(19) 대한민국특허청(KR) (12) 공개특허공보(A) (51) Int. Cl. C12N 15/13 7 (11) 공개번호 (43) 공개일자 (21) 출원번호 (22) 출원일자 10-2001-0007405 2001년02월15일 (71) 출원인 차상훈 강원도 춘천시 석사동 대우아파트 104동 702호 (72) 발명자 차상훈 강원도 춘천시 석사동 대우아파트 104동 702호 (74) 대리인 이덕록 특2002-0067073 2002년08월22일 심사청구 : 있음 (54) 오이 모자이크 바이러스병 방제용 ｓｃｆｖ 및 이를발현하는 재조합 벡터 요약 본 발명은 오이 모자이크 바이러스병 방제용 scfv 및 이를 발현하는 재조합 벡터에 관한 것으로 오이 모자이크 바이러 스의 한국 계통인 CMV-Mf로 면역화시킨 마우스로부터 비장세포를 분리하고 면역글로불린 유전자를 이용하여 scfv 파아지 디스플레이 라이브러리(scFv phage display library)를 제작한 다음 항원인 CMV-Mf와 4회에 걸쳐 친화적 선별하여 분리한 scfv(single-chain variable fragment)는 하이브리도마 융합에 의해 생성된 단일클론 항체와 동일 한 결합특이성을 가지며 순화된 CMV의 서브그룹 I과 Ⅱ를 모두 인식하는 뛰어난 효과가 있다. 대표도 도2 색인어 오이 모자이크 바이러스, scfv, phage display library, 단일클론 항체, 하이브리도마 융합 명세서 도면의 간단한 설명 도 1은 IPTG 유도하에서 csf-1 클론에 의한 CMV에 특이적인 scfv 항체의 발현을 확인한 결과이다. - 1 -
도 2는 면역블럿팅(immunoblotting)에 의한 scfv의 CMV에 대한 결합특이성을 확인한 결과이다. 도 3은 CMV-Mf를 항원으로 하여 제작한 scfv 항체의 H 체인 가변영역을 암호화하고 있는 유전자 단편의 염기서열 을 나타낸 것이다. 도 4은 CMV-Mf를 항원으로 하여 제작한 scfv 항체의 L 체인 가변영역을 암호화하고 있는 유전자 단편의 염기서열을 나타낸 것이다. 도 5는 CMV-Mf를 항원으로 하여 제작한 scfv 항체의 H 체인 가변영역을 암호화하고 있는 유전자 단편의 아미노산 서열을 나타낸 것이다. 도 6은 CMV-Mf를 항원으로 하여 제작한 scfv 항체의 L 체인 가변영역을 암호화하고 있는 유전자 단편의 아미노산서 열을 나타낸 것이다. 도 7은 오이 모자이크 바이러스의 유전자 발현을 위한 본 발명 재조합 발현벡터 pcsf-1의 제작 모식도이다. 발명의 상세한 설명 발명의 목적 발명이 속하는 기술 및 그 분야의 종래기술 본 발명은 오이 모자이크 바이러스병 방제용 scfv 및 이를 발현하는 재조합 벡터에 관한 것이다. 더욱 상세하게는, 본 발명은 오이 모자이크 바이러스의 한국 계통인 CMV-Mf를 항원으로 하여 scfv 파아지 디스플레이 라이브러리(scFv phage display library)를 제작한 다음 항원인 CMV-Mf와 4회에 걸쳐 친화력 선별하여 분리한 다음, 통상적인 하이 브리도마 융합에 의해 생성된 단일클론 항체와 항원 결합력을 비교했을때 동일한 결합특이성을 가지며, CMV의 서브그 룹 I과 Ⅱ를 모두 인식하는 scfv에 관한 것이다. 오이 모자이크 물에 감염되어 포지티브 센스 니즘을 밝히기 바이러스는 반경 30nm 구형의 cucumovirus그룹에 속하는 바이러스로서 전세계적으로 분포하고 농작 매년 막대한 작물의 손실을 초래하며, 기주범위가 넓고 병원성이 다양하게 보고되어 있다. 단일가닥의 RNA로 3종의 RNA(RNA 1,2,3)와 1종의 서브게놈 RNA(RNA 4)로 구성되어 있으며, 병원성의 메카 위하여 분자적 수준에서 많은 연구가 되어 있다. 식물바이러스의 항원 구조를 밝히고 바이러스 병의 분석하는데 있어서 식물바이러스에 특이적인 단일클론 항체의 이용 은 매우 유용하다. CMV 경우에 있어서 10개의 단일클론 항체가 제작되어 있으며, ELISA에서 이 10개의 단일클론 항 체는 CMV의 세가지 혈청형 CMV-DTL, CMV-ToRS, CMV-Co에 속하는 멤버들과 반응하였다. 이들 중 몇몇 단일클 론 항체는 별개의 멤버인 CMV-DTL와 CMV-ToRS를 특이적으로 인식하고 이 중 두 개의 단일항체가 CMV-Co를 검출할 수 있어 식물체 즙액에 존재하는 CMV의 양을 정량하는데 유용하다고 보고되어 있다(Porta et al., Arch Vrio l 104:271-281, 1989). 그러나 CMV를 포함한 일부 식물 바이러스는 혈청을 제조하기에는 면역원(immunogen)으로 용이하지 않다고 알려져 있는데(Palukaitis et al., Adv Virus Res 41:281-348, 1992), 이와 같이 실험동물의 면역반응을 충분히 일으킬 수 없는 항원에 대한 특이적인 항체절편을 생산하기 위하여 scfv 파아지 디스플레이 라이브러리(scFv phage display li brary) 방법이 사용되고 있다. 이 scfv 파아지 디스플레이 라이브러리(scFv phage display library)는 인간이나 마 우스 유래의 H 체인과 L 체인의 변이영역 유전자를 유동성(flexible)있는 폴리펩타이드 즉 링커(linker)로 연결하여 사상형(filamentous) 파아지의 표면에서 발현시키는 것이다. 결론적으로 scfv는 단일체인의 항원 결합 단백질로 항체 VH 와 VL 이 펩타이드 링커에 의해서 연결되어 있어서 단일클론 항체와 동일한 결합특이성을 가지게 된다. - 2 -
기존의 하이브리도마 융합기술에 있어서 항원-결합 재조합 항체의 분리가 어렵다는 것이 보고되어 있는데 반하여(Mo rrison, Annu Rev Immunol 10:239-265 1992), 파아지 디스플레이 기술은 하이브리도마 융합 기술에 비해 조작이 간단하고 식물 조즙액에서 바이러스 입자를 빠르게 검출할 수 있으며 바이러스 저항성 형질전환식물의 개발에 있어서 도 적용될 수 있는 잇점을 가진다. 한편, 인체 합성 scfv 라이브러리(Human synthethic scfv libraries)를 이용하여 제작한 CMV(cucumber mosaic virus), TSWV(tomato spotted wilt virus), BNYVV(beet necrotic yellow vein virus), PLRV(potato leafroll virus)에 특이적인 재조합 인체 scfv가 보고되어 있지만(Ziegler et al., Virology, 1995., Griep et al., Virology, 2000., Fecker et al., Plant Mol Biol, 1996, Toth et al., Virology, 1999.) 상기 인체 합성 scfv 라이브러리(hu man synthetic scfv libraries)를 이용하여 제작한 scfv는 in vivo 면역시스템에서와 같은 항원 특이적 scfv를 획득 하기 어렵고 항원특이성과 결합력을 강화시키기 위해서 scfv dimer로 만들거나 DNA suffling과 같은 유전자 조작을 해야하는 단점이 있다(Clackson et al., Nature, 1991). 실제로 인체 합성 라이브러리(Human synthethic library) 로 제작된 CMV에 특이적인 인체 scfv는 다중 클로날 항체에 비하여 약한 결합력을 나타냄이 입증되어 있다(Ziegler et al., Virology, 1995). 따라서, 본 발명자들은 상기와 같은 사실에 착안하여 CMV로 면역화시킨 마우스로부터 비장세포를 분리하고 면역글로 불린(immunoglobulin) 유전자를 이용하여 쥐(murine)의 scfv 파아지 디스플레이 라이브러리(scFv phage display library)를 구축하고 scfv 항체를 제조함으로써 본 발명을 완성하였다. 따라서, 본 발명의 목적은 오이 모자이크 바이러스에 특이적인 scfv 항체를 제공함에 있다. 본 발명의 다른 목적은 상기 scfv를 삽입시켜 구축한 재조합 벡터를 제공하는데 있다. 본 발명의 또 다른 목적은 상기 scfv의 염기서열 및 그로부터 유추한 아미노산 서열을 제공하는 데 있다. 발명이 이루고자 하는 기술적 과제 본 발명의 상기 목적은 CMV-Mf계통을 ICR 마우스에 투여하여 면역화시킨 다음 비장세포를 적출하여 RNA를 추출하 고 H 체인과 L 체인 유전자를 RT-PCR한 다음 이 PCR 산물을 정제하고 링커 펩타이드로 연결하기 위하여 linker PC R과 pull through PCR 한 다음 pcantab 5E 벡터에 클로닝하여 scfv 파아지 디스플레이 라이브러리(scFv phage display library)를 제작하고, 항원결합 특이성 클론을 스크리닝 하기 위해서 항원인 CMV-Mf와 4회 패닝(panninge) 과정을 거쳐 CMV에 특이적인 항체를 발현하는 클론을 선별하고 ELISA로 확인하였으며, 상기 선별된 클론에서 생산된 scfv와 하이브리도마 융합에 의해 생산된 단일클론 항체의 항원 결합력을 면역블럿팅으로 비교하였고, 상기 CMV에 특이적인 scfv를 발현하는 재조합 벡터의 염기서열을 분석함으로써 본 발명을 완성하였다. 이하, 본 발명의 구성을 설명한다. 발명의 구성 및 작용 - 3 -
본 발명은 순화한 CMV-Mf를 보조제인 Freund's adjuvant와 함께 ICR 마우스에 투여한 다음 매 2주에 2번씩 Freu nd's adjuvant를 투여하여 면역화시킨 후 비장(Spleen)을 적출하는 단계; 상기 비장세포를 마쇄하여 RNA를 추출하고 H 체인과 L 체인 유전자를 RT-PCR하는 단계; 상기 PCR 산물을 링커 펩타이드로 연결하기 위하여 linker PCR과 pu ll-through PCR 하는 단계; 상기 제조한 PCR 산물을 sfi I과 Not I을 처리한 다음 T4 DNA ligase를 이용하여 pca NTAB 5E에 클로닝하고 TG1 컴페턴트 세포에 형질전환시켜 scfv 파아지 디스플레이 라이브러리(scFv phage disp lay library)를 제작하는 단계; 상기 구축한 scfv 파아지 디스플레이 라이브러리로부터항원결합 특이성을 가지는 클론 을 선발하기 위해서 마이크로역가 플레이트에 항원인 CMV-Mf(10ug/mL)가 첨가된 코팅완충액으로 코팅한 다음 3% BSA로 블록킹 시키고, 이 마이크로역가 플레이트에 재조합 파아지를 첨가하여 실온에서 2시간 정치한 후 PBS-0.1% tween 20으로 5회 세척하는 단계;상기와 같은 패닝(panning)과정을 4회 반복한 다음 파아지를 추출 완충액(0.1M g lycine, 0.1% BSA, ph 3.0)으로 추출하고 TG1 컴페턴트 세포에 감염시킨 다음 연이어 M13-K07 헬퍼 파아지를 재 감염(superinfection)시켜 증식시킨 후 배양액을 3000 g에서 원심분리하고 PEG/NaCl침전하여 200ul의 PBS에 정치 시키는 단계; 상기 패닝(panning)과정에 의해 선별된 24개의 클론을 ELISA분석하여 CMV에 특이적인 항원 결합성을 나타내는 scfv클론을 선별하는 단계; CMV로 면역화시킨 쥐로부터 분리한 비장세포와 SP2/0 골수종(myeloma)세포 와 하이브리도마 융합하고 HAT배지인 Dulbecco's modified eagle 배지에서 융합된 세포를 선별한 다음 ELISA에서 확인하여 CMV에 특이적으로 결합하는 단일클론 항체를 생산하는 단계; 상기 선별된 클론에서 생산된 scfv와 하이브 리도마 융합에 의해 생산된 단일클론 항체의 항원 결합력을 면역블럿팅으로 비교하는 단계; scfv 클론을 DNA 시퀀싱 하여 VH 와 VL 의 염기서열을 결정하는 단계로 구성된다. 본 발명에서 사용한 RNeasy RNA isolation kit는 (QIAGEN, Germany)사의 제품을 사용하였다. 본 발명에서 PCR산물을 정제하는데 사용한 gel eluter와 형질전환할 때 사용한 Gene pulser은 Biorad(Richmond, C A)제품을 사용하였다. 본 발명에 이용된 Freund's adjuvant, RPMI-1640 배지, DMEM(Dulbecco's modified eagel medium)배지, HAT 배지, 2,2'-azino-bis (3-ethylbenthiazoline6-sulfonic acid)는 시그마사(Sigma Co.)제품을 사용하였다. 본 발명의 1ST strand cdna 합성에 사용된 1 ST strand cdna synthesis kit와 클로닝에 사용된 T4 DNA ligase는 BM사(Boehringer Mannhein Biochemicals, Germany)의 제품을 사용하였다 본 발명의 scfv 파아지 디스플레이 라이브러리(scFv phage display library)를 제작하는데 사용된 pcantab 5E 벡 터와 ELISA에서 사용된 anti-e tag antibody는 아마샴-파마시아 바이오텍(Amersham Phamacia Biotech, Swed en)에서 구입하였다. 본 발명 오이 모자이크 바이러스에 대한 scfv 항체 유전자가 삽입된 재조합 벡터 pcsf-1의 대장균 형질전환체는 Esc herichia coli HB2151/pcsf-1이라 명명하고 2001년 1월 17일자로 생명공학 연구소 유전자은행에 기탁번호 KCTC 18071P로 기탁하였다. 이하, 본 발명의 구체적인 방법을 실시예를 들어 상세히 설명하고자 하지만 본 발명의 권리범위는 이들 실시예에만 한 정되는 것은 아니다. 실시예 1: scfv 파아지 디스플레이 라이브러리(scFv phage display library)의 구축 및 스크리닝 제 1단계; 마우스의 면역화 순화된 CMV-Mf(50 /ml)을 보조제인 Freund's adjuvant로 에멀션화한 다음 3마리의 암컷 ICR 마우스에 복강주입 하였고 보조주사(booster injection)은 매 2주에 2번씩 Freund's adjuvant를 투여하였다. 세 번째 보조주사한 다음 3일 후에 무균적으로 마우스로부터 비장(spleen)을 분리한 다음 멸균된 메스로 비장을 잘게 마쇄하여 단일세포 부유액 - 4 -
(single cell suspension)을 취하고 RPMI-1640 배지에서 정치(resuspend)시켰다. 적혈구는 저장액 삼투압 방법( hypotonic osmosis)을 통하여 제거하고 남은 비장세포는 하이브리도마 융합과 RNA 추출에 사용하였다. 제 2단계; scfv 파아지 디스플레이 라이브러리(scFv phage display library)의 제조 비장세포로부터 RNeasy를 사용하여 total RNA를 추출하고 이를 주형으로 하여1 st strand cdna 합성 키트로 1 trnad cdna를 합성하였고 역전사 효소는 AMV(avian myeloblastosis virus)를 이용하였다. ST s PCR은 표 1과 같은 조건으로 수행하였다. [표 1] 변성(denaturation step) 어닐링(annealing step) 신장(extension step) 주기 PCR수행조건 H 체인 변이영역variable heavy chain(v 94 1분 50 1분 72 2분 35 회(72 10min soaking) H) L 체인 변이영역 variable light chain(v 94 1min 55 1min 72 2min 35 cycle(72 10 min soaking) L) 상기 얻어진 PCR 산물은 1% 아가로즈 겔 전기영동한 다음 gel eluter를 사용하여 정제하였다. scfc유전자(v H -link er-vl )은 Taq polymerase와 하기와 같은 염기서열을 가지는 linker를 사용하여 linker PCR과 pull-through PCR 하였다. linker 염기서열 ---- GGGGSGGGGSGGGGS linker PCR과 pull-through PCR하여 획득된 PCR 산물은 gel eluter를 사용하여 정제한 다음 T4 DNA ligase를 사 용하여 pcantab 5E 벡터에 삽입한 다음 Gene pulser를 사용하여 TG1 컴페턴트 세포에 형질전환시켰다. 제 3단계; 패닝(Panning)방법에 의한 항원 결합하는 재조합 파아지의 선별 항원 결합하는 재조합 파아지의 친화력 선별은 하기와 같이 기술된 패닝(panning)방법에 의해 수행하였다. 마이크로역 가 플레이트를 코팅완충액(0.1M NaHCO 3, ph 9.2)에 순화한 CMV 10 /ml되게 하여 4 에서 하룻밤동안 코팅한 후 3% BSA(bovine serum albumin:소혈청 알부민)으로 37 1시간 동안 블럭시킨다. 그런 다음 10 11 재조합 파아지를 첨가하고 실온에서 2시간 동안 배양하였다. 마이크로역가 플레이트는 피페팅하여 PBS-0.1% tween으로 5회 세척하 였다. 결합된 파아지는 추출완충액(0.1% BSA를 포함한 0.1M glycine ph 3.0)에서 추출하였고, 1M Tris.HCl (ph 7.4)로 중화시켰다. 추출된 파아지는 100 /ml 암피실린(Amp)가 첨가된 2 YT배지에서 배양한 TG1 세포에 감염시킨 다음 연속적으로 M13-K07 헬퍼 파아지로 재감염(superinfection)시켜 증폭시켰다. 30, 하룻밤동안 배양한 다음, 재조 합 파아지입자는 PEG/NaCl 침전하고 원심분리하여 (3,000 X g, 15 min) 200 ml PBS에 정치하였다. 제 4단계 : CMV 특이적인 scfv의 제조 및 분리 상기 제 3단계의 패닝(panning)과정을 4회 반복한 다음, 추출된 파아지를 HB2151 세포 (non-suppressor strain) 와 37 에서 30분간 혼합하고 100 /ml 암피실린을 포함한 2X YT 아가 플레이트에 도말하였다. 30 에서 하룻밤동 안 배양한 다음, 플레이트에서 E. coli 콜로니를 따서 3mL의 2X YT(100 /ml Amp)에서 4시간 동안 배양하였다. 1 mm IPTG를 첨가하고 30 4시간 배양하여 가용성 scfv입자의 발현을 유도하였고, 상기 배양액을 10,000 rpm에서 10분 동안 원심분리하여 가용성 scfv가 포함된 상층액을 취하고 scfv 입자의 항원 결합특이성을 결정하였다, - 5 -
실험결과, 상기와 같은 방법으로 scfv를 pcantab 5E 삽입하여 구축한 scfv 파아지 디스플레이 라이브러리(scFv phage display library)는 4 10 4 클론을 가졌고, 이중 CMV-Mf에 결합특이성을 가진 scfv 클론은 순화된 CMVMf로 코팅된 마이크로역가 플레이트에 4회 반복 패닝(panning)하여 24개의 E.coli를 선별하였다. 패닝(panning)과정 에서 선별된 재조합 파아지는 HRPO(호스 래디쉬 퍼옥시다제)가 접합된 anti-m13 혈청(anticera)을 이용하여 ELIS A하였다. ELISA에서 양성반응을 나타낸 클론의 배양액으로부터 플라스미드를 분리하고 Sfi I/Not I 처리하여 scfv 유전자의 삽입을 확인하였고 이 클론을 HB2151/csf-1이라 명명하였다. IPTG 유도하에서 csf-1의 scfv 항체생산은 이차항체인 anti-e tag antibody를 사용하여 면역블럿팅함으로써 확인 하였는데, 도 1에 나타난 바와 같이 csf-1클론에 의한 항체 발현을 37 에서 4시간 배양한 것이(2) 30 에서 하룻밤 동안 배양한 것(1)보다 더 많이 발현하였다. 상기 본 발명 오이 모자이크 바이러스에 대한 scfv항체 유전자가 삽입된 재조합 벡터 pcsf-1의 대장균 형질 전환체 Escherichia coli HB2151/ pcsf-1이라 명명하고, 2001년 1월 17일자로 생명공학 연구소 유전자은행에 기탁번호 K CTC 18071P로 기탁하였다. 실시예 2 : 하이브리도마 융합에 의한 CMV에 특이적인 단일클론 항체의 생산 비장세포와 SP2/0 골수종(myeloma) 세포를 2 : 1의 비율로 첨가한 혼합액에 PEG(polyethylene glycol)을 넣어 하 이브리도마 융합을 수행하였다. 융합된 세포는 Dulbecco's modified eagle배지(10 mm HEPES, 100 U 페니실린/스 트렙토마이신, 20% 소 태반 혈청, HAT 배지)에서 12일 동안 96개의 웰에서 배양하여 선별하였다. 각각의 웰은 HAT 배지에서 선별한 다음 하이브리도마 세포의 성장으로 체크하였다. 웰로부터 배양된 상층액을 취한 후 ELISA하여 CM V에 특이적으로 결합하는 단일클론항체를 생산하는 하이브리도마 세포주를 선별하였다 ELISA에 있어서, 마이크로역가 플레이트는 4 에서 50uL의 10 /ml 순화된 CMV로 코팅하였다. 플레이트는 1% 소 혈청 알부민(BSA) (Sigma Co.)으로 37 에서 1시간 동안 블럭킹한 다음, 15uL의 배양된 상층액을 각 웰에 첨가하고 37 에서 1시간 동안 배양하였다. 호스 래디쉬 퍼옥시다제(horse radish peroxidase :HRPO)가 접합된 Goat antimouse IgG와 2,2'-azino-bis (3-ethylbenthiazoline-6-sulfonic acid)를 이차항체와 기질로 사용하였다. 실험결과, 120 클론이 SP2/0-Ag14 골수종(myeloma) 세포주에 융합되었다. 이중 두 하이브리도마 세포주 (CMVB7 와 CMV-A5)은 희석분석(limiting dilution assay)후에도 CMV-Mf에 특이적인 단일항체를 생산하였다. Mous e Isotyping kit (Sigma Co.)에 의해 이 두 단일항체는 이소타입으로 밝혀졌다. CMV-B7는 IgM이었고 CMV-A5 는 IgG2b isotype이었으며 이 두 항체 모두 Lκ 체인(kappa light chain)을 가진다. 실시예 3 : ELISA와 웨스턴 블럿을 통한 결합특이성 확인 재조합 파아지의 CMV의 결합 특이성을 확인하기 위하여 ELISA를 실시하였다. 마이크로역가 플레이트는 코팅완충액 (0.1 M NaHCO3, ph 9.2)에 10 /ml 순화된 CMV 또는 대조군으로 BSA 되게하여 4 에서 하룻밤동안 코팅하였다. 3% BSA로 37 에서 1시간 동안 block하였다. 100 의 배양된 상층액을 각 웰에 넣어주고 실온에서 2시간 배양한 다 음 마이크로역가 플레이트 PBS-0.1% tween으로 5번에 씻어주었다. anti-e tag antibody (Amersham Pharmacia Biotech, Sweden)를 각 웰에 넣어주고, 마이크로역가 플레이트를 호스 래디쉬 퍼옥시다제(horse radish peroxidas e : HRPO)가 접합된 goat anti-mouse IgG (Fc specific), PBS-0.1% tween을 넣어주고 시그널을 확인하기 위해 서 ABTS를 첨가하였다. 각 플레이트는 O.D 405 nm에서 ELISA reader (Biorad, Richmond, CA)로 확인하였다. E LISA에서 양성반응을 보인 클론은 웨스턴 블럿하였다. 즉, 동량의 CMV-Fny (서브그룹 I), -LS (서브그룹 II), -M - 6 -
f (서브그룹 I)와 담배 모자이크 바이러스(TMV)를 12% SDS-PAGE한 다음 니트로셀룰로스 멤브레인(nitrocellulo se membrane)으로 옮겨 3% 탈지유( nonfat-dried milk)로 블록킹한 다음, 단일항체 (CMV-A5) 와 scfv (csf1) 배양 상층액에 2시간 동안 반응시킨 다음 anti-e tag 항체와 호스 래디쉬 퍼옥시다제가 접합된 goat anti-mouse IgG (Fc specific)로 반응시킨 후 ECL (Enhanced chemoilluminescence)을 이용하여 X-ray 필림에 노출하여 시그 널을 검출하였다. 실험결과, 도 2에 나타낸 바와 같이, 단일항체 (CMV-A5) (A)와 scfv (csf-1) (B) 모두 CMV-Fny, -LS and Mf와 강하게 반응하였으나 TMV와는 두 항체 모두 반응하지 않아 CMV에만 특이적인 것을 나타내었다. 즉 24 kda의 CMV 외피 단백질에 있어서 서브그룹 비특이적인 부위를 에피톱으로 인식한 것이다. 실시예 4 : 염기서열분석 Qiagen Plasmid Miniprep kit (QIAGEN)를 사용하여 CMV에 특이적인 scfv를 생산하는 HB2151 세포로부터 플라 스미드를 추출하였다. Sfi I과 Not I를 처리한 후 1% 아가로즈 겔에서 전기영동하여 scfv 유전자를 확인하였다. 자동 염기서열 분석을 하기 위하여 pcantab 5E 플라스미드에 Hind III와 Not I을 처리하여 scfv 유전자분리하고 pblue Script SK- 벡터(Stratagene, San Diego, CA)에 서브클로닝 하였다. PCR은 cy5tm AutoCycleTM Sequencing Kit (Amersham Pharmacia Biotech)를 사용하여 수행하였으며 시퀀싱 겔은 long Ranger TM Gel solution (FMC Corp.)을 사용하였다. 자동염기서열분석은 M13 forward 프라이머와 and ALFexpress sequencers (Amersham Ph armacia Biotech)을 사용하였다. 염기서열 호화되는 유전자는 기원함을 분석결과 도 3과 4에 나타낸 바와 같이 V H 는 328bp이며, V L 은 327bp이었고, V H 와 VL 유전자에 의해서 암 아미노산의 염기서열 도 5와 6에 나타낸 바와 같이 H 체인 가변영역(heavy chain variable region : V H ) VH 3 서브그룹에 속하며 VL κ 체인 가변영역(light chain variable region :V kappa) Vκ4 서브그룹에서 알 수 있었다. 상기 VH의 염기서열은 GenBank accession number AF193442로 공지하였고, VL의 염기서열은 GenBank accessi on number AF193443로 공개하였다. 발명의 효과 이상의 실시예를 통하여 명백한 바와 같이, 파아지 디스플레이 라이브러리(Phage display library)를 이용하여 오이 모자이크 바이러스에 특이적인 scfv(single chain variable fragment antibody)를 제조하고 염기서열을 결정함으로 써 식물바이러스병 저항성 작물의 형질전환체 제조를 위한 유전재료로 사용할 수 있고 바이러스 병의 분자 메카니즘을 밝히거나 바이러스를 분류 및 진단하는데 이용될수 있고 또한 본 발명 scfv는 CMV의 단일클론 항체와 동일한 결합특 이성을 가지는 동시에 CMV의 서브그룹 I과 Ⅱ를 모두 인식하는 뛰어난 효과가 있으므로 농산업상 및 식물병 방제산업 상 매우 유용한 발명인 것이다. (57) 청구의 범위 청구항 1. 오이 모자이크 바이러스에 특이적으로 결합하는 scfv(single chain variable fragment antibody)의 V 하는 하기의 염기서열. - 7 - H 체인을 코딩
청구항 2. 오이 모자이크 바이러스에 특이적으로 결합하는 scfv(single chain variable fragment antibody)의 V 하는 하기의 염기서열. - 8 - L 체인을 코딩
청구항 3. 오이 모자이크 바이러스에 특이적으로 결합하는 scfv(single chain variable fragment antibody)의 V 하는 하기의 아미노산 서열. H 체인을 코딩 L 체인을 코딩 청구항 4. 오이 모자이크 바이러스에 특이적으로 결합하는 scfv(single chain variable fragment antibody)의 V 하는 하기의 아미노산 서열. 청구항 5. 제 1항 내지 2항 기재의 염기서열이 링커 펩타이드로 연결됨을 특징으로 하는 오이 모자이크 바이러스의 scfv. 청구항 6. 제 5항 기재의 scfv 유전자를 pcantab 5E에 삽입시켜 구축한 재조합 벡터 pcsf-1. 청구항 7. 제 5항 기재의 scfv 유전자를 유효성분으로 함유함을 특징으로 하는 식물병 진단용 조성물. - 9 -
청구항 8. 제 5항 기재의 scfv 유전자가 삽입된 항체유전자 형질 전환 식물체. 청구항 9. 제 6항에 기재된 상기 재조합 벡터 pcsf-1로 형질전환체 HB2151/pcsf-1(수탁번호:KCTC 18071P) 도면 도면 1 도면 2-10 -
도면 3 도면 4-11 -
도면 5 도면 6-12 -
도면 7 <110> <120> <160> <170> <210> <211> <212> <213> <220> <223> CHA, sanghoon scfv for preventing cucumber mosaic virus disease and recombinant vector producing scfv 4 KopatentIn 1.55 1 328 DNA Artificial Sequence monoclonal anti-cucumber mosaic virus IgM heavy chain variable re gion mrna, partial cds <400> 1 atggcccagg gcaaactgca gcagtcaggg gctgagcttg tgaggccagg ggcctcagtc 60 aagttgtcct gcacagcttc tggcttttac attaaagacg actatatgca ctgggtgaag 120 cagaggcctg aacagggcct ggagtggatt ggatggattg atcctgagaa tggtgatact 180 gaatatgcct cgaagttcca gggcaaggcc actataacag cagacacatc ctccaacaca 240 gcctacctgc agctcagcag cctgacatct gaggacactg ccgtctatta ttgtactatg 300 ctgggaccgg cttactgggg ccaaggga 328 <210> 2 <211> 327 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> monoclonal anti-cucumber mosaic virus IgK light chain variable re gion mrna, partial cds - 13 -
<400> 2 gacatcgagc tcactcagtc tccagcaatc atgtctgcat ctccagggga gaaggtcacc 60 ataacctgca gtgccagctc aagtgtaagt tacatgcact ggttccagca gaagccaggc 120 acttctccca aactctggat ttatagcaca tccaacctgg cttctggagt ccctgctcgc 180 ttcagtggca gtggatctgg gacctcttac tctctcacaa tcagccgaat ggaggctgaa 240 gatgttgcca cttattactg ccagcaaagg agtagttacc cattcacgtt cggctcgggg 300 accaagctgg aaataaaacg ggcggcc 327 <210> 3 <211> 116 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> monoclonal anti-cucumber mosaic virus IgM heavy chain variable re gion <400> 3 Met Ala Gln Gly Lys Leu Gln Gln Ser Gly Ala Glu Leu Val Arg Pro 1 5 10 15 Gly Ala Ser Val Lys Leu Ser Cys Thr Ala Ser Gly Phe Tyr Ile Lys 20 25 30 Asp Asp Tyr Met His Trp Val Lys Gln Arg Pro Glu Gln Gly Leu Glu 35 40 45 Trp Ile Gly Trp Ile Asp Pro Glu Asn Gly Asp Thr Glu Tyr Ala Ser 50 55 60 Lys Phe Gln Gly Lys Ala Thr Ile Thr Ala Asp Thr Ser Ser Asn Thr 65 70 75 80 Ala Tyr Leu Gln Leu Ser Ser Leu Thr Ser Glu Asp Thr Ala Val Tyr 85 90 95 Tyr Cys Thr Met Leu Gly Pro Ala Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Thr Val 100 105 110 Thr Val Ser Ser 115 <210> 4 <211> 109 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> monoclonal anti-cucumber mosaic virus IgK light chain variable re gion <400> 4 Asp Ile Glu Leu Thr Gln Ser Pro Ala Ile Met Ser Ala Ser Pro Gly 1 5 10 15 Glu Lys Val Thr Ile Thr Cys Ser Ala Ser Ser Ser Val Ser Tyr Met 20 25 30 His Trp Phe Gln Gln Lys Pro Gly Thr Ser Pro Lys Leu Trp Ile Tyr 35 40 45 Ser Thr Ser Asn Leu Ala Ser Gly Val Pro Ala Arg Phe Ser Gly Ser 50 55 60 Gly Ser Gly Thr Ser Tyr Ser Leu Thr Ile Ser Arg Met Glu Ala Glu 65 70 75 80 Asp Val Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Arg Ser Ser Tyr Pro Phe Thr - 14 -
85 90 Phe Gly Ser Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys Arg Ala Ala 100 105-15 - 95