한국어병학회지제 22 권제 1 호 (2009) J. Fish Pathol., 22(1):23 ~ 33 (2009) 4... 해산어류에서분리된 Vibrio harveyi 의혈청학적특성과항원성 오윤경 김명석 박명애 김진우 조지영 정현도 국립수산과학원병리연구과, 순천향대학교해양생명과학과, 부경대학교수산생명의학과 Serological characteristics and antigenicities of Vibrio harveyi isolated from marine cultured fish Yun-Kyeong Oh, Myoung Sug Kim, Myoung Ae Park, Jin Woo Kim, Ji Young Cho and Hyun Do Jeong Pathology Division, National Fisheries Research and Development Institute, Busan 619-902, Korea Deptartment of Marine biotechnology, Soonchunhyang University, Asan 336-745, Korea Department of Aquatic Life Medicine, Pukyong National University, Busan 608-737, Korea Vibrio harveyi was a significant pathogenic agent and cause a high mortality of cultured fish and shrimp in the aquaculture industry. In this study, we have investigated biochemical, physiological, serological and immunological characteristics of V. harveyi isolated from marine cultured fish. The phenotypes of V. harveyi were differentiated with their own biochemical characteristics and colors of colony on the TCBS agar. V. harveyi were classified into more than four serogroups by agglutination test. Most isolates were classified into a group A which is categorized with the same band pattern generated by western blotting. Group A was characterized by a major protein, which is ranged from 26 and 34 kda in size, and has a virulence to oliver flounder more than reference strain KCCM40866. Oliver flounders vaccined with FKC of V. harveyi C05011 were highly resistant to infection by other strains of group A. Key words: Vibrio harveyi, Classification, Antigenic protein, Agglutination, Western blotting 국내에서양식되는어류의주요세균성질병 은 Edwardsiella tarda 에의한에드워드병, Lactococcus garviae, Streptococcus iniae, S. parauberis 에의한연쇄구균병및 Vibrio harveyi, V. ichthyoenteri, V. ordalii, Listonella anguillarum, V. parahaemolyticus, V. vulnificus 등에의한비브리오증이다 ( 김등, 2006). 비브리오증의원인체중의하나인 V. harveyi 는무척추동물인새우류에감염되는 luminescence Vibrio로알려져있으며, larval stage 또는 post larval stage에감염되어 100% 폐사를일으키는심각한질병의하나로알려져있고 (Sunaryanto and Malium, 1986; Lavilla-Pitogo et Corresponding Author : Myoung Sug Kim, Tel : 051-720-2476 Fax : 051-720-2498 E-mail : mskim@nfrdi.go.kr al., 1990) 척추동물인양식넙치에감염되어폐사를일으킨다고알려져있다 (Alvarze et al., 1998; 원등, 2006). 세균성질병의단독또는혼합감염은항생제를사용하여치료하는경우가대부분이나이것은항생제오 남용으로인한내성균발생 (Karunasagar et al., 1994) 과환경오염 (Kerry et al., 1995) 등 2차적인문제가발생할수있기때문에치료보다는예방이중요하며전염병예방을위해서는질병을일으키는원인병원체에대한정확한이해와분류가필요하다. Haemolysin 등의독소를포함한 ECP, 균체항원, 협막항원, 편모항원및기타항원인자등의 23

24 오윤경 김명석 박명애 김진우 조지영 정현도 독성인자들에대한연구는질병예방을위해필요한데 (Santos et al., 1995; Balebone et al., 2005), 질병예방을위해어류에백신을접종한어류에서새로운혈청형의세균이분리되는경우가보고되고있다. 이스라엘에서 S. iniae에의한연쇄구균증을예방하기위해백신을접종한무지개송어 (Oncorhynchus mykiss) 에서분리된 S. iniae 는 PCR과혈청학적방법에의해새로운혈청형으로구분되었다 (Bachrach et al., 2001). 스페인에서 V. vulnificus serovar E에대한백신을접종한뱀장어에서새로운혈청형인 serovar A의 V. vulnificus가분리되어 (Fouz and Amaro, 2003) 세균의면역학적인분류와특성조사는효과적인백신의제조에있어매우중요한문제이다. 세균의혈청학적분류는균체항원, 협막항원, 편모항원및기타항원에의해구분되고, 이런 (Table 1) 와표준균주 KCCM40866 (=ATCC1412 항원들은역학조사나종의세분화및균동정에이용된다 (Park et al., 1983; Obata-Yasuoka et al., 2002). V. parahaemolyticus의혈청형은균체항원 후 API 20E kit (biomerieux, France) 를사용하여 과협막항원의조합으로분류되기도하며 (Gil 생화학적성상을비교하였다. 실험방법은순수 et al., 2007), Vibrio 는고체배지에서 swarming 운 Table 1. Isolates of Vibrio harveyi used in this study Strains Isolated Year 동에관여하는 larteral flagella에의하여혈청형이구분되기도한다 (Shinoda et al., 1992). 세균성질병을예방하기위한백신의대상균주를선정하기위하여세균의혈청학적검토와세균종내의공통항원유무를확인하는것이필요하므로생화학적, 혈청학적방법과세균의세분에이용되는 SDS-PAGE (Pizzutto and Hirst, 1995) 와 western blotting으로확인되는항원성을갖는단백질의비교로어류에서분리되는 V. harveyi를분류하고자하였다. 재료및방법 Vibrio harveyi 의생화학적성상비교 넙치등국내양식어류에서분리된 V. harveyi 6) 를 1% NaCl 이첨가된 BHIA (Brain Heart Infusion Agar, Difco) 배지에서 25, 24 시간배양한 배양된집락을제조사의방법에따라스트립에 color of colony Source Geographical location on TCBS* E05003 2002 red seabream(pagrus major) Tongyeong green E05005 2002 red seabream(pagrus major) Tongyeong green E05006 2002 red seabream(pagrus major) Tongyeong green E05007 2002 red seabream(pagrus major) Tongyeong green E05008 2002 black rock fish(sebastes inermis) Tongyeong yellow E05009 2002 rock fish(sebastes schlegeli) Tongyeong yellow C05011 2002 flathead mullet(mugil cephalus) Tongyeong yellow A05022 2003 olive flounder(paralichthys olivaceus) Wando yellow FP4110 2004 olive flounder(paralichthys olivaceus) Jeju green FP4138 2004 olive flounder(paralichthys olivaceus) Ulsan yellow FP5201 2005 rock fish(sebastes schlegeli) Tongyeong yellow * : Thiosulfate Citrate Bile Salt Sucrose agar

해산어류에서분리된 Vibrio harveyi 의혈청학적특성과항원성 25 접종하고, 25 에서 24시간동안배양한후결과를판정하였다. 분리균주의배양조건에따른발육시험분리균주의성장에미치는 ph, NaCl 농도, 온도의영향을조사하였다. ph의영향을조사하기위하여 1N NaOH와 1N HCl을첨가하여 ph 4, 7, 9로제작한 BHIB (Brain Heart Infusion Broth, with 1 % NaCl) 에분리균주를접종하여 25 에서 24시간동안배양한후관찰하였다. 세균의성장에미치는 NaCl의영향을알아보기위하여 BHIA에 NaCl을첨가하여 NaCl 농도가 1.5, 2.5, 3.5, 4.5, 5.5, 6.5, 7.5, 8.5, 9.5, 10.5 % 가되도록조절한후분리균주를도말하여 24시간배양한후관찰하였다. 온도의영향을확인하기위하여 1 % NaCl을첨가한 BHIA에 V. harveyi를도말하여슬라이드글라스에 V. harveyi에대한토끼항 10, 15, 25, 35, 45 에서 24시간배양후집락을혈청을 25 μl떨어뜨리고 V. harveyi HKC 또는관찰하였다. FKC를 25 μl떨어뜨린후잘섞어 30초이내에응집형성유무를확인하였다. FKC (Formalin Killed Cell) 과 HKC (Heat Killed Cell) 제작 FKC 는분리균주 FP4138, E05003, C05011 와 참조균주 KCCM40866 을 3 % NaCl 이첨가된 BHIB에접종하여, 25 에서 24시간동안배양수에현탁하여흡광도 600 nm에서 2.0으로조절 한후생리식염수에현탁하고최종적으로 0.3 % 가되도록 37 % formaldehyde 을첨가하였다. 이것 을 4 에서 24 시간동안유지시키고 7,000 rpm 에서 15분간원심분리하여 0.02 % sodium azaide 가첨가된생리식염수에현탁하고 100 mg / ml의습중량으로맞춘후 4 에보관하였다. HKC는 3 % NaCl이첨가된 BHIA에도말하여 25 에서 24시간동안배양된 V. harveyi를생리식염수에현탁하여 100 에서 15분동안가열하고원심분리하였다 (Abbott et al., 1980). 회수된균을 0.02 % sodium azaide가첨가된생리식염수에현탁하여농도를 100 mg / ml로맞춘후사용할때까지 4 에서보관하였으며 1주일안에사용하였다. V. harveyi에대한토끼의 polyclonal antibody제작제작된 4 종류의 FKC를 FCA (Freund s Adjuvant Complete, Sigma) 와 1:1로혼합하여농도를 50 mg / ml로맞춘후건강한토끼의피하에 2ml씩주사하였다. 2주후동량의 FIA (Freund's Adjuvant Incomplete, Sigma) 와혼합한 FKC를동일한방법으로주사한다음, 다시 2주후동량의 FKC를멸균된생리식염수와 1:1로혼합하여주사하였다. 마지막주사후 2주째에토끼의심장에서채혈하여실온에서 1시간유지하고 4 에서 overnight 시킨후 6,000 rpm에서 10분간원 심분리하여혈청을분리하였고사용할때까지 -80 에서보관하였다. Slide agglutination SDS-PAGE 3% NaCl이첨가된 BHIB와 BHIA에접종하여 25 에서 24시간배양한 V. harveyi를생리식염 하여균수를일정하게조절하였다. 30초간격으로 10분간 sonicate한다음2 sample buffer (0.12 M Tris-HCl, 4 % SDS, 20 % glycerol, 5 mm 2-mercaptoethanol) 와 1:1로혼합후100 에서 10분간끓여서준비하였다. 12 % SDS-polyacrylamide gel에준비된시료를 15 μl씩 loading하고 100 V에서 2시간동안전기영동하였다. 전기영동이끝난 gel은 Coomassie brilliant blue R-250으로염색하고탈색하여관찰하였다. Immunoblotting analysis SDS-PAGE한 gel에 Nitricellulose membrane (NC) paper (Amersham Biosciences, Germany) 를얹어서 100 V에서 1시간동안 transformation

26 오윤경 김명석 박명애 김진우 조지영 정현도 (BIO-RAD) 하였고, 그후 NC paper를 Tween 20 이포함된 PBS (T-PBS) 로 5회세척한후 1 % BSA (Bovine Serum Albumin, Sigma) 로 1시간동안 blocking 하였다. T-PBS로 5회세척한후앞서제작한 4 종류의토끼항혈청을각각 1/100로희석하여 4 에서 overnight 시킨후 T-PBS로 5회세척하였다. 2차항체로는 anti-rabbit IgG (Sigma) 를 1/5,000로희석하여 1시간동안반응시킨후 T-PBS 로 5회세척하여 BCIP (5-Bromo-4-Chloro-3-Indolyl Phosphate, Sigma) 와 NBT (Nitro Blue Tetrazolium, Sigma) 를첨가하여발색시켜관찰하였다. 면역후방어력조사평균체중 15 g의넙치에 FCA와 1:1로혼합한 V. harveyi C05011 FKC를 10 mg / kg body weight로 0.1 ml씩복강주사하였다. 2주후같은방법으로 FKC와 FIA를 1:1로혼합하여주사하였다. 수온은 25 를유지하고 1일에 1회씩사료를 주었다. 항원을주사한넙치는 2차주사후2주일째인위감염실험을실시하였다. 공격실험은 Slide agglutination에의한v. harveyi의구분 4 개의균주 FP4138, E05003, C05011, KC- CM40866 를사용하여실시하였다. 3.5 % NaCl 이 첨가된 BHIA 에도말하여 25 에서 24 시간배 양한 V. harveyi 균주는생리식염수에현탁하여 FP4138, C05011, KCCM40866에대한항혈청은 균수를 1 10 8 CFU/ ml으로조절하였으며, 넙치 를 MS-222 로마취한후세균현탁액을 0.1 ml 씩 10 마리에복강주사하였고, 수온은 25 를유 지하였다. 폐사어는해부후신장과비장으로부터균을분리하여 1 % NaCl이첨가된 BHIA와 TCBS agar에도말하여원인균을확인하였다. 균주는 ONPG, ADH, H2S, URE, TDA, VP, INO, RHA, MEL, ARA의 10개항목에서음성이었고 ADH, IND, GLU, MAN, AMY, OX의 6개항목에서양성이었다. ODC, CIT, GEL, SOR, SAC의 5 개항목은균주별로차이가있었다 (Table 2). 분리균주의배양조건에따른발육시험분리균주의성장에영향을미치는온도, ph, NaCl 농도에관하여조사한결과대부분의균주가 25~35 에서잘자랐으나 10, 45 에서는자라지못하였으며 15 에서는집락을형성 하였으나 25~35 에비해집락의크기가작았 다. 모든균주가 ph 9 에서는증식하였으나 ph 4 에서는증식하지못하였다. 염분농도에따른발 육실험에서는대부분의균주가 7.5 % 까지잘자 랐으며 8.5 % 에서는 E05007과 E05008의 2 균주가자랐으나다른균주들은자라지못하였다 (Table 3). FP4138, E05003, C05011, KCCM40866 균주에 대한토끼항혈청으로슬라이드응집반응을실 시한결과항원으로 live cell 을사용하였을경우 각각 FP4138, C05011, KCCM40866과응집반응이일어났고다른균주들과교차응집이생기지않았다. E05003에대한항혈청은 FP4110, E05003, E05005, E05006과응집반응이일어났다. 항원으로 HKC를사용하여응집반응을실시하였을때에는 4종류의항혈청모두조사한 V. harveyi 균주에서응집이일어났다 (Table 4). 결과분리균주의생화학적성상 API 20E kit를사용하여생화학적성상을조사한결과11개의분리균주와 KCCM40866의생화학성상이모두유사하게나타났다. 모든 12 SDS-PAGE profile 3종의분리균주 FP4138, E05003, C05011과 KCCM40866에대하여 SDS-PAGE로단백질 pattern을분석하였을때 34~48kDa 사이에서 luminosense V. harveyi인 KCCM40866에있는 A3 band를분리균주는갖고있지않았다. 분리

해산어류에서분리된 Vibrio harveyi 의혈청학적특성과항원성 27 균주사이에도 FP4138의 A1 band는다른두개의분리균주에서보이지않으며대신 E05003과 C05011에는조금작은크기의 A2 band가있었다 (Fig. 1). SDS-PAGE에서고체배지에서배양한것과액체배지에서배양한것의 band pattern 은차이가있었으나 A1, A2, A3 위치에서는차이를구별할수없었다 (Fig. 1). Immunoblotting analysis 3종의분리균주 FP4138, E05003, C05011와 KCCM40866에대하여각항체별로 western blot 을실시한결과는 26~34 kda 사이에서 KC- CM40866과분리균주사이에뚜렷한차이가있었다. FP4138, E05003, C05011은 34 kda 보다 Table 2. Biochemical characteristics of Vibrio harvayi isolates and reference strain by API 20E system Test Strains FP4110 FP4138 FP5201 E05003 E05005 E05006 E05007 E05008 E05009 C05011 A05022 KCCM 40866 ONPG - - - - - - - - - - - - ADH - - - - - - - - - - - - LDC + + + + + + + + + + + + ODC + - + + + + + + + + + + CIT + + - + + + + + + + + + H2S - - - - - - - - - - - - URE - - - - - - - - - - - - TDA - - - - - - - - - - - - IND + + + + + + + + + + + + VP - - - - - - - - - - - - GEL - - - + - - - - - + + - GLU + + + + + + + + + + + + MAN + + + + + + + + + + + + INO - - - - - - - - - - - - SOR + + - + + + - + + + + - RHA - - - - - - - - - - - - SAC - - + - - - + + + + + + MEL - - - - - - - - - - - - AMY + + + + + + + + + + + + ARA - - - - - - - - - - - - OX + + + + + + + + + + + + ONPG, beta-galactosidase; ADH, arginine dihydrolase; LDC, lysine decarboxylase; ODC, ornithine decarboxylase; CIT, citrate utilization; H2S, H2S production; URE, urease; TDA, tryptophane desaminase; IND, indole production; VP, acetoin production; GEL, gelatinase; GLU, glucose fermentation; MAN, mannitol fermentation; INO, inositol fermentation; SOR, sorbitol fermentation; RHA, rhamnose fermentation; SAC, sucrose fermentation; MEL, melibiose fermentation; AMY, amygdalin fermentation; ARA, arabinose fermentation; OX, cytochrome-oxidase.

28 오윤경 김명석 박명애 김진우 조지영 정현도 Table 3. Physiological characteristics of the Vibrio harvayi isolates and reference strain Test Strains FP4110 FP4138 FP5201 E05003 E05005 E05006 E05007 E05008 E05009 C05011 A05022 KCCM 40866 10 - - - - - - - - - - - - 15 + + + + + + + + + + + + Temp. ( ) 25 + + + + + + + + + + + + 35 + + + + + + + + + + + + 45 - - - - - - - - - - - - 4 - - - - - - - - - - - - ph 7 + + + + + + + + + + + + 9 + + + + + + + + + + + + 1.5~ 6.5 + + + + + + + + + + + + NaCl 7.5 + + + + w* + + + + + + + (%) 8.5 - - - - - - w + - - - - 9.5 - - - - - - - - - - - - 10.5 - - - - - - - - - - - - * : weak Table 4. Slide agglutination of Vibrio harveyi isolates and reference strain Live cell Antisera against FP4138 E05003 C05011 HKC Antisera against Antigen KCCM KCCM 40866 FP4138 E05003 C05011 40866 - +++ - - FP4110 + +++ +++ + +++ - - - FP4138 +++ ++ +++ ++ - - - - FP5201 ++ ++ +++ +++ - +++ - - E05003 ++ +++ +++ ++ - +++ - - E05005 ++ +++ +++ ++ - +++ - - E05006 + +++ +++ ++ - - - - E05007 +++ + +++ ++ - - - - E05008 ++ +++ +++ ++ - - - - E05009 ++ +++ +++ +++ - - +++ - C05011 +++ +++ +++ +++ - - - - A05022 +++ + +++ +++ - - - +++ KCCM 40866 +++ +++ +++ +++ -, no agglutination ; +, weakly agglutination ; ++, middly agglutination ; +++, strong agglutination

해산어류에서분리된 Vibrio harveyi 의혈청학적특성과항원성 29 작은 B2 band가 major protein이었고 KC- CM40866은약34 kda 크기의 B1 band가 major protein이었다 (Fig. 2). 면역후방어력인위감염후면역시킨실험구에서 2주동안한마리의폐사도나타나지않았으나대조구는 FP4138, E05003, C05011 균주에대해 70~100 % 폐사율을나타냈으며, KCCM40866 균주에대해서는폐사가전혀나타나지않았다. 폐사는 1일째부터시작하여 3일째까지지속되었으며그이후로는폐사가나타나지않았다 (Fig. 3). 고찰 배양온도 15~35 사이에서성장하였고 ph 9에서는모든균주가자랐으며 ph 4에서모든균주가자라지못하였으나균주별로차이가없어생리적인특성에의해 V. harveyi 분리균주들사이의차이를구별할수는없었다. TCBS agar에서의성상, 분리지역, 분리어종을비교하여 3개의분리균주, FP4138, E05003, C05011과참조균주 KCCM40866를선정하여혈청학적인실험을실시하였다. 분리균주의혈청형을알아보기위하여제작된 4종류의토끼항혈청으로슬라이드응집반응을실시하였는데 3 % NaCl 이첨가된 BHIA 에서배양된 V. harveyi 와토끼항혈청의슬라이드응집반응은 FP4138, C05011, KCCM40866 에대한항혈청은각각 FP4138, C05011, KCCM40866 과응집반응이일 V. harveyi에감염된넙치는복부팽만, 탈장, 지어났고다른균주들과교차응집이없었다. 느러미갈라짐등의외부증상과출혈성복수, E05003에대한항혈청은 FP4110, E05003, 간 장출혈, 비장위축등의내부증상을나타낸 E05005, E05006과응집반응이일어났는데이 4 다고하였으며 (Soffientino et al., 1999) 우리나라개의균주들은 TCBS agar에서녹색집락을형에서양식넙치에감염되어폐사를일으키기도성하는공통점이있었고생화학적성상도하였으나 ( 원등, 2006) 분리균주의특성연구는 E05003이 GEL에양성을나타내어다른 3개의미흡한실정이다. 균주들과차이가있는것을제외하고모두일치 V. harveyi 분리균주는비브리오균의선택배양하여아주유사한균주들이라고생각된다. 에많이사용되는 TCBS agar에서형성되는집 Aeromonas는액체배지에서배양할때 swimming 운동에관여하는 polar flagella (M-flagella) 락의색깔이동일하지않고일부는녹색집락을형성하며다른것들은노란색집락을형성하여와고체배지에서 swarming 운동에관여하는 lateral flagella (L-flagella) 의두형태의편모가존재 (Table 1) TCBS agar에서의집락의색깔로 V. harveyi를추정할수없었으며 API 20E kit를이용한한다고하였는데 (Kirov et al., 2004) Vibrio도액생화학적실험에서균주별로일부항목에서차체배지에서는 M-flagella가형성되고고체배지에이가있어 (Table 2) V. harveyi 분리균주는동일서는 M-flagella와 L-flagella가모두형성이된다한표현형이아니었다. 고하였다 (Shinoda et al., 1985). 이번연구결과 V. harveyi는염분농도0.5~8 %, 배양온도 40 는액체배지에서자란 V. harveyi를이용하여토끼미만에서성장할수있다고하였는데 (Ortigosa 항혈청을만들었기때문에토끼항혈청에는 L- et al., 1994) 이번연구에서도 2개균주는 8.5 % flagella에대한항체는없으며슬라이드응집반에서도성장하였으나대부분 NaCl 농도 7.5 % 응은 V. harveyi의 M-flagella와토끼항혈청의까지성장하였고고염분인 12 % 까지자랄수있 M-flagella에대한항체사이의응집반응이다. 따는 V. alginolyticus (Ortigosa et al., 1994) 와다르게라서 V. harveyi는 L-flagella에의하여 3가지의 9.5% 이상에서는자라지못하였다. 이균주들은혈청형으로구분된다고알려져있으나 (Shinoda

30 오윤경 김명석 박명애 김진우 조지영 정현도 Fig. 1. Comparison by SDS-PAGE of the protein profiles of Vibrio harveyi whole cell. Lane M, prestain marker; lane 1, FP4138 cultured on agar media; lane 2, E05003 cultured on agar media; lane 3, C05011 cultured on agar media; lane 4, KCCM40866 cultured on agar media; lane 5, FP4138 cultured in liquid media; lane 6, E05003 cultured in liquid media; lane 7, C05011 cultured in liquid media; lane 8, KCCM40866 cultured in liquid media. A1, A2 and A3 indicate distinguished bands of bacterial protein between 34kDa and 48kDa. (a) (c) Fig. 3. Cumulative mortality of olive flounder immunized with a formalin killed Vibrio harveyi C05011 and nonimmunized control challenged with V. harveyi FP4138, E05003, C05011 and KCCM40866. (b) (d) Fig. 2. Western blot analysis of antigenic protein from Vibrio harveyi. (a), antiserum against FP4138; (b), antiserum against E05003; (c), antiserum against C05011; (d), antiserum against KCCM40866. Lane M, prestain marker; lane 1, FP4138 cultured on agar media; lane 2, E05003 cultured on agar media; lane 3, C05011 cultured on agar media; lane 4, KCCM40866 cultured on agar media; lane 5, FP4138 cultured in liquid media; lane 6, E05003 cultured in liquid media; lane 7, C05011 cultured in liquid media; lane 8, KCCM40866 cultured in liquid media. B1 indicates the 34 kda major protein band of KCCM40866 and B2 indicates the 34 kda major protein band of C05011.

해산어류에서분리된 Vibrio harveyi 의혈청학적특성과항원성 31 et al., 1992) M-flagella에의해서도여러혈청형으로구분이될수있을것이라생각된다. 세균에열을가하여 HKC를만들게되면열에약한 flagella는없어지고열에안정한균체항원은남게되는데 (Abbott et al., 1980) 11개분리균주와 KCCM40866의 HKC는 4개의토끼항혈청과반응하여모두응집반응이일어나기때문에 V. harveyi의균체항원에균주들사이의공통항원이존재하는것을알수있었다. 세균의혈청형은많은종류가보고되고있어대만에서분리된 3,743개의 V. parahaemolyticus 는 40개의혈청형으로구분되었는데 (Chiou et al., 2000) 이번연구에서사용한 4개의항혈청으로 V. harveyi의혈청형을명확히구별할수는없었으나편모항원에의해최소 4개의혈청형이 확인되었고 HKC의균체항원에있어서도항혈 Group A에속하는 C05011의 FKC로넙치를면 청과강한응집반응이일어나는균주와약한응집반응이일어나는균주가있어여러혈청형이 있을가능성이있다고생각된다. 않아 group A 균주들사이에는교차방어효과가 균주간의단백질성상의차이를알아보고자 있었다. 이것은 V. harveyi는 flagella의편모항원 SDS-PAGE로단백질 pattern을분석해본결과 에따라여러종류의혈청형으로구분이되었지 34~48 kda 사이의 band 에서균주들사이에조 금다른 pattern 을나타냈다. 새우에서분리된 V. harveyi는 42 kda의단백질을갖는 group Ⅰ, 40 kda의단백질을갖는 group Ⅱ 그리고두개의 단백질을모두갖지않는기타 group 으로구분 되었는데 (Pizzutto and Hirst, 1995) KCCM40866 에있는 A3 band 를분리균주는갖고있지않았 으며분리균주사이에도 FP4138의 A1 band는다른두개의분리균주에서보이지않으며대신 E05003과 C05011에는조금작은크기의 A2 band가있어pizzutto와 Hirst (1995) 의결과와유사하였다. 4종류의항혈청을사용한 western blotting에서균주들사이의항원단백질 profile의차이를명확히구별할수있었다. V. harveyi의항원단백질은 SDS-PAGE의결과와다르게 34~48 kda 사이에서균주들사이의차이를확인할수없었다. Western blotting 결과는 26~34 kda 사이에서 KCCM40866과세개의분리균주 사이에뚜렷한차이를보여주었는데, 즉, 34 kda 보다작은 B2 band가 major protein으로나타난 FP4138, E05003, C05011 (group A) 과 34 kda 크기의 B1 band가 major protein 인 KC- CM40866 (group B) 로 2개의 group이명확히구분되었다. FP4138, E05003과 C05011은유사한항원성을갖는균주로확인되었으나 TCBS 배지에서의집락색깔 (Table 1) 과생화학적성상의차이가있는 (Table 2) 다른표현형의균주들이므로 SDS-PAGE에의한단백질 profile의차이도표현형의차이라고생각된다. Group A 에속하는세개의균주를넙치에인 위감염시켰을때폐사가발생하였으나 KC- CM40866 은넙치의폐사를유발하지않아병원 성에있어서도두 group 사이에차이가있었다. 역시킨후 V. harveyi 를인위감염시켰을때면역 을시킨실험구에서한마리의폐사도나타나지 만분리균주의균체항원에일정부분의공통항 원이있어 V. harveyi에대한방어능을갖게되는것으로생각된다. 발광능이있는것으로알려진 V. harveyi KC- CM40866은발광능을갖는 luciferase alpha subunit (luxa) gene을증폭시키는 PCR 법 (Wimpee et al., 1991) 에의해양성산물이증폭되었으나 FP4138, E05003, C05011 (group A) 은음성으로나타났다 (data not shown). LuxA gene이없어 non luminous V. harveyi로추정되는 FP4138, E05003, C05011 균주들은 SDS-PAGE와 western blot의결과에서 luminous V. harveyi KC- CM40866과차이가있어 luminous V. harveyi와 non luminous V. harveyi는발광능의차이와함께 SDS-PAGE에서의표현형및항원단백질의차이가있다고생각된다. KCCM40866 이외의 goup B에속하는균주들을수집하여비교하지못하였으나최등 (2007) 도

32 오윤경 김명석 박명애 김진우 조지영 정현도 조피볼락에서 luminous V. harveyi는병원성이낮고 non luminous V. harveyi는병원성이높다고하여이번연구와같이 luminous 표현형에따라특성의차이가있으므로 V. harveyi에대한항원단백질의추가적인연구가필요할것이라생각된다. ed with a Streptococcus vaccine. Applied and Environmental Microbiology. 67, 3756-3758, 2001. Balebone, M.C., Magarinos, B., Toranzo, A.E. and Morinigo, M.A.: Effectiveness of a divalent vaccine for sole, Solea senegalensis (Kaup), 감사의글 against Vibrio harveyi and Photobacterium damselae subsp. piscicida. J. Fish Dis., 28, 이연구는국립수산과학원 ( 양식생물백신연구, RP-2008-AQ-136) 의지원에의해운영되었습니다. 33-38, 2005. Chiou, C.S., Hsu, S.Y., Chiu, S.I. and Wang, T.K. and Chao, C.S.: Vibrio parahaemolyticus serovar O3:K6 as cause of unusually high 요 약 incidence of food-borne disease outbreaks in Taiwan from 1996 to 1999. J. Clinical Microbiology, V. harveyi는양식산업에서중요한해산양식어류와새우류에많은폐사를일으키는병원체로알려져있다. 본연구에서는해산양식어류에서분리된 11개 strain의 Vibrio harveyi의생화학적, 생리학적, 혈청학적, 면역학적특성을조사하였다. 생화학적특성과 TCBS agar에서집락의색깔이달라표현형의차이가있었고 V. harveyi 분리균주들은편모항원에의해 4개이상의혈청형으로구분되었다. 어류에서분리된 V. harveyi 는 western blotting으로 26~34 kda 사이에동일한크기의 major protein을갖는group A로구분되었고넙치에대하여표준균주인 V. harveyi KCCM40866 보다강한병원성을갖고있었다. V. harveyi C05011로면역유도된넙치는다른 group A 균주를인위감염시켰을때높은항병력을나타내었다. 38, 4621-4625. 2000. Fouz, B. and Amaro, C.: Isolation of a new serovar of Vibrio vulnificus pathogenic for eels cultured in freshwater farms. Aquaculture, 217. 677-682, 2003. Gil, A., Miranda, H., Lanata, C., Prada. A., Hall, E., Barreno, C., Nusrin, S., Bhuiyan, N., Sack, D. and Nair, G.: O3:K3 Serotype of Vibrio parahaemolyticus identical to the global panademic clone associated with diarrha in Peru. Int. J. Infect. Dis. 11, 324-328, 2007. Karunasagar, I., Pai, R., Malathi, G.R. and Karunasagar, I.: Mass mortality of Penaeus monodon larvae due to antibiotic resistant Vibrio harveyi infection. Aquaculture, 128, 203-209, 1994. Kerry, J., Hiney, M., Coyne, R., NicGabhaim, S., 참고문헌 Gilroy, D., Cazabon, D. and Smith, P.: Fish feed as a source of oxytetracycline resistant Abbott, J.D., Dale, B., Eldrige, J., Jones, D.M. and bacteria in the sediments under fish farm. Sutcliffe, E.M.: Serotyping of Campylobacter Aquaculture, 131, 101-113, 1995. jejuni/coli. J. Clin. Pathol., 33, 762-766, 1980. Kirov, S.M., Castrisios, M. and Shaw, J.G.: Bachrach, G., Zlotkin, A.,Hurvitz, A., Evans, D. Aeromonas flagella (polar and lateral) are and Eldar, A.: Recovery of Streptococcus enterocyte adhesins that contribute to iniae from diseased fish Previously vaccinat- biofilm formation on surfaces. Infect. Im-

해산어류에서분리된 Vibrio harveyi 의혈청학적특성과항원성 33 mun., 72, 1939-1945, 2004. Lavilla-Pitogo, C. R., Baticados, M. C. L., Cruz- Lacierda, E. R. and Pena, L. D.: Occurrence of luminous bacterial disease of Penaeus monodon larvae in the Philippines. Aquaculture, 91, 1-13. 1990. Obata-Yasuoka, M., Ba-Thein, W. and Tsukamoto, T.: Vaginal Escherichia coli share common virulence factor profiles, serotypes and phylogeny with other extrain testinal E. coli. Microbiol., 148, 2745-2752, 2002. Ortigosa, M., Garay, E. and Pujalte, M.J..: Numerical taxonomy of Vibrionaceae isolated from oysters and seawater along an annual cycle. System. Appl. Microbiol., 17, 216-225, 1994. Park, S.I., Wakabayashi, H. and Watanabe, Y.: Serotype and virulence of Edwardsiella tarda isolated from eel and their environment. Fish Pathol., 18, 85-89, 1983. Pizzutto, M and Hirst, R.G.: Classification of isolates of Vibrio harveyi virulent to Penaeus monodon larvae by protein profile analysis and M13 DNA fingerprinting. Dis. Aquat. Org., 21, 61-68, 1995. Santos, Y., Pazos, F., Bandi n, I. and Toranzo, A.: Analysis of antigens present in the extracellular products and cell surface of Vibrio anguillarum serotypes O1, O2, and O3. Appl. Environ. Microbiol., 61, 2493-2498, 1995. Shinoda, S., Nakahara, N., Uchida, E. and Hiraga, M.: Lateral flagellar antigen of Vibrio algionlyticus and Vibrio harveyi: Existence of serovars common to the two species. Microbiol. Immunol., 29, 173-182, 1985. Shinoda, S., Yakiyama, I., Yasui, S., Kim, Y.M., Ono, B.I. and Nakagami, S.: Lateral flagella of vibrios: serological classification and genetical similarity. Microbiol. Immunol., 36, 303-309, 1992. Soffientino, B., Gwaltney, T., Nelson, D.R., Speck, J.L., Mauel, M. and Go mez-chiarri, M.: Infectious necrotizing enteritis and mortality caused by Vibrio carchariae in summer flounder Paralichthys dentatus during intensive culture. Dis. Aquat. Org. 38, 201-210, 1999. Sunaryanto, A. and Mariam, A.: Occurrence of pathogenic bacteria causing luminosense in penaeid larvae in Indonesian hatcheries. Bull. Brackishwater Aquaculture, 8, 105-112, 1986. Wimpee, C.F., Nadeau, T.L. and Nealson, K.H.: Development of Species-Specific Hybridization Probes for Marine Luminous Bacteria by Using In Vitro DNA Amplification. Appl. Environ. Microbiol., 57, 1319-1324, 1991. 김진우, 정승희, 박명애, 도정완, 최동림, 지보영, 조미영, 김명석, 최혜승, 김이청, 이주석, 이창훈, 방종득, 박미선, 서정수.: 2000년 ~2006하절기양식어류의병원체감염현황. 한국어병학회지, 19, 207-214, 2006. 원경미, 최정현, 박수일.: 배양조건에따른 Vibrio harveyi extracellular products (ECP) 의특성. 한국어병학회지, 19, 119-126, 2006. 최정현, 원경미, 손새봄, 박효진, 변순규, 이배익, 이종하, 김이청, 박수일.: 조피볼락에대한 Vibrio harveyi의병원성. 한국어병학회지, 20, 99-108., 2007. Manuscript Received : November 14, 2008 Revision Accepted : March 26, 2009 Responsible Editorial Member : Choi, Dong-Rim (National fisheries Research & Development Institue)