무 (P. densiflora) 의 trnd GUC trny GUA 유전자가확보될수있음을보여주고이는소나무의분류학상차이 ( 종간, 개체간 ) 연구의하나의 base data가될수있음을보여준다. 그림 24. NCBI 에등록된 P. densiflora 염기서열과 trnd-guc 와 trny-gua primer 로증폭한유전자의염기서열을 align 한결과

76 9) trnfm CAU - trns UGA 가 ) Primer 디자인 그림 25과같이 P. densiflora의 NCBI data base를바탕으로, trnfm CAU - trns UGA coding region에 primer를디자인하였으며, 이를이용하여 non-coding region을증폭하고염기서열을분석하였다. primer에대한정보는표 2에정리하였다. 나 ) DNA 추출및유전자증폭 디자인한 primer를이용하여유전자를증폭후염기서열분석을하기위하여선행연구에서도출된 목재 DNA 추출기본매뉴얼 을토대로 P. densiflora로부터 DNA를추출하였다. 이를 template로하여유전자증폭을실시하였다. 멸균된 PCR tube에 3차증류수 13.9μl, 10x Taq reaction buffer 2 μl, 10mM dntp mix 0.4μl, primer 10pmole/ μl의 trnfm-cau와 trns-uga를각각 0.8μl씩첨가해주었다. 마지막에 Taq polymerase (5U/ μl BioFACT ) 0.1 μl, DNA template 2μl순으로첨가하여총 20μl의볼륨으로 Thermal cycler (GenePro Thermal Cycler TC-E-48D) 를이용하여 PCR을진행하였다. Pre-denaturation 단계는 94 에서 5분, denaturation 단계는 94 에서 30초, annealing 단계는 53 에서 30초, extension 단계는 72 에서 30초로하여, denaturation 단계부터 extension 단계를 35회반복하였다. 그후 72 에서 10분을 1회추가하였다. 실험결과는 1.5% agarose gel에 marker와 PCR product 모두 2μl씩 loading하여전기영동하여확인하였다. 그림 26(A) 에서약 950bp에서증폭하고자하는유전자의위치를확인할수있었으나그농도가매우약하기때문에유전자서열분석이어렵다고판단되어 2차 PCR을진행하였다. 1차 PCR 조건과동일하되증폭된 PCR product를 100배희석하여 template로사용하고 denaturation 단계부터 extension 단계를 35회에서 27회로변경하여진행하였다. 그림 26(B) 에서약 950bp에서증폭하고자하는유전자를확인할수있었고, 유전자의농도가충분히진해서염기서열을분석하였다