Takara 와함께하는 Cloning 2014-11-13 다카라코리아바이오메디칼
목차 Cloning 이란? Cloning Flow Chart Cloning DNA / RNA 추출 High Fidelity PCR 제한효소 /ligation/e.coli 형질전환 Clone 확인 이것만은꼭!!! 2
Cloning 이란? Clone 세포나개체의증식에의해서생긴유전적으로동일한세포군 Cloning 목적 DNA 단편을원하는 plasmid vector 에삽입 유전자공학실험의가장기본이되는기술 3
Cloning flow chart TA-cloning Plasmid Prep & insert 확인 Hind III Nde I Genomic DNA 추출 PCR 제한효소 /Ligation Colony PCR Total RNA mrna 추출 역전사효소이용 cdna 합성 In-Fusion cloning E.Coli 형질전환 E.Coli 4
1. DNA /RNA 추출 작지만강한 MiniBEST / RNAiso Genomic DNA 일반식물조직과 polysaccharide 나 polyphenol 다량함유한식물조직모두적용 Gram+/- 모두적용 Total RNA mrna 일반식물조직과 polysaccharide 나 polyphenol 다량함유한식물조직모두적용 primescript 이용 cdna 합성 [ 자매품 ] RNAiso Plus / RNAiso Blood (9109 / 9113) 5
Cloning flow chart TA-cloning Plasmid Prep & insert 확인 Hind III Nde I Genomic DNA 추출 PCR 제한효소 /Ligation Colony PCR Total RNA mrna 추출 역전사효소이용 cdna 합성 In-Fusion cloning E.Coli 형질전환 E.Coli 6
2. PCR - Cloning 을위한 PCR 효소선택 1. 일반 Taq polymerase TaKaRa Taq, TaKaRa Ex Taq TA-cloning 장점 : PCR 시 A-tailing 되어바로 TA cloning 가능 단점 : PCR 시 DNA 서열에에러발생가능성큼 2. High fidelity 효소 Pfu 계열효소, Pyrobest, PrimeSTAR 시리즈 장점 : PCR 시정확도높음 - 정확한 sequence 를요하는 cloning 에최적 단점 : A-tailing 되지않음 TA cloning 시별도 A-tailing 과정추가됨 증폭효율이 Taq polymerase 만큼좋지않다. DNA, cdna template 양에영향을받는다. PrimeSTAR 로해결가능 7
Cloning flow chart TA-cloning Plasmid Prep & insert 확인 Hind III Nde I Genomic DNA 추출 PCR 제한효소 /Ligation Colony PCR Total RNA mrna 추출 역전사효소이용 cdna 합성 In-Fusion cloning E.Coli 형질전환 Vector, insert 의 15bp 상동서열이용 E.Coli 8
3. PCR 산물의 cloning 제품명 Mighty TA-cloning Kit (6028) Mighty TA-cloning Reagent Set for PrimeSTAR (6019) Mighty Cloning Reagent Set (Blunt End) (6027) 특징 간단하고효율높은 TA cloning kit PrimeSTAR 이용한 PCR 단편의 TA cloning 시사용 PrimeSTAR 이용한 PCR 단편의 cloning 시사용 적용가능한 PCR 단편 Ex Taq, LA Taq 등의 PCR 산물 ( 말단 A 염기있음 ) PrimeSTAR, pyrobest 등의 PCR 산물 ( 말단 A 염기없음 ) PrimeSTAR, pyrobest, Ex Taq, LA Taq 등의 PCR 산물 구성 pmd20-t vector (3270), Ligation mix (6023) A-overhang mix, pmd20-t vector (3270), Ligation mix (6023) 말단인산화용 kinase, puc118 vector, Ligation mix (6023) Vector ( 제품에포함 ) pmd20-t vector pmd20-t vector puc118-hinciii/bap vector 실험법 1) A-tailing 1) 말단인산화 3 A A 3 3 P P 3 TA-cloning 2) TA-cloning 2) puc118 cloning 3 P P 3 Blunt end 9
3-1. TA-cloning kit 경쟁사 제품명 Mighty TA-cloning Kit (6028, TaKaRa) pgem-t Easy Vector System I (Promega) TA Cloning Kit, with pcr 2.1 Vector (Life Technology) 가격 ( 용량 ) 168,000 20 rxns 249,000 20 rxns 204,000 20 rxns 구성 pmd20-t vector Ligation Mighty Mix Positive Control Insert pgem-t Easy Vector Control Insert DNA 2X Rapid Ligation Buffer T4 DNA Ligase pcr 2.1 vector ExpressLink T4 DNA ligase 5X ExpressLink T4 DNA ligation buffer dntps, 10X PCR buffer, control, DW MCS 구성 14 개의제한효소사이트 19 개의제한효소사이트 15 개의제한효소사이트 10
4. 제한효소처리 QuickCut 은 One buffer system 1. Quickcut 시리즈 - Quickcut Enzyme, 10x buffer, 10x green buffer One buffer Quickcut 모두한가지 buffer로반응 사용이쉬운 protocol 1 ul 사용 (< 1 ug DNA 사용시 ) 빠른반응시간 5분-30분반응 10x Green buffer loading dye 포함 11
4-1. TaKaRa 제한효소 Takara Restriction Enzyme 종류 100 종 37 종 샘플적용 첨가양 고농도샘플 (>1 ug) 상관없이사용가능 샘플 1 ug 당 1 U ( 일반적으로 1 rxn 당 1 ul 로사용 ) QuickCut Restriction Enzyme <1 ug 샘플적용가능 (Linear DNA, plasmid DNA) <0.2 ug 샘플적용가능 (PCR product) 1 rxn 당 1 ul 사용 Buffer 종류 Loading dye 미포함 Loading dye 미포함 / 포함 반응조건 30-65, 1 hr 37, 5-15 min Target 고객 고농도샘플이용고객 다양한 restriction enzyme 사용고객 Cloning 고객 <200 ng 이하로사용 (Vec/insert 1:3 기준 ) MCS restriction enzyme 대다수커버 Double digestion 시 buffer 선택용이 빠른반응시간으로 cloning 시간단축 12
4-2. QuickCut 과 MCS T-vector pmd20 의구조 (6028, 6019) puc118 의구조 (6027) 13
5. Gel extraction / DNA purification - MiniBEST [ 제한효소처리후전기영동하여 insert 정제 ] <MiniBEST Agarose Gel DNA Extraction Kit (9762A)> 가열없이실온 (15~25 ) 에서 gel을빠르게녹임 : Heating 불필요 Buffer에 Spin column membrane에최적화된 ph값을갖는지쉽게확인할수있는 ph indicator를포함 ( 추후 yield 예상가능 ) [ 자매품 ] MiniBEST DNA Fragment Purification Kit (9761A) PCR 산물또는효소반응후 DNA 정제에사용 15분내완료, 평균회수율 70~95% primer(<65 nt) 나효소, 그리고 dntp 제거 50 bp~20 kb DNA에적용 14
5-1. Gel extraction Lonza agarose [Lonza Agarose 제품시리즈 `] 50111, 50110 50101, 50100 50071,50070, 50074 50081, 50080, 50084 Low melting Agarose 의적용 DNA, RNA 회수등 low melting temperature agarose 실험에적합 Virus plaque assay 와조직배양세포의 cloning 등에적용가능 15
6. Takara Ligation 관련제품 ligase Code 제품명특징 6022 DNA Ligation Kit Ver. 2.1 Ver.1 의업그레이드, 적은양의 volume 을사용하도효과적으로반응 6023 DNA Ligation Kit <Mighty Mix> Ligation Mix 를 DNA 용액과혼합, 반응후 transformation 6024 DNA Ligation Kit LONG 6025 DNA Blunting Kit 긴단편의 DNA ligation에적합 10 kbp 이상의단편을이용시유용 T4 DNA polymerase의 5 3 polymerase 활성과 3 5 exonuclease 활성을이용하여 DNA 말단을평활화 6027 Mighty Cloning Reagent Set (Blunt End) A-tailing 된 PCR 산물을평활화시킨후 ligation 2011A T4 DNA ligase 가장일반적인 DNA Ligase 2120A 2250A 2660A Alkaline Phosphatase (BAP) Alkaline Phosphatase (CIAP) Alkaline Phosphatase (SAP) DNA 5 말단의탈인산화 Blunt end DNA 의 self-ligation 을막기위해사용 16
Cloning flow chart TA-cloning Plasmid Prep & insert 확인 Hind III Nde I Genomic DNA 추출 PCR 제한효소 /Ligation Colony PCR Total RNA mrna 추출 역전사효소이용 cdna 합성 In-Fusion cloning E.Coli 형질전환 E.Coli 17
7. Transformation Code 제품명용량구성 9057 E. coli DH5α Competent Cells 100 μl 10 Cell, puc19 plasmid SOC medium 9128 E. coli HST08 Premium Competent Cells 100 μl 10 6024 와짝꿍 [DH5α vs. HST08 형질전환효율 ] 18
8. Screening PCR or prep 1. Colony PCR Emerald GT PCR Master Mix (RR310A) 2. Plasmid purification & 제한효소처리 MiniBEST Plasmid Purification Kit (Code 9760A) 로 plasmid 추출 Quickcut 제한효소로 double digestion 후전기영동확인 19
Key 이것만은꼭!! Genomic DNA 추출 MiniBEST 9763, 9763, 9768, 9781 PCR PrimeSTAR R050, R045, R010 TA-cloning 6028, 6019 Plasmid Prep & insert 확인 MiniBEST 9760 Hind III Nde I 제한효소 /Ligation QuickCut, 6023 Colony PCR RR310 Total RNA mrna 추출 RNAiso 9109, 9113 MiniBEST 9767, 9766, 9769 역전사효소이용 cdna 합성 PrimeScript 6110, 2680 In-Fusion cloning E.Coli 형질전환 DH5a 9057, HST08 9128 E.Coli 20
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