신종인플루엔자대유행대비 백신개발기술확보 연세대학교산학협력단 성백린
목 차 연구개발사업연구내용요약문... 1 I. 연구개발사업의개발배경및필요성 1.1. 연구배경... 3 1.2. 연구의필요성... 3 1.2.1. 인플루엔자바이러스... 3 1.2.2. 조류인플루엔자바이러스... 5 II. 연구개발내용및결과 2.1. 저온적응생백신균주와 reverse genetics system 을이용한백신주생산. 5 2.1.1. 연구목적... 5 2.1.2. 연구방법... 7 2.1.3. 연구내용및결과... 8 2.2. 신종인플루엔자백신주생산을위한 reverse genetics system 개발... 18 2.2.1. 연구목적... 18 2.2.2. 연구방법... 21 2.2.3. 연구내용및결과... 21 2.3. 신종인플루엔자백신주의생산방법표준화와백신생산주의규격설정연구... 32 2.3.1. 연구목적... 32
2.3.2. 연구방법... 33 2.3.3. 연구내용... 34 2.3.4. 연구결과... 37 2.4. 인플루엔자바이러스증식세포주의확립... 46 2.4.1. 연구목적... 46 2.4.2. 연구방법... 46 2.4.3. 연구내용... 47 2.4.4. 연구결과... 48 III. 연구결과고찰및결론 3.1. 본연구개발에서구축한 reverse genetics system 의장점... 52 3.2. 본연구개발에서구축한 reverse genetics system 의제한성... 52 3.3. 개선방향... 53 3.4. 저온적응생백신균주의 reverse genetics system 구축... 53 3.5. 새로운바이러스에대한백신주개발가능성... 53 IV. 활용계획 4.1. 본연구개발에서구축한 reverse genetics system 의활용... 54 4.1. 본연구개발에서정립한백신주생산방법의표준화연구의활용... 57 V. 참고문헌
연구개발사업연구최종요약문 1. Reverse genetics system 을이용한백신생산주생산방법구축 12 or 8 total plasmids transfection 을통한 virus generation system 구축함. 고증식성 PR8 균주를모체로하며국내유래의 H9N2 조류인플루엔자의외부항원단백질을가지고있는 H9N2/PR8 재조합바이러스를제작하였으며특성분석함. PR8 또는 WSN 균주를모체로하며국내유래의고병원성 H5N1 조류인플루엔자의 cleavage site 를제거한외부항원단백질을가지고있는 ΔH5N1 재조합바이러스를제작함 PR8 균주를모체로하며국내유래의저병원성 H5N2 조류인플루엔자의외부항원단백질을가지고있는 H5N2/PR8 재조합바이러스를제작함. 재조합바이러스는수정란및마우스에서병원성이저하되었음을검증함. 재조합바이러스는마우스에서항체가형성됨을확인함. 2. 저온적응생백신균주의 reverse genetics system 구축 저온적응생백신균주의 cdna 를확보하고 reverse genetics system 에적용가능하도록특이적인 vector 에 cloning 을완료함. 각각의유전자의 generation 여부를검증한결과 PB1 유전자를제외한모든유전자가 virus 를 generation 하는데이용가능함을확인하였음. 저온적응유래의 7 개의유전자와야생형 PB1 유전자를이용하여 virus 를 generation 할경우약독화특징을나타내는지검증진행중. 1
3. 인플루엔자백신주생산시스템구축 연구실시당시 WHO 에서유일하게조류인플루엔자백신후보균주로추천한 NIBSC Influenza reference virus NIBRG-14 균주를신속하게 WHO 표준균주분양기관인 NIBSC 로부터분양받아서실험에사용하였음. 현재전세계적으로사용되고있는 Egg 를사용한인플루엔자생산방법의백신생산균주확보를위한 Master seed virus bank 및 Working seed virus bank 생산방법을확립하였음. 차세대백신생산방법으로연구를진행하고있는세포배양법을위해백신 substrate 중하나인 Vero cell (Serum-free media cultured) 을사용한 Master seed virus bank 및 Working seed virus bank 생산방법을확립하였음. 차세대백신생산방법으로연구를진행하고있는세포배양법을위해백신 substrate 중하나인 MDCK cell (Serum-free media cultured) 을사용한 Master seed virus bank 및 Working seed virus bank 생산방법을확립하였음. 상기에서확립된방법에의해생산된 Master seed Lot 와 Working seed virus Seed lot 규격설정을설정하고이를표준화하였음. (Mycoplasma, Sterility, infectivity, identity etc.) 2
Ⅰ. 연구개발사업의개발배경및필요성 1.1. 연구배경 독감바이러스는오랜기간동안인간과더불어역사를같이한바이러스로매년사람에게 많은경제적, 육체적고통을안겨주는바이러스이다. 1918 년에발생한스페인독감은 2000 만명이상의사망자를내기도했으며현재에도매년전세계적으로는수만명의사망자를발생시키고있다. 또한지난수십년동안전세계적인대유행을갖는바이러스가발생한적이없어서잠재적으로 pandemic 을유발할수있는바이러스의출현이어느때보다도유력한시기이기도하다. 조류독감바이러스는원래직접사람에감염되어질병을일으킨적이없었으나 1997 년홍콩에서직접감염사례가보고된이후지속적으로올해까지인체감염사례가보고되고있다. 현재는그건수가많지않으나치사율이높고지속적으로발병한다는것은곧조류에서인체의직접감염을넘어서이들이사람에서사람으로감염될수있는기회를지속적으로만들수있다는점에서심각하게받아들여야할문제로생각된다. 만약조류독감바이러스가사람에서사람으로직접감염이가능해진다면이것이 pandemic virus 가될가능성이현재로서는유력하다. 따라서이에대한연구가신속히진행되어조류독감의유행을제어할수있는기술개발및인력양성이절실한시기이다. 1.2. 연구의필요성 1.2.1 인플루엔자바이러스 급성호흡기성질병을일으키는대표적인바이러스로서 1918 년발생한스페인독감의 경우 4 개월이내에전세계적으로 2000 만명이사망하여지금까지인류에가장치명적인 질병으로기록되고있다. 인명의손실과치료비용등국민보건에미치는영향외에도 3
학업이나직장근무에미치는간접적경제적인비용이매우큰질병이다. 치료제가개발되어있으나효과가충분하지않고이미내성바이러스가발생되고있다. 아울러현재사용하는백신의경우백신생산에있어일년에가까운시간이소요됨에따라신종인플루엔자발생에의한대유행시그효과를전혀기대할수없다. 따라서새로운타겟항원에대한신속한제작이가능한형태의백신생산기술이필요하다. 따라서본연구에서는세계적으로백신생산에있어신기술로지목되고있는 reverse genetics system 을이용한 total plasmid based influenza virus generation system 을구축하고이를통한백신생산의기술력을확보하고자함에있다. 뿐만아니라자체적으로개발한생백신바이러스균주를이용한조류독감생백신의연구와새로운 rescue system 등의개발은독감바이러스를제어하는데많은도움을줄것으로기대된다. 1.2.2. 조류인플루엔자바이러스 1997 년홍콩에서발생된 H5N1 형을시작으로하여최근조류인플루엔자에의한인체감염사례가발생하고있다. 최근동일형의바이러스가중국, 베트남을중심으로한아시아전지역에발생되고 60% 를상회하는치사율을보이고있다. 향후대인감염사례로번질경우 1918 년전세계적으로 2000 만명의사상자를보인스페인독감과같은인류대참사가야기될가능성에대해 WHO 는경고하고있다. 조류인플루엔자는바이오테러의주요수단으로사용될수있어생물무기국제협약에서생물무기목록으로지정되어있다. 따라서조류인플루엔자의발생을조기에진단하고확산을막을수있는예방백신의개발은국민의보건, 국가경제력및국방력제고에필수적이다. 또한국내에서도사람에 직접감염하는바이러스는아직유행하지않았으나홍콩에서발견된 H5N1 과유사한 고병원성바이러스가지난시즌에유행한만큼더더욱경각심을갖고향후인간감염 조류인플루엔자바이러스에대한대비를철저히해야할것이다. 하지만수정란에배양시 높은독성을나타내는고병원성조류인플루엔자의특성은백신생산에있어큰문제점으로 4
나타나고있고또생산과정에있어서도높은수준의차폐시설과안전상의문제로백신생산가능한시설자체가충분하지못한상황이다. 뿐만아니라조류인플루엔자의인체감염이빈번히발생하는상황이발생할경우인간의전파력은기존의인간독감의그것보다훨씬빠를것으로예상된다. 이는이전에경험해보지못한새로운균주에대한인체내면역반응이전무하기때문이다. 따라서일정한스케줄에의해조절되는기존의수정란접종기반의백신생산기술은이러한상황이발생할경우신속히대처할수없다는한계점을 가지고있다. 따라서기존의백신생산기술을대체, 보완할수있는다양한연구노력이 요구되는상황이다. Ⅱ. 연구개발내용및결과 2.1. 저온적응생백신균주와 reverse genetics system 을이용한백신주 생산 2.1.1 연구목적인플루엔자백신은매년 WHO 에서제공하는예상유행균주에따라수정란을이용, 배양, 정제하여제작하고있다. 하지만이런백신생산스케줄은변종인플루엔자의출현시특히조류인플루엔자에의한대유행발생과같은위급한상황에서는적절한대처가전혀불가능한상황이다. 따라서 negative sense 인 viral RNA(vRNA) 를인위적으로만들수있도록고안한 8 개또는 12 개의 plasmids 를한개의세포속에동시에 transfection 시켜목적하는 virus particle 만들어내는 reverse genetics system 을이용한백신주생산기술이세계유수의연구기관에의해진행되고있다. 이기술을이용할경우빠르면 1 개월내지수개월내에백신주생산이가능하다. 뿐만아니라고병원성조류인플루엔자바이러스는수정란 5
독성으로인하여생장성이낮은단점으로인해백신의대량생산에문제점이있다. 또높은병원성은백신생산자및관리자가위험에노출될가능성이커이에따른높은수준의차폐시설이요구되는등생산시설측면에있어서도여러가지제약을가지고있다. 이러한생산측면에서의한계를극복하는데있어 reverse genetics system 이바람직한해결책으로제시되고있다. 즉 reverse genetics system 을이용하여병원성이제거된재조합바이러스를생산하고이를통해생산위험성이낮으면서높은수율을갖는백신주의생산이가능하다는점이다. 이러한독감백신생산의새로운패러다임을생백신 (Live attenuated vaccines) 개발기술과접목하고자한다. 현재사용되고있는사백신은전체바이러스를포르말린등을처리하여불활화시킨후정제하여사용하는형태또는항원성을가지는주요표면단백질만을분리하여투여하는형태이다. 이럴경우 IgG 와같은순환항체는체내유도가원활한반면, 실제독감바이러스의방어에직접적으로작용하는점막분비항체인 IgA 의유도는미미하게나타난다. 뿐만아니라면역지속력이약하고매년주사제를통해접종을해야하는등의불편함이있다. 이러한문제점들을개선하기위해약독화시킨살아있는바이러스를직접백신으로사용하고자하는생백신에관한연구가지속되어왔다. 생백신연구에있어가장핵심적인부분은독성이현저히감소되어인체에거의해를주지않는성질을가지고있고이러한성질이체내에서도안정적으로지속되는약독화된공여바이러스를확보하는것이다. 약독화시키는방법도여러가지가있으나가장많이연구되고적용된방법은저온적응방법으로대표적으로구소련에서개발된 A/Leningrad/134/17/57 균주와미국에서개발되어현재상품화 (Flumist, Medimmune) 가이뤄진 A/Ann Arbor/6/60 균주가있다. 두균주모두저온에서의연속계대배양을통해온도감수성을획득함으로써약독화를가능하게하였다. 6
국내의독감바이러스백신개발사례로현재 2010 년첫시제품생산을목표로 녹십자에서백신생산시설을구축중에있으나생백신에관한기술및연구사례는본연구진을제외하고는전무한상태이다. 본연구진이자체개발, 확보한독감생백신제작용저온적응약독화균주는면역원성및공격접종에대한방어능력뿐만아니라수정란에서의높은생장력과유전적안정성이이미검증되었다 (2006 Vaccine Lee KH and et al). 따라서본과제에서는일차적으로 reverse genetics system 을이용한재조합백신주생산시스템을구축하고이차적으로저온적응된독감생백신용 donor strain 에적용, live attenuated vaccine strain 의 generation system 구축하고자하며궁극적으로인플루엔자대유행시신속하고용이한생백신제조가가능한기술을확보함에있다. 2.1.2 연구방법 가. Reverse genetics system 을이용한재조합바이러스생산시스템구축 1 Reverse genetics system 에필수적인 DNA transfection vector 를확보하고연구 목적에맞게적용이가능하도록 modification 한다. 2 국내분리 H5N1 및 H9N2 조류인플루엔자로부터외부항원단백질의 RNA 유전자 추출한다. 3 Reverse transcription 에의한 cdna 를확보하고유전자의 cloning 작업을수행한다. 4 Commercial liposome 을이용한 8 개또는 12 개의유전자의 293T 세포주 transfection 최적화작업을수행한다. 5 Total plasmids transfection 을통해 donor strain 과국내분리주의외부단백질이 재조합된바이러스를제작한다. 6 재조합바이러스의특성분석을분석한다. - MDCK 세포주를이용하여동물세포에서의성장력및감염력측정 - 수정란에서의역가측정 7
나. 저온적응생백신생산균주의 reverse genetics system 구축방법 1 저온적응시킨독감생백신용균주와대조군으로사용할저온적응이전의야생형 균주를각각수정란 (11 일란 ) 에접종하여 RNA 를분리해낸다. 2 인플루엔자바이러스특이적인 primer (AGCAAAAGCAGG) 와 reverse transcriptase 를이용하여바이러스 cdna 를합성한다. 3 바이러스의유전자서열에근거한 8 개유전자에특이적인 primer 와 taq polymerase 를이용한 PCR 반응을통해각각의유전자가 reverse genetics system 에사용할수있도록 vector 에삽입가능한형태로증폭을한다. 4 각각의유전자를 phw-2000 vector 를이용하여 cloning 한후유전자 sequencing 을통해바람직하지않은돌연변이가발생하지않았는지확인한다. 5 각각의유전자를기존의정립되어있는 reverse genetics system 의공여유전자 (PR8 backbone) 와혼합하여재조합바이러스가생성되는지여부를통해 clone 의 사용가능성을확인한다. 2.1.3 연구내용및결과가, Reverse genetics system 을이용한고생장형 H9N2(farm prevalent strain) 및 ΔH5N1 조류인플루엔자바이러스백신주생산 system 구축 Reverse genetics system 을이용하여다양한재조합바이러스의제작이가능하도록고안된 plasmid vector set 2 종류를미국의 Webster R.G.(pHW2000 plasmid back bone) 와 Kawaoka (phh21 plasmid back bone) group 으로부터각각제공받고 ( 그림 1) 국립수의과학검역원으로부터국내분리주인저병원성 H9N2 형 (CK/Korea/Ms96/96) 조류인플루엔자바이러스를분양받았으며또한고병원성 H5N1 형조류인플루엔자 바이러스 (CK/Korea/ES/03) 의외부항원에해당하는 HA 와 NA 유전자를분양받았다. 8
그림 1. reverse genetics system 에사용되는 PolI promoter derived vector H9N2 형바이러스를이용한고증식재조합바이러스를만들기위해우선바이러스로부터표면항원단백질에해당하는 HA, NA 각각의 RNA 유전자를추출하였다. 유전자추출과정은먼저바이러스를 1000 배희석한후 11 일된수정란의 allantoic cavity 에주사기를이용하여 100 ul 접종한후배양기에서배양하였다. 3 일간배양후 allantoic cavity 를 harvest 하고 0.2 um filter 를이용하여 1 회거른후 hemagglutination assay 를이용하여바이러스가적절히양으로배양되었는지확인하였고이중 200ul solution 과 RNeasy kit (Qiagen) 을이용하여 total RNA 를분리해내었다. 추출된 RNA 는 influenza virus genome 특이적인 primer (uni12: AGCAAAAGCAGG) 를이용하여 reverse transcription 를통해 cdna 를확보하고다시 reverse genetic system 에적용하기위한 plasmid vector 에 cloning 이가능하도록고안한 primer( 표 1) 와 Ex Taq DNA polymerase(takara) 이용하여 PCR 을통해증폭한다. PCR 은 56 도에서 30 초간 annealing 하였고 extension 은 72 도에서 5 분간하였으며총 32 회반복하여목적하는유전자를증폭하였다. ΔH5N1/WSN 재조합바이러스의제작을위해먼저 H5N1 바이러스의높은병원성을없애기위하여고병원성을부여하는것으로알려진 HA gene 의 multi basic amino acids site 를 mutation 이도입된 primer 를이용한 PCR 을통해제거하고역시 plasmid vector 에 cloning 가능하도록 PCR 을하였으며반응조건은 H9N2 형바이러스와동일하였다. 9
표 1. Primer sequence for the cloning of phw2000 vector gene NA HA primer sequence 5'-------------------------------------3' TATTGGTCTCAGGGAGCAAAAGCAGGAGT ATATGGTCTCGTATTAGTAGAAACAAGGAGTTTTTT TATTCGTCTCAGGGAGCAAAAGCAGGGG ATATCGTCTCGTATTAGTAGAAACAAGGGTGTTTT PCR 을통해증폭된 H9N2, H5N1 형조류인플루엔자의 HA, NA 유전자각각을 RNA PolIdriven vector (phw2000, phh21 vector) 에의 BsmBI 또는 SapI restriction enzyme (NEB) 처리후 cloning 하였다. Cloned plasmid 는 sequencing 을통해삽입된 HA, NA 유전자에비정상적인돌연변인가발생하지않았음을확인하였다. 다음으로재조합바이러스를만드는데사용되는 293T 세포 (ATCC) 내로이들 8 개또는 12 개 plasmid 를도입시키는 transfection 방법을최적화시킨결과, lipofectamine (invitrogen) 과 plus reagent (invitrogen) 을함께이용한도입법이가장효율이높으며세포독성이상대적으로낮아재조합바이러스의생성이용이하였다. 이를근거로하여 293T 세포를 6-well plate 에 2X10 5 cell/well농도로plating 한후 37도에서 24시간배양한후재조합바이러스의모체로이용되고있는 PR8 의 internal genes (NS, NP, M, PA, PB1 및 PB2) 을가지고있는 plasmid 와목적하는 H9N2 형바이러스의유전자를이용하여재조합바이러스의 generation 을시도하였다. 실험은 H9N2 형바이러스로부터 cloning 한 HA, NA 각각의유전자의 generation 가능여부를확인하기위해 HA 또는 NA 하나만을 PR/8 의것과치환하여사용하거나 HA, NA 가모두치환된세가지조합으로수행하였다. 각각의유전자를 300ng 씩전체 2400ng 이되도록혼합한후다시 lipofectamine(4ul/well) 과 plus reagent (6ul/well) 용액을혼합하였다. 먼저준비한 293T 세포는 serum 이없는 10
배지로교체한후세포내로 plasmid mixture 가도입되도록세포배양액에섞어주었다. 3 시간이지나다시 fresh media 로교체를한후다시 48 시간을 CO2 배양기에서배양한후상층액을 harvest 하였다. Harvest 한상층액을각각 100 ul 씩 11 일수정란에접종하여 60 시간동안배양한후 harvest 하여 1% chicken red blood cell 을이용한 hemagglutination assay 를통해재조합바이러스를생성여부를확인하였다. 그결과세가지조합모두바이러스가 generation 이되었으며표 2 에서보는바와같이고증식성 PR/8 backbone 에외부항원단백질을 H9N2 형의 HA, NA 로치환된 H9N2/PR8 재조합바이러스역시 PR/8 과유사한수준의 HA 역가를보이고있다. 표 2. H9 또는 / 그리고 N2 유전자를갖는재조합바이러스의제조 Surface gene (HA_NA) Internal gene HA titer (Log2) PR8_PR8 PR8 10 H9_PR8 PR8 6 PR8_N2 PR8 9 H9_N2 PR8 10 H9N2/PR8 재조합바이러스의특성을살펴보기위해 MDCK 세포주 (ATCC) 에서 plaque assay 를수행하였다. 야생형의경우 PR8 strain 은 MDCK 세포주에서 plaque 을잘 형성하는반면, H9N2 strain 은 trypsin(invitrogen) 이존재하는상황에서도 plaque 을 형성하지못하며세포에서의성장도거의이뤄지지않는다. 반면에그림 2 에서보는바와 같이 H9N2/PR8 재조합바이러스는 MDCK 세포주에서 plaque 을효과적으로만들고있다. 11
10-2 10-3 10-4 그림 2. H9N2/PR8 바이러스의플래크형성 H9N2/PR8 재조합바이러스를 MDCK 세포주에서 plaque purification 하였다. 분리된 재조합바이러스로부터 8 개의 RNA 유전자를분리하여 sequencing 을통해재조합여부를 재확인하였고수정란에계대접종하여성장률을확인한결과 10 7.8 EID 50 /ml 의역가를 확인할수있었다. 고병원성조류인플루엔자 (CK/Korea/ES/03) 로부터유래된외부항원 HA, NA 를가지는 재조합바이러스를생산하기위해먼저고병원성을부여하는 HA 유전자의 multibasic amino acid region 을제거하는작업을수행하였다 ( 그림 3). PQREKRKKRG -->PQREKRG CCTCAAAGAGAGAAAAGAAAAAAGAGAGGA(PQREKRKKRG)->CCTCAAAGAGAGAAGAGAGGA (PQREKRG) 그림 3. 고병원성 HA 유전자로부터 multibasic amino acid 의제거 현재 Reverse genetics system 을이용하여재조합바이러스를만드는데사용되는 backbone plasmid 는모두 human strain 을기준으로제작되어있다. 따라서조류유래의 유전자를이용하여재조합바이러스를생산하고자할때다른모체유전자와의적합성등의 문제가발생할수있다. 이러한점을고려하여조류유래의 H5, N1 유전자의 NTR 12
region 을각각 human 과 avian 유래의것을갖고있도록고안하여 12 plasmid system 에 이용이가능한 phh21 vector 에 cloning 하였다 ( 표 3). 표 3. HA, NA 유전자 NTR region 의 modification sequence HA Human 5 region AGCAAAAGCAGGGGTCCAATCTGTCAAA 3 region TCATCTTTGTTCCCACAAAAATTGATGTTAGACTTGAGTCTTTA Avian 5 region AGCAAAAGCAGGGGAAAATAAAAACAACCAAA 3 region TCATCTTTGTTCCCACAAAAAGGAATATAAAGACTTTAGGATTAG NA Human 5 region AGCAAAAGCAGGAGTTCAAA 3 region TCATCTTTGTTCCTCAAAAAACTTGTTT Avian 5 region AGCGAAAGCAGGAGTTTAA 3 region TCATCTTTGTTCCTCAAAAAACTTGTTT Cloning 한 H5N1 유전자와 WSN virus 를모체로하여 H9N2/PR8 재조합바이러스 생산방법과동일한과정으로 293T 세포를이용하여 generation 한결과 NTR 의종류와 관계없이모두 generation 이되는것을확인하였다 ( 그림 4). Human NTR Avian NTR 그림 4. Human 또는 avian 유래의 NTR 을가지고있는 ΔH5N1/WSN 재조합바이러스의제조 이상의실험을통해 8 또는 12 plasmid 를이용한 influenza virus 의 reverse genetics system 의구축이확인되었으며고생장 PR8 균주를 backbone 으로하는 8 plasmid 13
system 을이용한 recombinant influenza virus generation 방법은공여바이러스의고생장 특성을유지한재조합바이러스가만들어짐을확인하였다. 또고병원성균주의 multibasic amino acid 를제거한돌연변이바이러스또한효과적으로제작됨을확인하였다. 나. Live attenuated influenza vaccine donor strain 의 reverse genetics system 의구축본연구진에의해개발된독감생백신용균주는수정란에서저온계대배양을통해인체내에서약독화된특성을나타내며유전적안정성및백신으로써의유효성이기존의연구를통해검증되었다. 본과제에서는이러한독감생백신용균주를 reverse genetics system 을 이용하여신속한백신생산이가능하도록각각의유전자로부터 plasmid system 을 구축하고자하였다 ( 그림 5). PB2,PB1,PA,HA,NP,NA,M,NS 저온적응 백신생산주 그림 5. 저온적응백신생산주의 reverse genetics system 구축 14
이를위해저온적응독감바이러스균주및저온적응이전의야생형균주로부터 RNA 의추출하였다. 추출방법은 H9N2/PR8 재조합바이러스의제조방법과동일한과정으로수정란에접종한후 allantoic fluid 로부터 viral RNA 를분리하고이를주형으로하여 reverse transcription 과정을통해저온적응균주와야생형 cdna 확보하였다. 다시확보된 cdna 를주형으로하여 reverse genetics system 에적용하기위한 plasmid vector 에 cloning 할수있도록유전자특이적인 primer 를이용하여 PCR 을통해 유전자를증폭하였다 ( 표 4). 증폭된유전자는 vector 에 cloning 할수있도록고안된제한효소 (BsmBI 또는 SapI) 또는 blunt 형태로 RNA Pol1 driven vector(phh21 또는 phw2000) plasmid 에 chemical treated E.coli 균주를사용하여총 16 종 ( 저온적응형과야생형 ) 의 clone 을완성하였다. Sequencing analysis 를통해각각의유전자를확인한결과일부유전자에 mutation 이발생했음을확인하였다. 이러한돌연변이는바이러스의 generation 에문제를일으킬수있으므로실제각각의유전자가바이러스 generation 이가능한지여부를검토하였다. 표 4. 저온생백신균주의 cdna cloning 용프라이머서열 gene PB2 PB1 PA NP M NS NA primer sequence 5'-------------------------------------3' AGCGAAAGCAGGTCAATTAT AGTAGAAACAAGGTCGTTTT AGCGAAAGCAGGCAAACCAT AGTAGGAACAAGGCATTTTT AGCGAAAGCAGGTACTGATC AGTAGAAACAAGGTACTTTT AGCAAAAGCAGGGTAGATAA AGTAGAAACAAGGGTATTTT ACGTCACGTCTCGGGGAGCGAAAGCAGGTAGATA ACGTCACGTCTCGTATTAGTAGAAACAAGGTAGTT ACGTCACGTCTCGGGGAGCAAAAGCAGGGTGACA ACGTCACGTCTCGTATTAGTAGAAACAAGGGTGTT AGCAAAAGCAGGAGTGAAAA 15
HA AGTAGAAACAAGGCGTTTTT AGCAAAAGCAGGGGATAATT AGTAGAAACAAGGGTGTTTT Reverse genetics system 을이용한바이러스의 generation 은 H9N2/PR8 재조합 바이러스의제작과동일한방법으로진행하였다. 7 개의유전자는기존의 wild type PR/8 strain 의 plasmid 를사용하고저온적응바이러스균주로부터제작된 8 개의 plasmid 를하나씩치환하여바이러스의 generation 여부를확인한결과, PB1 을제외한나머지유전자를이용할경우효과적으로바이러스가 generation 되는것을확인하였다 ( 그림 6, 표 5). 즉 cloning 과정중에서발생한소수의 mutation 은바이러스를형성하는데영향을주지않는것을동시에확인할수있었다. PA 293T cells 그림 6. Confirmation of each plasmid clone Generation defective PB1 유전자로인해모든유전자가저온적응균주로부터유도된재조합바이러스를만드는것은현재성공하지못하였다. 따라서 generation 이가능한 PB1 유전자를확보하기위해 cdna 확보단계부터새롭게진행중에있다. 기존의연구결과에의하면본연구진이확보한저온적응균주와야생형균주간의유전적차이는 HA, NA 를제외한 6개유전자에고르게분포되어있음을확인한바있다. 따라서 PB1 16
유전자하나를제외한나머지 5개의유전자를저온적응균주로부터제공받은재조합바이러스를제작할경우저온적응의표현형을나타낼가능성이높다. 따라서현재 generation defective PB1 유전자는 PR8 의유전자를사용하고나머지 7개의유전자는저온적응균주로부터유도된유전자를사용하여재조합바이러스를제작하고자하는시도를진행중에있다 ( 그림 7). 표 5. Reverse genetics system 을위한 clone 의적합성확인 저온적응균주 cloning generation 야생형균주 cloning generation PB2 O O PB2 O O PB1 O X PB1 O X PA O O PA O O HA O O HA O O NP O O NP O O NA O O NA O O M O O M O O NS O O NS O O (O : cloning 및 generation 여부확인 X: generation 불가 ) 293T cells 17
그림 7. 1:7 system 을통한저온적응생백신균주의 reverse genetics system 2.2. 신종인플루엔자백신주생산을위한 reverse genetics system 개발 2.2.1. 연구목적가. 조류인플루엔자 Type A influenza virus는 Orthomyxovirus로서 segmented negative sense RNA 바이러스로, 8개의 segmented genes들에의해 10개의 viral 단백질을 cording 한다. 10개의단백질중표면단백질인 Hemagglutinin ( 세포의수용체에 binding 하는단백질로 virus 감염에중요한요소로작용 ) 과 Neuraminidase ( 세포로부터바이러스가떨어져나오는데중요한역할을하는효소 ) 에의해각 subtype을나눌수있다 ( 예 : H1N1, H3N2.). 조류, 특히야생조류는자연계에존재하는 15개의 Hemagglutinin (HA) 과 9개의 Neuraminidase (NA) subtypes의인플루엔자바이러스의자연숙주로알려져있다 (Alexander & Brown, 2000 Webster, Bean et al.). 인플루엔자바이러스에의해 20세기동안 4번의큰 pandemic의발생에의해많은인명피해와큰경제적손실이있었다 ( 그림8). 이모든바이러스는유전적분석을통하여사람의인플루엔자는직간접적으로조류인플루엔자바이러스로부터유래되었음이밝혀졌다 (Webster, Bean et al., 1992;Kawaoka, Krauss et al.). 특히최근동남아시아에서문제가되고있는조류인플루엔자바이러스 H5N1, H9N2, 캐나다의 H7N3, 그리고네덜란드에서문제가되었던 H7N7 subtypes들모두야생또는가금의조류바이러스가직접또는변이를통해사람에게전파되어많은인명피해를낸경우라할수있다. 18
그림 8. 1918 년부터 1997 년까지의조류인플루엔자바이러스의 gene pool 의이동에의한 인체인플루엔자바이러스의 pandemic 발생도표 나. 국내. 외연구동향및기존연구의문제점조류인플루엔자바이러스의사람감염가능성이고조되면서미국의 US Department of Agriculture (USDA), Centers for Disease Control and Prevention (CDC), World Health Organization (WHO) 협력기관들은경쟁적으로사람에게감염가능한바이러스에대한연구및백신개발을서두르고있는상황임. 19
해외연구동향 USDA : Hong Kong 분리바이러스와미국내분리바이러스를대상으로 연구수행중인바이러스의 subtype H5N1, H9N2 reverse genetic system 을이용한양계백신개발연구수행중. WHO 와 CDC : 1997 년 Hong Kong 분리바이러스와최근동남아시아, 특히베트남에서분리된 H5N1 바이러스를이용하여인체백신개발을 위해유전자분석및동물실험을통한백신바이러스선별과효율성 H5N1 항바이러스 신약개발 실험수행중이며, 항바이러스신약개발연구도활발히수행중. WHO : 1980 년대중반부터북아메리카에야생하는이동철새에서 조류인플루엔자바이러스의지속적인분리및유전자분석으로북아메리카 대륙에존재하는조류인플루엔자 data base 구축을통해조기인플루엔자 H1- H15 N1-N9 전 subtype 경보시스템체제구성 중국 : 중국은조류인플루엔자바이러스의 epicenter 로불리며 WHO 와 H1- H15 연계하여여러 poultry 와사람에서분리되는인플루엔자바이러스의 N1-N9 유전자분석과동물실험을통해동남아시아에전체에걸친 전 subtype 인플루엔자바이러스의 monitering system 구축중 일본 : 시베리아및중국과지리적으로근접한상황에맞추어 WHO H1- H15 collaborating center 를주축으로여러대학과연구기관에서매년이동 철새및일본내발생하는인플루엔자바이러스의유전적, 혈청학적 N1-N9 전 subtype 변화를 monitering 하고있음. 한국 : 국립보건원과수의과학검염역원등에서 2003 년발생한 H5N1 조류독감바이러스의재발방지를위해조류인플루엔자바이러스의 지속적인혈청학적조사가진행중임 20
2.2.2. 연구방법 H5N1 조류인플루엔자로부터 RNA의추출및 reverse transcription에의한 cdna의확보및 RNA Pol1- driven vector에의 cloning HA 절단부위의 mutation을갖는 HA clone 확보 HA 절단부위를포함한바이러스단백질 coding region에변이를도입한수정란에서의유전적변형고생장백신균주확보 8개유전자의 plasmid를 Vero cell에 transfection에의한 infectious 바이러스 recue의최적화조건을확립함. 공여바이러스 internal genes (PR8 모체바이러스 ) 와 H5N1 virus의 HA 및 NA 유전자의 total transfection에의한 infectious H5N1 바이러스백신주를 rescue함. 상기바이러스의세포배양및수정란에서의 titer를 HI assay, cytotoxic effect 및 pfu 등의인자로결정함. Chicken cell line 획득및이를이용한신종인플루엔자바이러스의분리방법의확립. Reverse genetic system을인체백신생산가능한 Vero cell을적용하여효율적인바이러스생산방법의표준화 동물모델 (mouse 또는 chicken) 에의한백신주의항원성을검증함. 동물모델에서 IgG class의항체생성 profile을검색함 (HI test). 2.2.3. 연구내용 국내분리주인고병원성 H5N1 조류인플루엔자바이러스 (ck.kor.es.03(h5n1)) 와저병원성 H5N2 바이러스 (AB/Korea/W81/05( H5 N2) 로부터 RNA 의추출및 reverse transcription 에 의한 cdna 의확보 고병원성바이러스의경우병원성을없애기위하여 HA gene 중의 connecting peptide 를 그림 9 과 10 의방법으로제거한 plasmid 작성 21
Bm HA-1: TATTCGTCTCAGGGAGCAAAAGCAGGG rh5 Kor1020R: AATAGTCCTCTTTTCTCTCTTTGAGGGCTA rh5kor1030f: AGAAAAGAGGACTATTTGGAGCTATAGCAG Bm NS 890R: ATATCGTCTCGTATTAGTAGAAACAAGGGTGTTT 상기 2 set 의 primer 를이용하여 ck.kor.es.03(h5n1) 바이러스의 HA gene 을 template 로 이용하여 PCR 하였음 ( 그림 9). 2 개의 PCR 산물을다시혼합하여 Bm HA-1: TATTCGTCTCAGGGAGCAAAAGCAGGG Bm NS 890R: ATATCGTCTCGTATTAGTAGAAACAAGGGTGTTT 의 Primer set 를이용하여 connecting peptide 가제거된 full HA gene 을합성하였음. 저병원성바이러스의특징을가진 ck.kor.es.03(h5n1) 와저병원성 AB/Korea/W54/05(H5 N2) 의 HA 와 NA 유전자를 RNA Pol1- driven vector 에의 BsmBI restriction enzyme 처리 후 cloning (phw2000 vector). 재조합바이러스를만드는데사용되는 293-T cell 과 Vero cell 에백신의모체로이용되고 있는 PR8 의 internal genes (NS, NP, M, PA, PB1 및 PB2) 과함께 transfection 하여 72 시간후상층액을다시수정란에접종하여재조합바이러스를생성여부를확인하였음 ( 그림 11). 22
rh5 Kor1020R: AATAGTCCTCTTTTCTCTCTTTGAGGGCTA rh5kor1030f: AGAAAAGAGGACTATTTGGAGCTATAGCAG rh5h1739.2-1020r: AATAATCCTCTTCTCTCTCTTTGAGGGCTA rh5h1739.2-1030f: 1 AGAGAAGAGGATTATTTGGAGCTATAGCAG 2 No dibasic connecting peptide 그림 9. 비병원성의재조합바이러스의재작원리 유전자 data 를바탕으로 HA1 과 HA2 연결부위인 connecting peptide 부분의 dibasic 부분의 pimer 을재작하여 dibasic 염기서열을제거함. 1 차 PCR 에의해 2 가닥으로 증폭된 DNA 가닥을다시 2 차 PCR 을통해 항원성과관련된부분의변형없이재조합 바이러스를위한 full length HA 유전자를획득할수있다. 23
그림 10. 비병원성의재조합바이러스의재작원리 wild virus 의 HA 유전자로부터 cleavage site 의 dibasic peptide 를제거한후 HA 와 NA 유전자를인체백신생산의 back bone 인 PR8 유전자와혼합하여인체 vaccine 생산이 가능한 cell line(vero cell) 에 transfection 하여 wild virus 의 HA 와 NA 유전자를가진예비 백신 virus 를생산할수있다. Transfection condition into 293T and Vero cell lines 293T cell 과 vero cell 을 6well plate 2X10 5 cell 의수로 plating 한후 37 도에서 24 시간 배양하고 plasmid DNA 를 transfection 하기 2 시간전에배지를 serum free OPTI-MEM 배지로 2 번 washing 후최종 2ml 의상태로 2 시간배양함. 8 개의 Plasmid DNA 를각 1ug 씩한튜브에넣은후 200ul 의 OPTI-MEM 과함께 섞어준다. 이때 Mirus LT-1 시약이나 invitrogen 의 lipofectamin 을 20ul 를 OPTI-MEM 24
200ul 에섞은후 5-10 분간실온에방치한다. Plasmid 와 OPTI-MEM 의혼합물을 transfection 시약이들어있는튜브에첨가후실온에서 45 분간방치. 293T cell 과 vero cell plate 에서배지를모두제거후 DNA 와 transfection 혼합물을 조심스럽게각 well 에분주후최종 volume 을 1ml 로맟추어 37 도에서 6 시간배양. 6 시간배양후다시상층액을제거한후 fresh 한 serum free OPTI-MEM 을 2ml 첨가한 후 48-72 시간배양한다. 48 시간후 0.5ug/ml 의 TPCK-treated trypsin 을첨가한후 6 시간정도배양한다. 6 시간후배양배지을 11 일령의 chicken embryo egg 에접종후 37 도시에서 48 시간놓아둔다. 48 시간후 HA assay 을통해재조합바이러스의생성여부를관찰한다. PR8 (H1N1) AB/Korea/W54/06 H5N2 HA NA PA PB1 PB2 NP M Ns 8/6 plasmids from Vaccine donor strain HA NA PA PB1 PB2 NP M Ns 293-T + MDCK cells / Vero cell Vaccine viruses production 그림 11. 재조합바이러스생산의모식도 25
재조합된바이러스에사용된 H5 바이러스의특징 ck.kor.es.03(h5n1) 의경우국내에서최초로발생및분리된고병원성의 H5N1 바이러스로서최근 Vietnam 과 Thailand 에서발생하고있는고병원성의바이러스와 유전학적및혈청학적으로밀접한관계를가진바이러스임 ( 그림 12). AB/Korea/W54/05(H5N2) 의경우유전학적으로병원성의 H5N1 바이러스로서최근 Vietnam 과 Thailand 에서발생하고있는고병원성의바이러스와비교적거리가멀지만 국내의야생조류에서자주분리되고있는바이러스의한형태이다. 이러한 H5 바이러스의 경우숙주가다른 chicken 이나마우스에계대배양을하게되면고병원성바이러스로변이 될수있는바이러스임. 그러므로본연구에서는상기 2 개의바이러스를이용한인체조류독감바이러스의 백신개발기본균주로선택하였음. 재조합된바이러스의 chicken fibroblast cell 을이용하여 purify 하였음. 상기의 2 가지의재조합바이러스를 SPF egg 유래의 embryo 에서 primary fibroblast cell 에 접종하여바이러스가자라는것을확인하였음. Plaque purification 작업을통하여 72 시간동안순수한바이러스를분리한후유전자 분석을통해정확한바이러스의생성여부를확인하였음. 26
13.3 Gs.Th.G7CS.04 h5 dk.th.d4at.04 ck.vt.c-58.04 h5 vietnam.1203.04 h5 HK/1739.2/02 H5 ck.kor.es.03(h5n1) duck.kor.esd1.03(h5n1)) HA Chicken.HK.822.1.01 N5N1 CK.HK.SF219.01 H5N1 CK.HK.YU822.2.01 H5N1 CK.HK.FY150.01 H5N1 Goose.HK.3014.5.00 H5N1 GD251/99 257M GD-1 HK/483/97 H5 156 H5 ck.258 H5 Silky CK.HK.p17.97 H5N1 Goose.Guangdong.3.97 H5N1 chicken.italy.8.98 H5N2 W54 H5N2 W74 H5 FULL PGEM W54 HA H5 PGEM CLONE W79 H5 FULL PCR W81 H5 N2 W96 H5 FULL W16 H5N3 Duck.Hong Kong.205.77 H5N3 Duck.Minnesota.1525.81 H5N1 Mallard Duck.Pensylvania.10218.84 H5N2 Mallard.Wisconsin.169.75 H5N3 Mallard.Ohio.556.1987 H5N9 Chicken.Mexico.31381-5.94 H5N2 avian.ny.31588-3.00 H5N2 turkey.ontario.7732.66 h5n9 Turkey.Wisconsin.68 H5N9 Chicken.Pennsylvania.1.83 H5N2 Chicken.Pennsylvania.1370.83 H5N2 12 10 8 6 4 Nucleotide Substitutions (x100) 2 0 그림 12. W54 바이러스와 Kor. ES0.3 바이러스의다른 H5 바이러스들과의역학적관계 27
Primary CEFs Plaque purification 작업완료 그림 13. primary Chicken Embryo Fibroblast cell 을이용한 plaque purification 재조합된바이러스의 SPF chicken embryo egg 에서의 growth 측정. 대부분의 H5N1 바이러스는수정란독성으로인하여생장이매우낮은단점이있어백신의 대량생산에문제점이존재한다. 이러한 H5N1 바이러스백신의단점을 HA 유전자의 connecting peptide 를유전적변이를 통하여보완함으로써백신생산수율및항원성을극대화할수있다. 상기 2 가지의바이러스를수정란에접종한후바이러스를 titer 를측정하였음 RCk/Kor/ES/03 (H5N1) 바이러스 --> 2 8 (258 HA titer 2.5X 10 6 EID 50) RAB/Kor/w54/05 (H5N2) 바이러스 --> 2 8 (258 HA titer 1X 10 6 EID 50) 위의결과와같이재조합된바이러스는수정란에서독성이없이 wild virus 와같이잘 자람을알수있었음. 28
재조합바이러스의마우스실험 재조합된바이러스의마우스감염실험을통하여병원성을 test 하였음 RCk/Kor/ES/03 (H5N1) 재조합바이러스 --> 5.5 X 10 6 EID 50 RAB/Kor/w54/05 (H5N2) 재조합바이러스 --> 5.5X 10 6 EID 50 WAB/Kor/w54/05 (H5N2) wild 바이러스 --> 5.5X 10 6 EID 50 의바이러스를 5 주령된 BALB/C 마우스에 intranasal route 로감염후 survival rate 를 측정하였음 결과 Ck/Kor/ES/03 (H5N1) wild 바이러스의경우본실험실에서는가지고있지않기때문에 wild virus 와재조합바이러스간의병원성차이를비교할수없었음. ( 참고 : Ck/Kor/ES/03 (H5N1) wild 바이러스의 published paper 결과에의하면마우스에서 높은폐사율을나타낸것으로알려짐 ). 하지만 w54 바이러스의경우재조합바이러스와 wild 바이러스간의병원성비교를통해 재조합바이러스의병원성의저하를측정할수있었음 ( 그림 14). No. survived mice 14 12 10 8 6 4 2 0 Rck/Kor/ES/03 AB/Kor/W54/05 RAB/Kor/W54/05 0 1 2 3 4 5 6 8 9 10 12 D.P.I. 그림 14. 마우스 survival test 29
Wild AB/Kor/W54/05 바이러스의경우마우스에서 60% 정도의폐사율을나타낸반면, RCk/Kor/ES/03 (H5N1), RAB/Kor/w54/05 (H5N2) 바이러스는 5.5 X 10 6 EID 50/ml 의 바이러스를공격접종하였지만본실험기간동안 1 마리의폐사도일어나지않았음 그러므로상기재조합된바이러스는수정란과마우스접종실험을통한결과병원성이 저병원성의바이러스임을알수있었음. 마우스에서의항체형성실험 지금까지여러 H5N1 백신이여러나라에서개발되고있지만아직까지 mammalian 에서 적정한항체가형성이안되는문제점을가지고있음. 그러므로본연구에서는상기제조된 바이러스 (RCk/Kor/ES/03 (H5N1), RAB/Kor/w54/05 (H5N2)) 바이러스의 mammalian host 인마우스에백신접종후항체형성여부를관찰하였음. 64HA 가의재조합 바이러스를 formalin 으로 inactivation 한후직접또는백신보조제인 adjuvant 와혼합후 마우스에백신접종하였음. 그림 15 의방법에따라마우스에서의항체형성여부를 측정하였음. A 방법 접종 1 주채혈 2 주채혈 3 주채혈 4 주채혈 5 주채혈 B 방법 접종 Boosting 접종 1 주채혈 2 주채혈 3 주채혈 4 주채혈 5 주채혈 그림 15. 마우스의채혈주기 30
결과 : A 방법에의한마우스실험결과 2 주째부터 16HI 정도의낮은항체가형성됨을알수 있었지만항체가가더이상증가하지않고 5 주째에는다시 4 HI 이하로항체가없어짐을 알수있었음. B 방법에의한 2 주째 boosting 하는방법에의해 2 주 16 HI, 3 주째부터 5 주째까지 32 HI 정도의항체가형성됨을알수있었음. 상기마우스백신실험결과, 1 회백신보다는 2 회백신이좀더효과적이고, 지속적인 항체형성효과를가진것으로판명됨. 생성된항체를이용한 Western blot 결과 61KDa 크기의 HA gene 의 band 를 detection 할 수있었음 ( 그림 16) M 1 2 3 4 61 M: Marker, 1-3: RAB/Kor/W54/05 4 : Alantonic fluids 그림 16. 마우스항체의 western blot 결과 31
마우스에서채혈한혈청을이용하여항체혈성여부를 Westernblot 방법으로확인하였음. 61K Da 부분의바이러스의 HA 단백질이확인되었음 이와같은연구결과를바탕으로향후본연구진은마우스와기니픽및 ferrets 등을이용한동물모델에서의백신주의항원성검증을진행할예정이며또 Wild virus 의 HA 와 NA 유전자을포함한 PR8 back bone 을이용한고병원성바이러스를재작하여이들의병원성및항원성조사할예정에있다. 뿐만아니라고병원성바이러스의공격접종을통한백신효과검증하고국내야생조류에서지속적인바이러스분리를통해조류독감바이러스의유전자확충해나갈것이다. 궁극적으로는 16 개의 HA gene 과 9 개의 NA gene 을확보함으로서어느조합의조류독감바이러스가발생하더라도대처할수있는 AI 백신주은행확립함을목표로하고 이다. 예 ) HA 16 types X NA 9 type =144 subtypes 2.3. 신종인플루엔자백신주의생산방법표준화와백신생산주의규격설정 연구 2.3.1. 연구목적 새로운형태의인플루엔자바이러스가발견되는경우에우선이러한바이러스를분류하고 유행성의확인등기초작업이신속히이루어져야한다. 이러한작업후후속작업은 신속한백신의제조이다. 인플루엔자백신을생산하고있는방법은최종제형 (whole virus vaccine, HA vaccine etc.) 에상관없이계란부화란을이용해서백신생산을하고있으며 일부에서는세포배양을이용한생산방법을연구하고있고가시적인성과를보이고 있다. 이러한인플루엔자백신생산에있어서적기에필요로하는수량의예방백신을 생산공급하기가어려운관계로예방백신의접종시기를놓치거나, 일선병원에서백신의 품귀현상을곧잘경험하게된다. 따라서이러한수급의불균형을유발하는백신생산 32
방법의개선과백신생산경비의효율성을높여, 적절한시기에백신을공급할수있는 백신생산방법이모색되어야하며특히조류인플루엔자바이러스등에의한대유행을 대비하기위해서는적기에 reverse genetics system 등을사용하여백신주를생산할수 있는시스템을구축하는일이시급하다. 따라서본연구에서는계란부화란과동물세포 배양법을사용하여신종인플루엔자백신주의생산방법표준화와백신생산주의규격설정 등을주요연구내용으로한다. 2.3.2. 연구방법가 ) 백신주생산방법정립 (Master Seed virus Bank 제조 ) 1 계란부화란을이용한생산방법정립계란부화란을이용하여신종인플루엔자백신주를생산하는방법을정립하고, 이에필요한부화란의규격등을정한다. 또한적정수준의백신주가생산되었는지를확인하는방법을확립한다. 2 세포배양을이용한생산방법정립 인플루엔자백신주생산을위해최적의세포인 MDCK cell 또는 Vero cell 을사용하여혈청 또는무혈청배지에서순차적적응또는직접적응을통해바이러스를배양한다. 최적의 생산방법을정립하고표준화한다. 또한적정수준의백신주가생산되었는지를확인하는 방법을확립한다. 나 ) Master Seed Virus Bank 의규격정립및 Qualification 정립 신종인플루엔자백신주가사람을위한백신으로사용되기위해서는현바이러스백신 백신주의허가요건에맞는규격및 qualification system 을갖추어야한다. 33
상기의방법에따라제조된 Primary/Working seed virus lot 에대해아래와같은 qualification( 예시 ) 을정립하고자한다 ( 표 6). 표 6. Primary/Working seed virus lot qualification 시험항목 ( 예시 ) 시험방법 ( 예시 ) 기준 Strain historical records, infectivity test, identity test serological test, animal inoculation, cross contamination test 현재기준에의함 동정시험 Methods approved by the national control authority: 동일 MVB (Master virus seed bank) 무균시험외래성바이러스부정시험 Sterility tests for bacteria and fungi, mycoplasma etc Animal test Cell culture method 동일 동일 Virus titration Plaque assay, HA test, HI test 동일 2.3.3. 연구내용가. 백신주생산방법연구 1 부화난을이용한백신주생산 ⅰ) 마스터시트롯트제작 (Primary virus seed Lot) NIBSC 에서분양받은 NIBRG-14 균주를인산염완충액으로 3 가지희석액을만들어각각의희석액 2ml 을각 5 개의 Specified pathogens free (SPF) 유정란에접종한다. 바이러스주를접종한유정란을 34-37 에서 48-72 시간배양한후희석배수의뇨 막강액을채취하여 HA 함량을측정한다. 가장높은 HA 함량을나타낸뇨막강액을 바이알에담아 -70 이하에보관한다. 34
ⅱ) 제조용시드롯트제작 (Working virus seed lot) Promary virus seed lot 1 개 vial 을취하여인산염완충액으로희석하고희석액 0.2 ml 를 SPF 유정란에접종한다. 바이러스주를접종한후유정란을 34-37 에서 48-72 시간배양한다. 각각의난에서채취한뇨막강액을고속원심분리법으로정제한후인산완충액으로 2 배희석하고여과, 균질화작업을거쳐바이알에충진한후동결건조하여 -70 이하에보관하였다. 2 세포주를이용한백신주생산 ⅰ) 제조용세포주제작 (Working cell bank) 5% FBS 가포함된 EMEM 에서배양하는 MDCK (p73) 와 VERO (p131) cell line 을 serumfree medium 인 Provero-1 (CAMBREX) 배지로바꾸어 1:4 로계대한다. 3~4 일마다 Provero-1 배지로 10 passage 이상계대하여 serum-free medium 에적응하는세포주를 만들고세포주는 nitrogen tank 에보관한다. ⅱ) 마스터시트롯트제작 (Primary virus seed Lot) MDCK 와 VERO cell 을 T-175 플라스크에서배양한후, 세포가 confluent 하게자라면 NIBSC 에서분양받은 NIBRG-14 균주를 10-3, 10-4, 10-5 희석하여 T-175 flask 에 0.1 ml 씩첨가한다. 이때배지는 20 ug/ml trypsin 이포함된 EMEM 을사용한다. 1 시간동안 20 분간격으로흔들어주면서바이러스를세포에흡착시킨후, 20 ug/ml trypsin 이포함된 EMEM 배지를 30 ml 씩첨가한다. 37, 5% CO2 배양기에서 72 시간동안배양한다. 상층액을 harvest 한후, HA titeration 을통해서바이러스 titer 를측정한다. 35
ⅲ) 제조용시드롯트제작 (Working virus seed lot ) 위에서만들어진 Primary seed virus 를 serum-free adapted cell 에서 passage 를거쳐 배양시킨다. 배지는 Provero-1 (CAMBREX) 을사용하였으며, 바이러스는 MOI 0.001 로 20ug/ml trypsin 이포함된배지에넣어흡착시킨후, 37, 5% CO2 배양기에서 48 시간 (MDCK) 과 72 시간 (VERO) 동안배양한다. 상층액을 harvest 한후 seed virus 를 1ml 씩분주하여 -70 냉동고에보관한다. 백신의대량생산을위해서는다량의 Working virus seed lot 가필요하다. 따라서 MDCK 와 VERO cell 을 microcarrier 를이용하여 spinner flask 에서배양하는방법을사용한다. 이때 microcarrier 로는 cytodex-1 (Amersham) 을사용한다. Serum-free adapted cell 을 MDCK 의경우에는 3.0E+05 cells/ml 의농도로 5 g/l cytodex-1 과함께섞어주고, Vero 의경우에는 3.0E+05 cells/ml 의농도로 5 g/l cytodex-1 과함께섞어준후플라스크에서배양한다. 4 일후세포가 microcarrier 위에 confluent 하게자라면, 바이러스를 MOI 0.01 로 20 ug/ml trypsin 이포함된배지에넣어 72 시간동안배양한다. Harvest한후, 각샘플의 HA titer 를측정한다. 나. Master Seed Virus Bank 의규격정립및 Qualification 백신생산용바이러스주는 WHO 에서권고하고공인된국가기관에서추천한인플루엔자 바이러스주를사용하여야한다. 따라서본실험에서는현재조류인플루엔자추천균주 중의하나인 NIBRG-14 주를사용하고자한다. 인플루엔자 reference virus NIBRG-14 은 A/Vietnam/1194/2004 (H5N1) influenza virus 로부터 reverse genetics 방법을사용하여만들었고, National institute for biological standards. and control (NIBSC) 에서추천하고있는균주이다. 36
제조처에서만든백신생산용균주인 Primary virus seed lot 와 Working virus seed lot 는 생산에사용하기위하여일정한규격을갖추어야한다. 이에대한규격을조사하고필요한 시험을정립한다. 2.3.4. 연구결과가. 백신주생산방법연구 1 부화난을이용한백신주생산 ⅰ) 마스터시트롯트제작 (Primary virus seed Lot) NIBSC 에서분양받은 NIBRG-14 균주를인산염완충액으로 3 가지희석액을만들어각각의희석액 2ml 을각 5 개의 Specified pathogens free (SPF) 유정란에접종하였다. 바이러스주를접종한유정란을 34-37 에서 48-72 시간배양한후희석배수의 뇨막강액을채취하여 HA 함량을측정한다. 가장높은 HA 함량을나타낸뇨막강액을 바이알에담아 -70 이하에보관하였다 ( 그림 17). 그림 17. Primary virus seed lot 생산과정 37
상기의과정을거쳐제조된 Primary virus seed lot 를 HA titration 방법을통하여정량 하였으며아래와같은약 2 8 HA titer 를나타내었다 ( 그림 18). 그림 18. HA titer 를통한바이러스정량 ⅱ) 제조용시드롯트제작 (Working virus seed lot) Primary virus seed lot 1 개 vial 을취하여인산염완충액으로희석하고희석액 0.2 ml 를 SPF 유정란에접종하였다. 바이러스주를접종한후유정란을 34-37 에서 48-72 시간배양하였다. 각각의난에서채취한뇨막강액을고속원심분리법으로정제한후인산완충액으로 2 배희석하고여과, 균질화작업을거쳐바이알에충진한후동결건조하여 - 70 이하에보관하였다 ( 그림 19). 아래도표는이를생산하기위한방법을표준화시켜나타낸것이다. 상기에서제조한 working seed virus lot 도 Primary seed virus lot 와비슷한 HA titer 를보였으며, 따라서 백신의제조에사용할수있음을확인할수있었다. 38
그림 19. Working virus seed lot 생산과정 2 세포주를이용한백신주생산 ⅰ) 제조용세포주제작 (Working cell bank) 5% FBS 가포함된 EMEM 에서배양하는 MDCK (p73) 와 VERO (p131) cell line 을 serum-free medium 인 Provero-1 (CAMBREX) 배지로바꾸어 1:4 로계대하였다. 3~4 일마다 Provero-1 배지로 10 passage 이상계대하여 serum-free medium 에적응하는세포주를성공적으로만들었고세포주는 nitrogen tank 에보관하였다. 기본적으로여러가지상용화된배지를사용하여실험을하였으며세포성장률이좋고향후세포배양백신생산 ( 조건 : Serumfree, Protein-free, Animal derived component free) 에적용가능한상기배지에적용된세포를사용하여백신주생산을실시하였다 ( 그림 20). 39
그림 20. Photograph of MDCK and VERO cell line adapted to Provero-1 medium. Left :MDCK cell line, Right : VERO cell line ⅱ) 마스터시트롯트제작 (Primary virus seed Lot) MDCK 와 VERO cell 을 T-175 플라스크에서배양한후, 세포가 confluent 하게자라면 NIBSC 에서분양받은 NIBRG-14 을 10-3, 10-4, 10-5 희석하여플라스크에 0.1 ml 씩 첨가하였다. 이때배지는 20 ug/ml trypsin 이포함된 EMEM 을사용하였다. 1 시간동안 20 분간격으로흔들어주면서바이러스를세포에흡착시킨후, 20 ug/ml trypsin 이포함된 EMEM 배지를 30 ml 씩첨가하고, 37, 5% CO2 배양기에서 72 시간동안배양하였다. 상층액을 harvest 한후, 1ml 씩분주하여 -70 냉동고에보관하고, 이를 HA titration 을통해서바이러스 titer 를측정하였다 ( 그림 21). 그림 21. HA titration of primary seed virus lot 40
ⅲ) 제조용시드롯트제작 (Working virus seed lot ) 위에서만들어진 Primary seed virus 를 serum-free adapted cell 에서 passage 를거쳐 배양시켰다. 배지는 Provero-1 (CAMBREX) 을사용하였으며, 바이러스는 MOI 0.001 로 20ug/ml trypsin 이포함된배지에넣어흡착시킨후, 37, 5% CO2 배양기에서 48 시간 (MDCK) 과 72 시간 (VERO) 동안배양하였다. 상층액을 harvest 한후 seed virus 를 1ml 씩분주하여 -70 냉동고에보관하였다. 백신의대량생산을위해서는다량의 Working virus seed lot 가 필요하다. 따라서 MDCK 와 VERO cell 을 microcarrier 를이용하여 spinner flask 에서 배양하는방법을확립하여 Te. 이때 microcarrier 로는 cytodex-1 (Amersham) 을 사용하였다. Serum-free adapted cell 을 MDCK 의경우에는 3.0E+05 cells/ml 의농도로 5 g/l cytodex-1 과함께섞어주고, Vero 의경우에는 3.0E+05 cells/ml 의농도로 5 g/l cytodex-1 과함께섞어준후플라스크에서배양하였다. 4 일후세포가 microcarrier 위에 confluent 하게자라면, 바이러스를 MOI 0.01 로 20 ug/ml trypsin 이포함된배지에넣어 72 시간동안배양하였다. Harvest 한후, 각샘플의 HA titer 를측정하였다 ( 그림 22,23,24). 그림 22. HA titration of Working seed virus lot 41
그림 23. Cell growth and viability of MDCK and VERO cell line growing on cytodex-1. 그림 24. MDCK and VERO Cells on Cytodex-1. A: VERO (non-infected), B: VERO (3 DPI), C: MDCK (non-infected), D: MDCK (2 DPI) 42
나. Master Seed Virus Bank 의규격정립및 Qualification 백신생산용바이러스주는 WHO 에서권고하고공인된국가기관에서추천한인플루엔자 바이러스주를사용하여야한다. 따라서본실험에서는현재조류인플루엔자추천균주 중의하나인 NIBRG-14 주를사용하였다. 인플루엔자 reference virus NIBRG-14 은 A/Vietnam/1194/2004 (H5N1) influenza virus 로부터 reverse genetics 방법을사용하여만들었고, National institute for biological standards. and control (NIBSC) 에서추천하고있는균주이다. 그림 25. NIBRG-14 의제조과정 43
상기모식도 ( 그림 25) 는 NIBRG-14 에대한정보와자세한제조과정이대한것이며, 아래의도표와같이백신후보균주를국내에서만들거나해외추천기관에서입수를하든지에상관없이일정한규격에따라시험이완료되어야하며, 이러한규격을충족하여야한다. 아래 NIBSC 에서작성된표는이러한조건을예시하고있다 ( 표 7). 표 7. Passage history of virus 제조처에서만든백신생산용균주인 Primary virus seed lot 와 Working virus seed lot 는 생산에사용하기위하여일정한규격을갖추어야한다. 이에대한규격을 조사하였다. 인플루엔자백신생산을위해서는기본적으로각나라의허가기관의 44
가이드라인을충족하여야하고대부분 WHO 가이드라인을많이참조한다. 인플루엔자 백신에대한 WHO 가이드라인은, WHO Technical Report Series No. 927 2005 Recommendations for the production and control of influenza vaccine (inactivated), WHO Technical report series No 638 Influenza A3 ; Revised requirements for influenza vaccine, WHO Technical Report Series No 814 1991 ; Summary protocol for influenza vaccine (Master/Working seed lot type A or type B), ECBS 2005 Annex 5 influenza ; WHO biosafety risk assessment and guidelines for the production and quality control of human influenza pandemic vaccines 등이있다. 제조된 Primary virus seed lot 나 Working virus seed lot 등백신제조에사용되는 seed lot 을위한규격은아래표와같이정리될수있다 ( 표 8). 또한본실험에서제조된 Lot 에대해서실험을적용하여보았으며, 규격에적합함을확인할수있었다 (data not shown). 표 8. Primary/Working seed lot 의규격 Specifications of Influenza vaccine Primary/working virus seed lot Test item Specifications Methods Test for Mycoplasma Negative 약전규격및시험법 Bacterial and fungal sterility Confirm Membrane filtration test Identity test - Haemagglutinin - Neuraminidase Infectious titer Confirm Confirm 최소생산가능감염 titer 이상 Neuraminidase inhibition Test HA test in embryonated hen eggs 45
2.4. 인플루엔자바이러스증식세포주의확립 2.4.1. 연구목적 Pandemic 조류인플루엔자바이러스의출현시단시간내에기존의백신생산방식인유정란에서충분한백신생산이어려워세계보건기구 (WHO) 에서세포에서의백신생산체계를갖추도록권고하고있다. 이러한바이러스를생산하기위한세포주의확립을위해서는 serum-free media 에서의세포배양이안전한백신생산을위한전제조건으로현재요구되고있다. 본연구에서는조류인플루엔자바이러스생산에가장적합하다고알려진 MDCK 세포를동물성원료가들어있지않은 serum-free media 에서잘배양할수있는조건을갖추고자한다. 2.4.2. 연구방법 가. 조류인플루엔자바이러스증식세포주의 Serum-free media 에의적응 1 백신생산이가능한품질을가지고있고동물성재료를이용하지않은 3 가지이상의 serum-free media 를비교하여배양이잘되는 MDCK 세포주를선정. 2 선정된세포주를장기간배양하여초기의세포와성장속도, 형태등의변화가있는지 관찰 3 모든과정은 GMP (Good Manufacturing Practice) 기준에맞추어진행. 나. 세포주의검증및검색방법개발 1 2 선정된세포주를대량으로배양하여 cell bank 제작 이들세포주에서 mycoplasma, bacteria, virus, fungi 등의여러가지의배지및 세포에서의배양등을통하여감염을검사할수있는방법들을개발적용 46
3 염색체의수적인변화및각각의염색체의크기등의분석을통하여세포주가 백신생산에적합한지검증 다. 조류인플루엔자바이러스생산조건확립및바이러스의특성분석 1 세포의상태및수를달리하여바이러스를접종하여바이러스생산에최적의세포 조건확립 2 세포배양시접종하는바이러스의양을달리하여최종생산되는바이러스의최적 조건결정 3 4 5 Trypsin 농도에따른바이러스의생산의최적조건을결정 RT-PCR 을통한여러유전자들의변이검증방법개발 바이러스의성장속도등을분석하여초기 seed strain 과의차이점을분석, 확인 2.4.3. 연구내용가. Serum-free media 에적응된조류인플루엔자바이러스증식세포주 (MDCK) 의확립본연구에서는조류인플루엔자바이러스생산에가장적합하다고알려진 MDCK 세포를동물성원료가들어있지않은 serum-free media 에서잘배양할수있는조건을갖추고자한다. 나. 조류인플루엔자바이러스백신생산에적합한세포주의검증및검색방법개발조류인플루엔자바이러스에대한백신을생산하기위한세포주는안정적이고안전한백신을생산하기위해여러가지기준에적합해야한다. 감염원이없고염색체에도이상이없어야하며또한백신바이러스를생산할수있는최대 passage 계측등여러조건을충족해야한다. 본연구에서는이러한조건을갖춘세포주를검색할수있는방법들을개발하고자한다. 47
다. 조류인플루엔자바이러스안정적인수율확보및생산된바이러스의특성분석조류인플루엔자바이러스를안정적으로생산하기위해서는세포성장률과바이러스의접종시기및접종량, trypsin 농도등바이러스의생산의최적조건을결정해야한다. 본연구에서는안정적인백신생산을위한이러한여러조건을비교하여최적의조건을찾고자하며이를통하여위의세포주가백신생산에적합한지를검증하고자한다. 또한, 세포주에서최종적으로생산된바이러스가초기에이용된 seed strain 과비교하여어떤 유전적변이가있는지를검사하고성장속도등을분석하여초기 seed strain 과의 차이점을분석, 확인하고자한다. 본연구에서는우선 H1N1 균주를이용하여최적의 세포주를선정하고최종적으로영국에서세포에서배양이가능하도록만든비독성 H5N1 바이러스를이용하여연구하고자한다. 2.4.4. 연구결과 가. 세포배양 ATCC 로부터분양받은세포주 MDCK cells (CCL-34) 를 10% FBS (BioWhittaker, Walkersville, MD) 가포함된 EMEM (BioWhittaker) 배지와 FBS 가없는 serum free (SF) 배지 3 개에 (Invitrogen, BioWhittaker, SIGMA) 각각나누어배양하였다. 먼저각각의 SF 배지에서세포주의성장속도를비교한결과배지간의차이가없어최종적으로 Invitrogen 의 opti-pro SF 배지를선정하였다. 나. 단일세포주확립및세포성장속도측정 Serum free 배지에완전하게적응시키고백신생산의최적의세포주를확립하기위하여단일세포로부터세포주를확립하는 single colony selection 을수행하였다. 총 22 개의세포주를확립한후세포성장속도및형태등을관찰하여최종적으로 10 개를선정하여 48
세포주를확립하였다 ( 그림 26). 각각의세포주의성장속도를측정하여 serum 이있는 배지와의비교연구를수행하였다 ( 그림 27). 그림 26. 선택된단일세포주사진 그림 27. 세포주의성장속도 49
다. Serum free 배지에서확립된세포주의바이러스배양능력측정확립된세포주의성장속도와바이러스생산능력과의관계를알아보기위하여성장속도가가장빠른세포와중간느리고가장느린세포주를선정하여바이러스의생산능력을측정하였다. 각각의생산능력은 Serum 을포함한 EMEM 배지의 MDCK 세포와비교하였다. serum free 배지에적응된세포주 2 번, 3 번 6 번세포주에바이러스를감염시킨후 3 일뒤에바이러스를얻어 plaque assay 를수행하였다. MDCK 세포를 6 well plate 에 1 X 10 6 / well 이되도록분주한뒤 100% confluence 가되도록 cell 을배양하였다. 다음 influenza A virus A/PR/8 을 serial dilution 하여각각의 well 에 infection 시키고, 1 시간 incubation 시켜주었다. Top agarose 를각각의 well 에분주하여상온에서굳히고, 5% CO2, 37 배양기에서 3 일간배양하였다. 3 일후, 4% Formaldehyde 로 cell 을고정하고, Crystal violet 으로염색하여각각의 well 에형성된 plaque 의수를측정하여바이러스생산능력을확인하였다. 여러가지다른농도의 (0.01, 0.025, 0.1 %) trypsin 에따른바이러스생산량에는의미있는차이가나타나지않았다 ( 표 9). 표 9. 세포주의바이러스배양능력 Cell line Titer (PFU/ml) with SERUM 1.57 X 10 8 / ml Clone 2 번 1.8 X 10 8 / ml Clone 3 번 1.07 X 10 8 / ml Clone 6 번 1.02 X 10 8 / ml 50
각각의세포주가서로다른정도의바이러스를생산하는것을관찰하였는데실험결과성장속도가가장빠른세포주 2 번이 serum 이들어있는배지에서키운 MDCK 보다약 15% 많은양의바이러스를생산하는것을확인할수있었다. 각각의세포주는 single colony 로부터패시지번호를새로부여하였는데 7 번째패시지세포를이용하여 1 차세포뱅크를만들었으며실험에사용한세포주는 9 패시지의세포들을이용하였다. 현재각세포주들의바이러스생산능력을비교하고있으며가장생산능력이좋은 3 개의세포주를선정하여대규모의세포뱅크를만들고 mycoplasma, bacteria, virus, fungi 등의감염을검사할예정이며염색체의수적인변화및각각의염색체의크기등의분석을통하여세포주가백신생산에적합한지검증하고자한다. 라. 바이러스의특성분석 - RT-PCR 을통한여러유전자들의변이검증방법개발 인플루엔자바이러스는 RNA 바이러스로서유전적검사를위해서는반드시 RNA 를 정제해야하는데이단계에서많은비용이들고실험자및실험조건에따라많은변수가있어보다개선된방법의개발이요구되고있다. 본연구를효율적이고보다경제적인방법으로수행하고또한새로운변종출현에대비한대규모의인플루엔자바이러스에대한유전적변화및진단등의연구를원활히수행하기위하여주로 kit 를이용하는 RNA 정제과정을제거한 multiplex RT-PCR system 을구축하였다. H1N1, H3N2, B 형 3 가지의독감바이러스를이용한실험결과각각의바이러스에특이적인크기의유전자를확인할수있었다. 본연구결과는현재특허출원을준비중이여서자세한실험내용은기술하지아니하였다. 본연구에서구축된방법을이용하여앞으로세포에서생산된조류인플루엔자바이러스의여러유전자의변이등의연구에활용하고자한다. 51
Ⅲ. 연구결과고찰및결론 대부분의 H5N1 바이러스는수정란독성으로인하여생장이매우낮은단점이있어백신의대량생산에문제점이존재한다. 이러한천연형 H5N1 바이러스백신의단점을유전적변이를통하여보완함으로써백신생산수율및항원성을극대화한다. 유전적으로재조합하는시간이첨가되므로 ( 약 1-6 개월 ), 일단발병한상황에서는이용하기힘든단점이있으나, 백신생산의준비기간이있으면가장효율적인방법으로제시되고있다. 3.1. 본연구에서개발한 Reverse genetic system 의장점바이러스분리후각유전자 segment 들을 cloning 하여보관할수있으므로 sample 의보관과이동이자유롭다. 고병원성의바이러스의경우라도 HA gene 중의 Connecting peptide 를제거하여항원성을변형시키지않고도저병원성의바이러스로의전환이가능하여수정란에서높은바이러스 titer 를얻을수있다. Cloning 된각분절을이용하여 FDA 에서백신모체로권장하고있는 PR8/30 바이러스와의재조합바이러스를생산하여 wild virus 를이용한경우보다허가받는데용이하다. 새로운변형바이러스가출현시, 직접바이러스를분리하지않고도유전자분석결과만을가지고도 point mutation 방법을이용하여빠르게백신을준비할수있다. 3.2. 본연구에서개발한 Reverse genetic system 의제한성 Reverse genetic system 을이용한바이러스를재조합할경우 human 293T 세포주를 이용하는경우 tumor 세포주이기때문에인체백신으로사용하기곤란한점이있음. 52
Reverse genetic system 은 human Pol 1 과 Pol II promotor 를사용하기때문에 Vero 세포주를이용할경우 293T 세포주를이용하는것보다효율이떨어질수있음. 3.3. 개선방향초기바이러스분리부터인체백신으로허가된인체백신생산가능한 Vero 세포주나 primary chicken firbroblast 세포주를이용하도록미국 FDA 에서권장하고있음. 상기한대로 Reverse genetic system 은 Vero 세포주를이용할경우 293T 세포주를이용하는것보다효율이떨어질수있음. 이를극복하기위해서는인체백신생산가능한 Vero cell 을이용한효율적인바이러스 생산방법과 primary chicken cell 을이용한 pure 한인플루엔자바이러스획득방법을 확립되어야함. 3.4. 저온적응생백신균주의 reverse genetics system 구축 현재 system 구축에 bottle neck 으로작용하고있는 PB1 유전자를 wt 또는다른 subtype 의유전자로치환하는방법을통해 system 을구축하고자하며선행적으로본 시스템을통해 virus generation 이이뤄질경우재조합된바이러스의저온적응표현형을 확인하여야할필요가있다. 3.5. 새로운바이러스에대한백신주개발가능성 Reverse genetic system 은일단구축되면다양한독성바이러스에대한백신개발의 기반기술로공통적으로사용될수있다. ck.kor.es.03(h5n1) 의경우국내에서최초로발생및분리된고병원성의 H5N1 바이러스로서최근 Vietnam 과 Thailand 에서발생하고있는고병원성의바이러스와유전학적및혈청학적으로밀접한관계를가진바이러스이다 ( 그림 12). 53
AB/Korea/W54/05(H5N2) 의경우유전학적으로병원성의 H5N1 바이러스로서최근 Vietnam 과 Thailand 에서발생하고있는고병원성의바이러스와비교적거리가멀지만국내의야생조류에서자주분리되고있는바이러스의한형태이다. 이러한 H5 바이러스의경우숙주가다른 chicken 이나마우스에계대배양을하게되면고병원성바이러스로변이될수있는바이러스이다. 그러므로본연구에서는상기 2 개의바이러스를이용한인체조류독감바이러스의백신개발기본균주로선택한바있다. 그러한향후새로운변종이발생하는경우동일한 Reverse genetic system 을사용하여백신주를효과적으로생산할수있다. 현재 reverse genetics system 을이용한좀더진보된형태의백신의형태인생백신의개발은전세계적으로구축되어진사례가없다. 현재본연구진은이를위한 cdna plasmid 구축이 90% 이상이뤄진상태이며각각의유전자에대해 virus generation 여부가확인된상태이다. 다만 PB1 유전자에있어 defective 형태임이밝혀저이유전자에대한재 cloning 작업또는돌연변이가발생한부위에 back-mutation 을인위적으로도입하여이를극복할필요가있다. 향후 PB1 유전자에대한문제가해결될경우저온적은백신균주의 cdna plasmid 를이용한신속한생백신균주의생산이가능할것으로예상된다. 이러한백신주생산공정은다양한바이러스변종에대해공통적으로적용될수있는장점을지니고있다. Ⅳ. 활용계획 4.1. 본연구개발에서구축한 reverse genetics system 의활용 Reverse genetic system 을이용한재조합 influenza virus 의예비백신주생산방법은 빠른시일내에가능함이확인되었으며, reverse genetic system 을이용해생산재조합 54
바이러스는모체바이러스인 PR8 바이러스의 internal 유전자를가지고있으므로 wild 바이러스가가지고있던병원성이저하됨을수정란및마우스실험을통하여증명할수있었다. 상기제조된바이러스는 mammalian host 중의하나인 mice 에서저하된병원성과적절한항체를형성함을알수있었으며상기실험을바탕으로좀더다양한예비백신바이러스를선택하여, 재조합바이러스생산방법을확립하고빠르고안전한인체백신바이러스의생산이가능하도록할수있을것으로예상된다. 본연구를통해얻은결과를바탕으로여러인체에전파가능한바이러스 (H5, H7, H9) 등의바이러스재조합방법을이용하여예비실험을한후백신주를비축한다면향후어떠한 influenza virus 가인체감염이이루어진다고하더라도빠르고효과적으로대처할수있을것으로기대된다. 뿐만아니라예비백신주들의비축은국내발생에대한대응뿐만아니라주변국들로의백신주및기술이전을통한국가위상을높이는기회를제공할것이다. 본연구에서는 serum free 배지를이용하여 MDCK 세포주를제작하였으며단일세포주에서기존의세포보다많은양의바이러스를생산할수있음을확인하였다. 향후본연구에서확립한 serum free 배지에적응된세포주를이용하여영국 NIBSC에서들여온약독화 H5N1 균주를대량으로생산하고자한다. 유정란에서생산된바이러스와생산량및바이러스의안정성등을비교할예정이며백신의대량생산체계를갖추기위하여 constant flow ultracentrifuge를도입할계획이다. 또한조류인플루엔자에대한연구를원활히수행하기위하여 BSL3+ 실험실을건설을통한생산된백신의효능및안전성등의전임상실험을진행하고자한다. 이를위해최근충남대김철중교수및충북대최영기교수연구팀이재조합바이러스의재조합및생성된바이러스의병원성과백신실험을할수있는 BSL 3+ 시설을대덕테크노밸리에완공하였다. 본 BSL 3+ 시설에서는실험실뿐만아니라마우스, 페렛, 닭과같은동물실험을할수있는동물시설부분도포함되어있기때문에재조합바이러스뿐만아니라고병원성의 55
바이러스의병원성실험도가능하며 ( 그림 10) 보건원실사결과 BSL3+ 시설로양호한 판정을받았다. 그림 28. BSL 3+ 시설조감도및실험실배치도. 56
4.2. 본연구개발에서정립한백신주생산방법의표준화연구의활용최근급성호흡기증후군 ( 사스 ) 과 H5N1 바이러스로인한조류독감이아시아를휩쓸면서, 이제부터라도백신개발을서둘러야한다는목소리가높다. 충북대최중국교수는 백신은석유나식량보다더중요한무기가되었다. 다른나라에서얻어다쓰는데는한계가있다 라고말했다. 만약조류독감이인체에서인체로감염되어, 1918 년수천만명의목숨을앗아간스페인독감처럼유행한다면속수무책일수밖에없다. 다른나라에백신이있다고해도사정은달라지지않는다. 전염병이크게유행해수요가늘어나면주요생산국인유럽몇몇나라와미국이자국민에게우선접종한다음에야다른나라에공급할 것이기때문이다. 실제한국은 2001 년에인플루엔자백신을필요한양의 40% 밖에 공급받지못했다. 이같은위험을피하기위해서일본은오래전부터모든백신을자급자족하고있다. 인플루엔자백신은전세계 9 개제약사에서한해약 2 억 8 천만도즈를생산한다. 이같은세계각국의노력에도불구하고백신개발은현재다국적제약사 GlaxoSmithKline 와 AvantisPasteur ( 유럽 ), 그리고 Wyeth 와 Merck ( 미국 ) 가 85% 를장악하고있다. 또한최근에는 20 여종의백신을개발중인 Chiron 을비롯해 Baxter 등소규모후발업체들이틈새전략을내세우며부상하고있다. 여기에비해한국제약사들은정보, 기술, 자금에서상대가되지못한다. 바로이웃나라에서사스와조류독감으로인명이희생되고경제손실이눈덩이처럼불어나는상황에서백신자급자족은더이상미룰수없는과제가되었다. 백신은이제단순한약이아니다. 국민의건강과복지, 그리고국가를지키는또다른무기이다. 이러한현실을똑바로직시하고우리국민에게필요로하는백신공급을위해자국의생산시설확보및백신생산기술확보에총력을기울여야한다. 인플루엔자바이러스의증식은계란부화란과동물세포배양법을사용하는방법이있으며 계란부화란을사용하는방법은현재백신생산에사용되고있다. 또한동물세포를 57
이용한백신생산대한연구는 MDCK(Madin Darby Canine Kidney) cell, Vero cell(green Monkey Kidney), CEF cell 등을이용하여많이진행되고있다. 따라서차후연구에서는계란부화란과동물세포배양법을사용하여현연구에서완성된신종인플루엔자백신주의생산방법표준화와백신생산주의규격설정등을바탕으로하여유효성이있는백신의신속한생산방법을정립하고자한다. ⅴ. 참고문헌 Hoffmann E, Krauss S, Perez D, Webby R, Webster RG. Eight-plasmid system for rapid generation of influenza virus vaccines. Vaccine. 2002 Aug 19;20(25-26):3165-70. Hoffmann E, Neumann G, Hobom G, Webster RG, Kawaoka Y. "Ambisense" approach for the generation of influenza A virus: vrna and mrna synthesis from one template. Virology. 2000 Feb 15;267(2):310-7. Genzel Y, Olmer RM, Schafer B, Reichl U. Wave microcarrier cultivation of MDCK cells for influenza virus production in serum containing and serum-free media. Vaccine. 2006 Aug 28;24(35-36):6074-87 Lee KH, Seo SU, Song JM, Lee CM, Kim HA, Seong BL. Characterization of live influenza vaccine donor strain derived from cold-adaptation of X-31 virus. Vaccine. 2006 Mar 10;24(11):1966-74. 58