주요유방염세균의검출및 항생제감수성검사 임숙경
1. 검사시료 1. 시료채취 유방염우유 2. 체세포수측정 3. 대상세균 - Staphylococcus aureus - Coagulase negative staphylococci -Escherichia coli
3. 균분리방법 E. coli CHEC Agar 직접도말 (37 18-24h) 보라색집락 EMB Agar 배양 금속성광택집락 MacConkey agar 순수분리 분홍색집락을 Vitek, IMViC, API S. aureus/cns Blood agar Gram S. Mannitol salt agar 또는 Baird Parker+RPF(Rabbit plasma fibrinogen 직접도말 (37 18-24h) MSA/ BPA TSA 순수분리 Coagulase test PCR 동정
Escherichia coli CHEC Agar 직접도말 (37 18-24h) 보라색집락 EMB Agar배양 금속성광택집락 MacConkey agar 순수분리 분홍색집락을 Vitek IMViC, API Chromogenic E. coli agar EMB agar MacConkey agar
Staphylococcus aureus Mannitol salt agar 또는 Baird Parker+RPF(Rabbit plasma fibrinogen 직접도말 (37 18-24h) MSA/ BPA TSA 순수분리 Coagulase test PCR 동정 Mannitol salt agar Baird-Parker agar Coagulase test
S. aureus : chroms. aureus agar
Coagulase negative staphylococci S. auricularis (mannitol : negative) S. haemolyticus (mannitol: negative)
Coagulase negative staphylococci S. xylose (mannitol : variable) S. simulans (mannitol : variable)
Staphylococcus spp.& S. aureus PCR Staphylococcus spp. PCR : 791bp Lane 1-10: S.aureus Lane 12: S. simulans Lane 13: S. auricularis Lane 14: S. xylosus Lane 15: S. haemolyticus S. aurueus PCR : 638bp Lane 3-10: S.aureus Lane 14,15: S.aureus
항생제감수성검사 Organism Method Medium Incubation Q/C strains E. coli Disk diffusion Mueller- Hinton agar 35 /16~18h - E. coli ATCC25922 -E. coliatcc35218 (β-lactam/ β-lactamase inhibitor) S. aureus /CNS Disk diffusion Mueller- Hinton agar 35 /16~18h oxacillin, methicillin, and vancomycin for 24h -S. aureusatcc25923 -E. coliatcc35218 (β-lactam/ β-lactamase inhibitor)
5. 항생제감수성검사 : 디스크확산법 검사방법 배지 : Mueller Hinton agar 접종 : 0.5 McFarland 현탁액 배양 : 호기조건에서 35±2 에 16-18시간배양 균접종액의준비
5. 항생제감수성검사 : 디스크확산법 판독기준 : CLSI(Clinical and Laboratory Standard Institute) Control 균주 : E. coli ATCC 25922, E. coli ATCC 35218 S. aureus ATCC 29213
5. 항생제감수성검사 : S. aureus 판정기준 15 - - VA Vancomycin 16 11-15 10 1.25/23.75 SXT Trimethoprim/sulfamethoxazol 19 15-18 14 TE Tetracycline 13-12 2 PRL Pirlimycin 29-28 10 unit P Penicillin 22 18-21 17 NV Novobiocin 13 11-12 10 1 OX Oxacillin 15 13-14 12 10 GM Gentamicin 23 14-22 13 15 E Erythromycin 23 17-22 16 5 ENO Enrofloxacin 21 15-20 14 2 CC Clindamycin 18 13-17 12 C Chloramphenicol 18 15-17 14 CF Cephalothin 21 18-20 17 XNL Ceftiofur 22-21 FOX Cefoxitin 20-19 20/10 AmC Amoxicillin/clavulanic acid S I R 농도 (ug) 약어항생제
5. 항생제감수성검사 : Coagulase negative Staphylococci 판정기준 - 15 VA Vancomycin 16 11-15 10 1.25/23.75 SXT Trimethoprim/sulfamethoxazol 19 15-18 14 TE Tetracycline 13-12 2 PRL Pirlimycin 29-28 10 unit P Penicillin 22 18-21 17 NV Novobiocin 18 17 1 OX Oxacillin 15 13 14 12 10 GM Gentamicin 23 14-22 13 15 E Erythromycin 23 17-22 16 5 ENO Enrofloxacin 21 15-20 14 2 CC Clindamycin 18 13-17 12 C Chloramphenicol 18 15-17 14 CF Cephalothin 21 18-20 17 XNL Ceftiofur 25-24 FOX Cefoxitin 20-19 20/10 AmC Amoxicillin/clavulanic acid S I R 농도 (ug) 약어항생제
5. 항생제감수성검사 : E. coli 항생제 약어 농도 (ug) R 판정기준 I S Amikacin AN 14 15-16 17 Amoxicillin-clavulans acid AmC 20/10 13 14-17 18 Ampicillin AmC 10 13 14-16 17 Cefepime FEP 14 15-17 18 ceftazidime CAZ 14 15-17 18 Ceftiofur XNL 17 18-20 21 Cephalothin CF 14 15-17 18 Chloamphenicol C 12 13-17 18 Enrofloxacin ENO 5 16 17-22 23 Gentamicin GM 10 12 13-14 15 Kanamycin KM 13 14-17 18 Nalidixic acid NA 13 14-18 19 Neomycin NA 12 13-16 17 Streptomycin SM 10 11 12-14 15 Tetracycline TE 11 12-14 15 Trimethoprim/sulfamethoxazol SXT 1.25/23.75 10 11-15 16
Disc diffusion 에영향을미치는요소 1. MH agar - sulfonamide, trimethoprim, tetracycline의 inhibitor 적다 - 대부분의세균이잘자람 2. Thymidine, thymine 의농도 - 농도가높을경우 zone size 작아지고불명확하게나타나 false-resistant 결과초래 3. cations 의농도 -Mg 2+, Ca 2+ 의농도는 P. aeroginosa의 aminoglycoside, 많은균주의 tetracycline의결과에영향을미침 ( 농도가높은경우 zone size가작아지고농도가낮을경우 zone size가커짐 ) - Control 균주를사용하여각lot 별 MH agar 검사 ( 허용범위여부 )
Disc diffusion 영향을미치는요소 4. MH agar 준비 - 배지두께 : 4mm(100mm:25-ml) - ph : 7.2-7.4 - 수분 : 과도한수분이있을때에는 35 10-분방치 5. 디스크보존 - 제조사의지시에따라보관 6. 접종균의탁도 - 0.5 McFarland - 증균 : 모든균주는증균배지에서배양, 검사전날접종 : APP,HPS, S.suis, C. jejuni는 agar에서증균 7. 접종 - 탁도를조정한후 15 분이내에접종
판독시주의사항 1. 오염여부확인 2. 증균여부확인 3. 항생제감수성검사표준균주 : 허용범위내유무확인
항생제감수성검사 Too close
항생제감수성검사 Too close to edge Disc push into agar
항생제감수성검사 Bacterial growth is less dense Disc was moved after it touch agar
주요항생제내성균 메티실린내성황색포도상구균 : Oxacillin, Cefoxitin 반코마이신내성황색포도상구균 : vancomycin 최종확인 : MIC 측정 (E-test)/disc diffusion 내성유전자확인
내성균보관및관리 1. 동결보관 - bead 이용 - Skim milk, glycerol 이용 - Campylobacter spp. : TSBGB 이용 * deef freezer : -70 를일정하게유지 2. 내성균관리번호 고유번호체계 : 기관명 - 년도 - 기원 - 균종 - 각기관에서분리되는 일련번호 * 각기관고유번호저장 항생제감수성검사시고유번호체계로정정 * 모든균주는 3 년이상보관
실습 2008. 11. 14( 금 ) 오전 (10:-12:00) 균종별선택배지 colony 관찰 Colony PCR 수행 2008. 11. 14( 금 ) 오후 (13:10-14:50) Disc diffusion 검사 - 탁도조정, spread( 장비이용 ) - 판독 : 장비, 육안판독 균stock 방법 표준균주수령 : 광역시
토의 1. 2009 년검사계획 ( 안 ) - 농가당 3 개이하로입력할것 2. 개선내용 3. 건의사항
감사합니다!