국내병원과국내주둔미군병원에서분리한 Methicilin 저항성 Staphylococcusaureus 의항생물질내성형과 meca 유전자의검출 연세대학교보건환경대학원 의생명과학과 신진수
국내병원과국내주둔미군병원에서분리한 Methicilin 저항성 Staphylococcusaureus 의항생물질내성형과 meca 유전자의검출 지도김종배교수 이논문을석사학위논문으로제출함 2005 년 7 월일 연세대학교보건환경대학원 의생명과학과 신진수
신진수의석사학위논문을인준함 심사위원 심사위원 심사위원 인 인 인 연세대학교보건환경대학원 2005 년 7 월일
대학원입학후세번째의여름을보내면서여기에감사의글을적습니다. 많은분들께진심으로감사드립니다. 찬찬히논문을지도해주셨던김종배지도교수님, 양용석교수님, 오옥두교수님, 김태우교수님, 박용식교수님, 그리고이혜영교수님께감사의글을올립니다. 부족한저를열심히챙겨주었던이채진, 성기만, 정보영, 그리고이런저런부탁마다정성껏해결사가되어주었던유경래선생님께도따뜻한한마디드리고싶습니다 고맙다고요, 하찮은저의질문에도귀찮은기색없이항상알아봐주시고찾아봐주시고답해주셨던임병혁선배님께도꼭한마디드리고싶었습니다. 정말고마워요 라고. 그리고항상용기를북돋우어주었던후배님들께도감사드리고싶군요. 논문의실험을도와주었던이규상선생님, 그리고실험실식구들, 항상반갑게따뜻한모습으로대해주셨던모습오래동안못잊을것같습니다. 또제논문에사용된 MRSA 균주를열심히모아주셨던 121 병원장인경선생님, 이지아선생님,Cpt.Kijek, 그리고병원으로부터균주의사용에대하여승낙서를받아주면서저에게용기를주었던 Maj.Berggren 에게도감사드립니다. 또한이외에도 MRSA 균주를모아주셨던여러분들께감사드립니다. 항상같이했던검사실직원들과목요일아침빨간눈으로멍하게나타난저를격려해주었던최선생에게도고맙다고전하고싶습니다. 그리고오랜세월동안항상세세히가르쳐주시고돌보아주셨던김태운교수님께감사드립니다. 매주수요일, 아니목요일새벽에피곤에지쳐카풀에서내린아내를차에태워집으로데리고왔던남편의지극정성, 직장뒷바라지도모자라학업뒷바라지까지해주셨던시어머님, 늦은나이에공부하는엄마가자랑스럽다고부족한엄마를띄워주었던이제청년이다된아이들에게도감사의글을전하고싶습니다. 그리고중보로기도해주셨던교우들, 부모님과형제들, 그리고오늘까지굽이굽이저의인생길마다크신사랑으로함께하시는하나님께감사로써모든영광을올리고싶습니다. 소중한분들께다시한번감사드립니다. 신진수드림
목 차 표목차 i 그림목차 iv 약기호표 v 국문요약 vi 제 1장서론 1 제 2장재료및방법 3 1. 임상재료에서포도상구균 (S.aureus) 의분리 2. 항생물질감수성시험 3 2.1. 최저발육저지농도시험 3 2.2.E-Test 4 3.DNA 의추출및정제 4 4.mecA 유전자에대한중합효소연쇄반응 4 4.1. meca 유전자에대한 oligonucleotideprimer 의제작 4 4.2. 중합효소연쇄반응에사용되는 PCR primer 민감도시험 5 4.3. 중합효소연쇄반응을이용한 meca 유전자의검출 5 5.SCCmec(Staphylococcalchromosomalcassete) 유전자에대한다중중합효소연쇄반응 6 제 3장연구성적및결과 8 1. 포도상구균 (S.aureus) 의분리 8 2. 항생물질감수성검사결과비교분석 10 2.1.Vitek 미생물자동분석기를사용한항생물질에대한감수성검사 10 2.2.E-Test 를이용한 oxacilin 과 cephalothin 에대한각집단간의 MIC 결과비교, 분석 12 3. 중합효소연쇄반응에사용된 primer 의민감도시험 15 4. 중합효소연쇄반응을이용한 meca 유전자의검출 18 5.SCCmec 유전자의다중중합효소연쇄반응 20
제 4장고찰 22 제 5장결론 25 참고문헌 26 영문요약 30
표 목차 Table1.SpecimensofMRSA clinicalisolatesfrom 121 st GeneralHospital andkoreanhealthcarehospital 8 Table2.AntimicrobialresistantpaternsofMRSA clinicalisolatesby VITEK System 11 Table3.MIC(Minimum inhibitoryconcentration)ofmrsa clinicalisolates by E- test 14 Table4.Oligonucleotidesequencesusedforamplificationinthisstudy 16
그림목차 Figure1.MRSA clinicalisolatesonmsa(mannitolsaltagar)medium 9 Figure2.MIC(Minimum inhibitoryconcentration)testforreferencestrains andmrsa clinicalisolatesby E-test 13 Figure3.Sensitivity testforpcr amplificationofmeca gene 17 Figure4.PCR amplificationofmeca geneforclinicalisolates 19 Figure5.Validationofthemultiplex PCR strategy 21
약기호표 ATCC :AmericanTypeCultureColection bp:basepair CLSI:ClinicalLaboratory StandardInstitute MIC :Minimum inhibitory concentration MRSA :MethicilinresistantStaphylococcusaureus. MSA :Mannitolsaltagar NCBI:NationalCenterforBiotechnologyInformation NCCLS :NationalCommiteeforClinicalLaboratory Standard PCR :Polymerasechainreaction SCCmec:Staphylococcalchromosomalcassetemec
국문요약 국내병원과국내주둔미군병원에서분리한 Methicilin 저항성 Staphylococcusaureus 의항생물질내성형과 meca 유전자의검출 2004 년 1월에서 3월까지서울에주재하고있는미군병원에서분리된 methicilin resistantstaphylococcusaureus(mrsa)30 균주와국내의서울지역병원에서분리한 MRSA 17 균주, 부산지역에서분리한 25 균주그리고 1999 년강원도원주시에소재하고있는원주기독병원에서분리한 MRSA 36 균주를실험대상으로하여 VITEK system 과 E-test 를통하여항생제에대한 minimum inhibitory concentration(mic) 을분석하였다. 그리고 E-test 를통하여 oxacilin 과 cephalothin 에대한감수성을집단별로비교분석하였다. 분자생물학적인방법인 PCR 을통하여 methicilin 에내성을유발하는 meca gene 의검출을확인하였으며,SCCmec(Staphylococcalchromosomalcassete) 유전자의위치를알아보기위한 SCCmecprimer 들을이용한 multiplex PCR 을시행하여각각의다른유전자의종류를포함하고있음을확인하였다.3 개의집단에서분류된 MRSA 임상분리균주를대상으로 VITEK system 과 E-test 를통하여시행한항생제에대한 MIC 결과는 121 st GeneralHospital 에서분리한 MRSA 임상분리균주들과국내병원들에서분리한 MRSA 임상분리균주들과의항생제들간의내성률의큰차이점을확인하였으며국내에서분리한 MRSA 임상분리균주들은 121 st GeneralHospital 에서분리된균주들보다항생물질에대한내성률이매우높은것으로나타났으며, 국내에주둔하고있는 121 st General Hospital 과
국내병원에서분리한 MRSA 임상분리균주들을대상으로다중중합효소연쇄 반응을통한 SCCmac type 검사결과 108 개의모든균주는 SCCmectype1-IV 중하나의 type 혹은 2,3 개의 type 으로분류되었다. 핵심되는말 :MRSA,VITEK,E-test,MIC,PCR,mecA,SCCmec,Multiplex PCR
제 1 장서론 Methicilin ResistantStaphylococcus aureus(mrsa) 는 1961 년처음으로영국에서분리된이래현재는전세계에널리분포하고있으며, 원내감염의집단적발생뿐만아니라지역사회감염에서도그원인균으로분리되는빈도가증가하여문제가되고있다. 현재임상에서분리되는황색포도구균의 90% 이상은 penicilin 에내성균주이며 methicilin 내성균주의비율은나날이증가하고있다 (3, 4, 18). 미국의경우병원내에서분리되는전체황색포도구균 (Staphylococcusaureus) 중에서 methicilin 내성균주가차지하는비율은 1975 년당시 2.4% 에불과하였으나 99 년에는 50% 이상으로급격히증가하였다 (2,5,9, 10). 국내사정도마찬가지여서보고에의하면 70 년대에 5% 정도를차지하던비율이 80 년대부터급격히증가하였고 1996 년전국병원감염률조사연구에서병원에서분리되는황색포도구균중 methicilin 내성균주가차지하는비율은 83.7% 나타났다 (3,14,15,16,17,18). 최근에는지역사회에서분리되는 MRSA 내성비율도점차증가하고있는실정이다 (2,5,6,12). MRSA 균주가증가하면서감염증또한심각한문제로대두되고있다. 특히병원내감염에서문제가되는데미국의자료에의하면 MRSA 에의한병원내감염이 25% 에달하는것으로보고되었다. 국내의경우 1996 년실시된병원감염률에대한연구에서 MRSA 균이원인균의 14.4% 를차지하였으며점차증가하는추세이다 (3,10,12,16,18). 한편유럽각국의 MRSA 의비율은스칸디나비아지역은 1% 미만, 스페인, 프랑스, 이탈리아등지에서는 30% 로지역과국가에따라많은차이가있지만, 평균 12.8% 의높은비율로보고되고있다 (4,7,8,11,13). 우리나라의경우대부분의대학병원과종합병원에서분리되는 MRSA 는병원내감염중창상감염, 폐렴, 균혈증등의주요원인균으로작용하며, 전체병원감염원인균의 5~50% 를차지한다 (3, 18). 현재임상에서분리되는황색포도구균의 90% 이상은 penicilin 내성균주이며 methicilin 내성균주인 MRSA 균은
beta-lactams,aminoglycosides,macrolides 와같은많은항생제에내성을나타내며소수의항생제만이치료에유용하므로임상분리 Staphylococcusaureus 균중에서 methicilin 내성여부의신속한검출과동정이필요하다 (3, 4). 그러나 methicilin 내성의발현은배지의온도, 염농도같은성장조건에영향을많이받으므로보통의항생제감수성검사로는판정이부정확한경우가많아문제점으로지적되고있다 (4,17). MRSA 균의 beta-lactam 제에대한내성기전은 beta-lactam 계열항생제에대한친화성이낮은 penicilin-binding protein 2'(PBP2') 의유도생산에의한것으로써이단백질을 code 하고있는것이 meca 유전자로밝혀졌다 (4). 한편 pbp-2a 의발현을조절하는기능을나타내는조절유전자인 meci 과 mecri 유전자가 meca 유전자의상부에존재하는것이밝혀졌으며이들조절유전자는각각 meca 발현억제단백을합성하는유전정보를지니고있다. 한편 mecri 유전자는세포내신호전달에관여하는 5 말단부위와 penicilin 결함에관여하는 3' 말단부위로구성되어있음이밝혀졌다 (2). 본연구에서는국내대학병원과국내에주둔하고있는미8군소속 121 병원에서분리된 MRSA 를대상으로항균제감수성양상에의한표현형및내성관련유전자인 meca 에대한 (PCR) 반응으로유전형을결정하여이를비교분석하였다. 이러한연구를통해근래에국내병원과미국인대상병원에서분리된 MRSA 의항 생제내성유형과 분자생물학적인특성을분석비교함으로써유전형의분포와 다양성을알아보고 1999 년도강원도원주기독병원에서분리되었던 MRSA 38 주 를대상으로연도별항생제내성유형과이에따른분자생물학적인특성을비교 하여포도상구균의항생제내성의변화형태를알아보고자하였다.
제 2 장재료및방법 1. 임상검체로부터황색포도상구균 (S.aureus) 의분리 2004 년 1월부터 2004 년 3월까지서울에주둔하고있는미육군병원 121 st GeneralHospital 과국내의서울과부산지역병원진단의학과 (Korean healthcare hospital) 의가검물에서분리한 MRSA 임상분리균주각각 30 주와 42 주 ( 서울 17 주, 부산 25 주 ) 및 1999 년강원도원주시에소재한원주기독병원에서분리된 MRSA 38 주를사용하였다. 본실험에사용한 MRSA 균주가분리된가검물의내용은 table1 과같다. 임상분리균주는 5% 면양혈액이포함된혈액배지에배양하고균주의동정은고전적인방법과 VITEK(Vitek System, Hazelwood Inc., U.S.A)GPIcard 를사용하였다. 본실험에사용한 MRSA 균주는모두 catalase 검사및 coagulase 검사에서 (BD,BBL,StaphyloslideLatex Test) 양성결과를나타내었으며, 이들공시균주를 mannitolsaltagar(msa) 에도말후배양하였다. 2. 감수성시험 2.1. 최저발육저지농도실험항생제내성유형을파악하기위한항생제감수성실험은 VITEK System 에의한최소억제농도 (minimum inhibitoryconcentration;mic) 를이용하였다. 실험방법으로는실험균주를혈액배지에서 37,18 시간배양한후단일집락을백금이로취하여멸균된 0.45% NaCL 1.8 ml에부유한후,vitek colorimeter 에서최종탁도를 0.5McFarland barium sulfateturbidity standard 에맞추고교반기로 2~3 초동안교반한다음이부유액을취하여 VITEK GPIcard 와 GPS susceptibility card 에접종하였다. 그리고 VITEK system 에서요구하는방법및기준에따라 MIC 를측정하였다. MIC 에측정은 ampicilin, ampicilin/sulbactam, cefazolin,
ciprofloxacin, erythromycin, gentamicin, nitrofrantoin, oxacilin, penicilin-g, clindamycin,tetracycline,vancomycin,trimethoprim/sulfamethoxazole 등의항균물질을사용하였다. 항균제감수성검사를위한표준균주로는 S.aureus ATCC 43300,S.aureusATCC 29213 및 EscherichiacoliATCC 25922 를사용하였다. 2-2.E-test Oxacilin 과 cephalothin strip(ab Biodisk,Solna,Sweden) 을이용하여 CLSI (ClinicalLaboratory Standard Institute)guideline 에따라 MIC 를측정하였다. 시험균주부유액의최종탁도를 0.5McFarland barium sulfateturbidity standard 에맞추고 Muler-Hinton agar 에공시균주를고루도말하여배지양쪽에 oxacilin 과 cephalothin strip 를올려놓고 37 에서 18 시간배양한후형성된증식억제대에해당하는 MIC 를판정하였다. 감수성검사를위한표준균주는 VITEK system 에서사용된표준균주와동일한균주들을사용하였다. 3.DNA 의추출및정제 세균의 genomic DNA 를얻기위해서세균을 brain heartinfusion(difco,mi, U.S.A.)broth 4 ml에접종하여호기성상태로 37 에서 24 시간배양하였다. 배양액을 Eppendorftube 에 1.5 ml씩분주하고 12000 rpm 으로 10 분간원침시킨후 침전된 bacterialpelet 을 DNA isolation kit(qiaamp R DNA MiniKit,QIAGEN Inc.,Chatsworth,CA,U.S.A.) 를사용하여 genomicdna 를추출, 정제하였다. 정 제한 DNA 의농도는 260nm 에서흡광도를측정하여계산하였다. 4.mecA 유전자의중합효소연쇄반응 4.1.mecA 유전자에대한 oligonucleotideprimer 의제작 VITEK system 을통하여확인된 MRSA 균주의 meca gene 에특이적인 oligonucleotide 를고안하였다. NCBI(National Center for Biotechnology Information)web site(htp://www.ncbi.nlm.nih.gov/) 를통해서 meca 의 sequence
를수집하고, 이를대상으로 meca sequence 에대하여 multiple sequence alignment 를시행하였다. 이결과를바탕으로 primer 3 program 을이용하여 meca-f, meca-r 의 PCR primer 를고안하고주문제작 (Bionee Co. Taejon, Korea) 하여본실험에사용하였다. 4.2 중합효소연쇄반응에사용되는 PCR primer 의민감도시험 중합효소연쇄반응에사용한 primer 들은 table 4 에나타내었다. 이번 실험에서 고안한 primer 와 Oliveira(1) 등이고안한 primer 에대한민감도시험을시행하였 다. 중합효소연쇄반응은 AccuPower R PCR PreMix (Bioneer.Co.Korea) 를사용 하여주형 DNA 농도를최초 30ng 으로시작하여 10 배씩순차적으로최종농도가 0.3pg 이되도록희석하여각각의주형 DNA 2μl를첨가하고각각의 primerset 를 20pmole/ μl를최종농도가 2pmol 이되도록넣은후멸균증류수로최종반응양이 20 μl이되도록하여 thermal cycler(geneamp R PCR System 2700, Perkin-ElmerCetus,Boston,MA,U.S.A.) 를사용하여 DNA 의증폭을시도하였다. 첫 cycle 이시작하기전에 94 에서 5분간가온한후매 cycle 당 94 에서 30 초간 denaturation,43 에서 30 초간 annealing,72 에서 30 초동안 extension 반응을시행하였다. 그리고완전한 extension 을위해 72 에서 10 분간지속하였다. Oliveira 등이고안한 primer 는 47 에서 annealing 을실시하였다. 반응이종료된후 0.5 μg / ml의 ethidium bromide 를첨가한 1.5% agarose gel 에전기영동하여 ultraviolettrans-iluminator(vilberlouramat,mamelavale,france) 로각각의증폭산물들을비교관찰하였다. 4.3. 중합효소연쇄반응을이용한 meca 유전자의검출중합효소연쇄반응은 templatedna 2μl에 datp,dgtp,dttp,dctp 를각각 2.5mM 이되도록혼합한 dntps 를최종농도가 200µM 이되도록넣었다. 그후 10 bufer(10mm Tris-HCl,400mM KCl,15mM MgCl 2)2 μl, TaqDNA polymerase0.5u 을첨가하고각각 primerset20pmol/ μl를최종반응농도가 2 pmol 이되도록넣은후멸균증류수로최종반응하는양이 20 μl가되도록하여
thermalcycler(geneamp R PCR System 2700,Perkin-ElmerCetus,Boston,MA, U.S.A.) 를사용하여 DNA 의증폭을시도하였다.mecA gene 의검출을위한 PCR 반응은총 25cycle 을시행하였으며, 첫 cycle 이시작하기전에 94 에서 5분간가온한후매 cycle 당 94 에서 30 초간 denaturation,43 에서 30 초간 annealing, 72 에서 30 초동안 extension 반응을시행하였다. 그리고완전한 extension 을위해 72 에서 10 분간지속하였다. 반응이종료된후 0.5 μg / ml의 ethidium bromide 를첨가한 1.5% agarosegel 에전기영동하여 ultraviolettrans-iluminator 로각각의증폭산물들을비교관찰하였다. 5.SCCmec 유전자에대한다중중합효소연쇄반응 SCCmecmultiplex PCR 에사용한 primer 는 Oliveira(1) 등이사용한것과같은 8종류의 oligonucleotide 을주문제작 (BioneerCo.,Taejun,Korea) 하여본실험에사용하였다. PCR 반응은 template DNA 2 μl에 AccuPower R PCR PreMix (Bioneer.C Ltd.,Korea) 를사용하여 Oliveira 등이사용한 primer 들을각각의최종반응농도가되도록넣은후멸균증류수로최종반응하는양이 50 μl가되도록하여 thermal cycler(geneamp R PCR System 2700,Perkin-Elmer Cetus, Boston,MA,U.S.A.) 를사용하여 DNA 를증폭하였다.PCR 반응은총 35cycle 을시행하였으며, 첫 cycle 이시작하기전에 94 에서 5분간가온한후매 cycle 당 94 에서 30 초간 denaturation,53 에서 30 초간 annealing,72 에서 1분동안 extension 반응을시행하였다. 그리고완전한 extension 을위해 72 에서 4분간지속하였다. 반응이종료된후 0.5 μg / ml의 ethidium bromide 를첨가한 2% agarose gel 에전기영동하여 ultraviolet trans-iluminator(vilber Louramat,Mame La Vale,France) 로각각의증폭산물들을비교관찰하였다.
Table 1. Specimens of MRSA clinical isolates from 121 st General Hospitaland Korean healthcarehospital(khh) Specimens 121 st GeneralHospital KHH Wound 5 5 Abcess 7 Nasalswap 2 4 Skin 9 1 Pus/exudate 7 10 Urine,cathetertip 6 Sputum 6 CSF 2 Blood 3 Eye 1 Others 4 Total 30 42
제 3 장연구성적및결과 1. 황색포도상구균 (S.aureus) 의분리 본실험에사용한모든균주는 catalase 검사와 coagulase 검사에서모두양성의결과를그리고 mannitolsaltagar 에서배양한결과노란색집락을나타내었다 (Figure1).
Figure1.MRSA clinicalisolateson MSA(mannitolsaltagar). Left:MRSA clinicalisolates-47,right:mrsa clinicalisolates-5.
2. 항생제감수성검사결과비교분석 2.1 Vitek 자동분석기를사용한항생제에대한감수성검사 Vitek 자동분석기를사용한각각의항생제에대한 MIC 를측정한결과모든임상분리균주들이 ampicilin,penicilin,ampicilin/sulbactam 그리고 oxacilin 에대해내성을나타냈으며,nitrofurantoin 과 vancomycin 에는모두감수성을나타내었다 (Table2). 121 st GeneralHospital 에서분리된 30 주의 MRSA 균주들은 tetracycline,gentamicin,rifampin,trimethoprim/sulfamethoxazole 에감수성을나타내었으며,cipro floxacin,clindamycin,erythromycin 에각각 13%,10%, 그리고 55% 의내성을나타내었다. 서울지역병원에서분리된 MRSA 균주들은 tetracycline,gentamicin, ciprofloxacin,clindamicin 에모든균주들이내성률을나타냈으며,erythromycin 에서는 94%(16 균주 ),rifampin 에서 17%(3 균주 ), trimethoprim/sulfamethoxazole 에서는 58%(10 균주 ) 의균주가내성을나타내었다. 또한같은기간부산지역병원에서분리된 MRSA 균주들의내성률은 tetracycline 에서 64% (16 균주 ),gentamicin 에서 60%(15 균주 ),rifampin 에서 4%(1 균주 ),trimethoprim/sulfamethoxazole 에서 20%(5 균주 ),erythromycin 에서 72%(18 균주 ),clindamycin 에서 56%(14 균주 ), ciprofloxacin 에서 68%(17 균주 ) 의내성을보였다. 한편 1999 년에원주에서분리된 MRSA 균주들은 tetracycline 에대부분 (98%) 이감수성을나타내었으며 trimethoprim/sulfamethoxazole 에서는모두감수성을나타내었다. 또한 gentamicin, ciprofloxacin,clindamycin,erythromycin,rifampin 에서는각각 75%,93%,90%, 95%, 그리고 5% 의내성률을나타내었다 (Table2).
Table 2.Antimicrobialresistance paterns ofmrsa clinicalisolates by VITEK system Antimicrobialagents Abbreviation.AMP;ampicilin,AMS;ampicilin/sulbactam,CC;clindamycin,CIP;ciprofloxacilin, CZ; cefazolin, ERY; erythromycin, GEN; gentamicin, OX; oxacilin, PEN; penicilin, SXT; trimethoprim/sulfamethoxazole,tet;tetracycline. Healthcarefacility Number ofisolates 121 st KHF Wonju AMP,AMS,CZ,OX,PEN 13 4 17 AMP,AMS,CZ,OX,PEN,ERY 13 2 15 AMP,AMS,CZ,OX,PEN,ERY,CC 3 3 AMP,AMS,CZ,OX,PEN,CIP 2 2 AMP,AMS,CZ,OX,PEN,ERY,CIP 1 1 AMP,AMS,CZ,OX,PEN,TET 1 1 AMP,AMS,CZ,OX,PEN,TET,ERY,GEN,CIP 2 2 AMP,AMS,CZ,OX,PEN,TET,ERY,GEN,CIP,CC 16 16 AMP,AMS,CZ,OX,PEN,TET,ERY,GEN,CIP,CC,SXT 11 11 AMP,AMS,CZ,OX,PEN,TET,GEN,CIP,CC,SXT 4 4 AMP,AMS,CZ,OX,PEN,TET,GEN,CIP,SXT 1 1 AMP,AMS,CZ,OX,PEN,TET,CIP,SXT 1 1 AMP,AMS,CZ,OX,PEN,GEN,TET 2 2 AMP,AMS,CZ,OX,PEN,GEN,TET,ERY 1 1 AMP,AMS,CZ,OX,PEN,GEN,TET,CC 3 3 AMP,AMS,CZ,OX,PEN,GEN,TET,ERY,CC,CIP 25 25 AMP,AMS,CZ,OX,PEN,GEN,TET,ERY,CIP 2 2 AMP,AMS,CZ,OX,PEN,TET,ERY,CIP 5 5 Total 30 42 36 108
2.2. E-test 를이용한 cephalothin 과 oxacilin 에대한각 MRSA 분리지역별 MIC 결과비교분석 121 st GeneralHospital 에서분리된 30 주와한국병원에서분리된 17 주, 그리고원주기독병원에서분리된 36 주를 oxacilin 과 cephalothin strip 를사용하여 MRSA 분리주들에대한 MIC 를비교하였다. E-test 를이용한 MIC 시험법은 cephalothin 과 oxacilin 에대한지침서에따라서시행하여판독하였다 (Figure 2). 121 st GeneralHospital 에서분리된 MRSA 균주에서는대분분의균주가 oxacilin 에대한 MIC 가 8μg / ml이하인반면, 한국병원과원주기독병원에서분리된균주에서는모든균주들이 256 μg / ml이상의강한내성을보였다. 또한 cephalothin 에서는 121 st GeneralHospital 분리균주 30 균주중 27 개의분리균주가 4μg / ml이하의내성을나타낸반면한국병원에서분리된균주들은대부분 64 μg / ml이하의내성을나타냈다. 이로서 121 병원과한국병원에서분리된균주간에는내성도의현저한차이를볼수있었다. 반면 1999 년원주기독병원과 2004 년도에한국병원에서분리 된 MRSA 균들의내성도는 oxacilin 약제에서는모두가 256 μg / ml이상의강한 내성을보였고 cephalothin 에서는 64 μg / ml이상의내성을보였다. 1999 년과 2004 년도에분리된균주들의내성률을비교하여본결과 oxacilin 에서는모두 256 μg / ml이상의강한내성을보여주었으나,cephalothin 에서는 2005 년도에분리주중약 80% 의균주가 128 μg / ml이상의내성을나타내었으며,1999 년도에는 58% 가 128 μg / ml에내성을나타내었다 (Table3).
oxaci l l i n cephal ot hi n S.aureus ATCC 29213 oxaci l l i n cephal ot hi n MRSA i sol at es-62 oxaci l l i n cephal ot hi n S.aureus ATCC 43300 E.col iatcc 25922 oxaci l l i n cephal ot hi n MRSA i sol at es-107 oxaci l l i n cephal ot hi n MRSA i sol at es-121 Fi gur e 2. M I C( mi ni mum i nhi bi t or y concent r at i on) t est f or r ef er ence st r ai ns and M RSA cl i ni cali sol at es by E-t est.
Table3.MIC ofmrsa clinicalisolatesby E-test Healthcare MIC (Minimum inhibitoryconcentration) Number facilities Antibiotics ofisolates >4 >8 >16 >32 >64 >128 >256 121 st oxacilin 14 9 2 4 1 0 0 cephalothin 27 1 1 1 0 0 0 KHH oxacilin 0 0 0 0 0 0 17 cephalothin 0 0 0 1 3 6 7 30 17 Wonju oxacilin 0 0 0 0 0 0 36 cephalothin 0 1 0 0 14 13 8 36 Total 83
3. 중합효소연쇄반응에사용된 PCR primer 의민감도시험 MRSA 의 meca gene 을검출하기위해고안된 PCR primer 와 Oliveira(1) 등이사용한 PCR primer 들을 (Table 4) 비교해본결과이번실험에서새롭게고안한 primer 는 3pg DNA 에서도양성반응을나타내었으나기존에사용되었던 primer 는 30pg DNA 에서양성으로나타났다. 따라서본실험에서고안한 meca primer set 가기존의 Oliveira 등이 (1) 사용한 primer 에비하여 10 배이상 meca 유전자검출에민감한것으로나타났다 (Figure4).
Table4.Oligonucleotidesequencesused foramplification in thisstudy Oligonucleotide Sequence(5'to3') Tm ( ) Expectedsize(bp) ofpcr product meca-f meca-r GGTGAAGTAGAAATGACTGA CTCATATGCTGTTCCTGTAT 52 339 MECA-F* MECA-R* TCCAGATTACAACTTCACCAGG CCACTTCATATCTTGTAACGCG 50 162 *Oliveiraetal.(1)
M 1 2 3 4 5 6 N M 1 2 3 4 5 6 N 339bp 162bp Figure3.Sensitivity testforpcr amplification ofmeca gene. Left ; primer designed for this study (meca-f,r),right ; primer used in reference(meca-f,r)lanem ;100bp DNA ladder(takara),lanen ;negative control,lane 1 ;template DNA(S.aureus ATCC 43300;30 ng),lane 2-6 ; ten-foldserialdilutionoftemplatedna.
4. 중합효소반응을이용한 meca 유전자검출 이번실험에서고안한 primer 를사용하여중합효소연쇄반응을시행한결과양성대조군으로사용된 S. aureus ATCC 43300 과 108 균주의임상분리균주에서 meca gene primer 를사용한 PCR 에서예상하였던 339 bp 의산물이검출되었다 (Figure4).
M P 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 N 339bp Figure4.PCR amplification ofmeca geneformrsa clinicalisolates. Lane M ; 100 bp DNA ladder(takara Bio Inc,Japan),lane P ; positive control(s.aureusatcc 43300),lane1~14;MRSA clinicalisolates,lanen ; netativecontrol.
5.SCCmec 유전자의다중중합효소연쇄반응 meca 유전자의검출이확인된총 108 균주를 Oliveira 등 (1) 이사용한 8개의 loci(a-h) 를검출하기위한 primer 를주문제작하여다중중합효소연쇄반응에사용하여실시하였다.108 개의모든균주는 SCCmectype1- IV 중하나의 type 혹은 2,3 개의 type 으로분류되었다 (Figure5).
M 1 2 3 4 5 6 7 500bp Figure5.Validation ofthemultiplex PCR strategy. Lane M ;100 bp DNA ladder(takara Bio Inc,Japan),lane 1~7 ;MRSA clinicalisolates-1,14,19,26,57,78,98.
제 4 장 고찰 1959 년 methicilin 이 penicilin resistantstaphylococcusauresus 감염증에사용된이래 1961 년에영국에서 MRSA 가임상검체에서처음으로발견된이래유럽을비롯하여전세계적으로 MRSA 는중요한병원감염의중요한원인균이되고있다. 본연구에서는국내에주둔하고있는미군들의임상가검물에서분리된 MRSA 균주와국내병원환자들의가검물에서분리된 MRSA 임상분리균주들간의항생물질에대한내성을비교분석하였으며 MRSA 를유발하는 meca gene 의검출을시도하였다. 2005 년 1월부터 4월까지서울에소재한미8군소속 121 st GeneralHospital laboratory 에서분리한 30 주의 MRSA 임상분리균주와국내병원 (Korean healthcarehospital,khh) 에서분리한 42 주의 MRSA 임상분리균주, 그리고 1999 년강원도원주시소재의원주기독병원에서분리한 36 주의 MRSA 임상분리균주를대상으로하였다. 연구결과 2005 년 121 st GeneralHospital 에서분리한 MRSA 임상분리균주들이 tetracycline,gentamicin,trimethoprim/sulfamethoxazole 에모두감수성을나타내었으며서울지역에서분리한모든 MRSA 임상분리균주들은모두내성을나타낸것은 MRSA 임상분리균주들간의내성도의차이가확연하게다른것으로나타났다. 그리고 clindamycin 과 ciprofloxacin 의경우 121 st General Hospital 에서분리한 MRSA 임상분리균주들은약 10% 이하의내성률을나타내고있으나서울지역병원에서분리한 MRSA 임상분리균주들은 100% 의내성을나타 내고있다. 또한서울지역병원에서분리된 MRSA 임상분리균주들이같은시기 부산에서분리된 MRSA 임상분리균주들에비해항균제에대한내성도가약 10~ 40% 정도로강한내성도를나타내고있다.1999 년도원주에서분리된 MRSA 임상분리균주들이 2005 년도부산지역에서분리된 MRSA 임상분리균주들에비해 5~20% 정도의강한내성을나타낸반면 trimethoprim/sulfamethoxazole 과 tetracycline 에서는모두감수성, 그리고 2% 의내성률을나타내었다. 본연구의결과로시기에따른항성제의내성도와지역적인차이에따라부산과서울그리고
국내에거주하는외국인에서분리한 MRSA 임상분리균주들에대하여항생제에 따라내성도의차이를알수있었다. 이러한 MRSA 임상분리균주의항생제에대한내성도의지역별차이는국내에서의항균물질남용의결과항생제에대한내성률이심각한상황에이르고있음을의미한다고할수있다. 미국의경우병원내에서 200 만명의환자들이감염되고있으며이감염의 60% 는내성세균에의한감염으로그중 40% 는 methicilin resistantstaphylococcus aureus 에의한것으로알려져있다.MRSA 감염은 1998 년에 12% 이던것이 2003 년에는 43% 로증가되었으며 Ko 등 (3) 에의하면 MRSA 임상분리균주는 ciprofloxacin 에 14%, clindamycin 에 3%, tetracycline 에 3%, 그리고 trimethoprim/sulfamethoxazol 에 1% 의내성률을나타내었으며 vancomycin, gentamicin, nitrofurantoin, 그리고 rifampin 에는전부감수성임을보고한바있다. 그리고미국내의군인지역병원의외래환자에서분리된 MRSA 임상분리균주들중 91% 는 erythromycin 에내성임을보고한바있으나본연구에서는 55% 의내성률을나타낸것은병원입원환자와외래환자의모든검체를대상으로차이를보인것으로사료되며,ciprofloxacin, tetracycline,gentamicin,rifampin, 그리고 clindamycin 내성률에서는약간의미세한차이를보일뿐이다. E-Test 를이용한 MIC 측정에서는 121 st GeneralHospital 에서분리한 MRSA 임상분리균주에서는대부분의균주가 oxacilin 의경우 MIC 가 8μg / ml이하인반면, 국내병원들과원주기독병원에서분리한 MRSA 임상분리균주에서는모두 256 μg / ml이상에서강한내성을나타내었으므로집단간의 MRSA 임상분리균주들의내성도의차이를알아볼수있었다. 그리고 cephalothin 의경우는 121 st General Hospital31 주중 27 주의 MRSA 임상분리균주의 MIC 가 4μg / ml이하의내성을나타낸반면국내병원들에서는대부분의 MRSA 임상분리균주의 MIC 가 64 μg / ml의내성을보여주었다. 이결과로서 121 st GeneralHospital 과국내병원들에서분리한 MRSA 임상분리균주들간에는 oxacilin 에대한내성도의차이를볼수있었다. 연도별국내병원들간의 MRSA 분리균주의경우 2005 년도에분리한균주들과 1999 년원주에서분리한 MRSA 임상분리균주들의내성도의변화는 oxacilin 의경우모두가 MIC 가 256 μg / ml이상의강한내성을보이므로여전히강한내성률을
나타내고있었으며, cephalothin 의경우 1999 년도에원주지역에서분리한 MRSA 임상분리균주에비해 2005 년도에분리한 MRSA 임상분리균주에서내성률이높아진것으로나타났다. 분자생물학적검출방법인중합효소연쇄반응을시행하여총 108 주의 MRSA 임상분리균주에서모든임상분리균주들이 meca 유전자가검출되어 MRSA 임상분리균주가 meca gene 을가지는것으로사료된다. 중합효소연쇄반응을통하여 meca 유전자의검출이확인된총 108 주의 MRSA 임상분리균주를 Oliveria 등 (1) 이사용한 8개의 loci(a-h)primer 를주문, 제작하여다중중합효소연쇄반응에사용하였으며 108 균주모든균주가 SCCmectypeⅠ- Ⅳ 중하나로분류된것을확인하였다 (Figure5). 결론적으로보아 3개의집단에서분류된 MRSA 임상분리균주를대상으로 VITEK system 과 E-test 를이용하여항생제내성률을조사한결과 121 st General Hospital 에서분리한 MRSA 임상분리균주들과국내병원들에서분리한 MRSA 임상분리균주들간의항생제내성률에대한큰차이점을발견하였으며국내에서분리한 MRSA 임상분리균주가항생제에대한내성률이크게더높은것으로나타났다, 따라서국내에주둔하고있는 121 st GeneralHospital 과국내병원에서분리한 MRSA 임상분리균주들을다중중합효소연쇄반응을통한 SCCmec type 에따른밴드패턴의차이점에대한연구도지속하여이들 MRSA 임상분리균주들의분자생물학적역학조사의기초자료로활용할필요가있다고사료된다.
제 5 장결론 2005 년 1월부터 4월까지서울에위치한미8군의 121 st GeneralHospital 검사실에서국내에주둔하고있는외국인들의임상가검물에서분리한 MRSA 임상분리균주중 30 주의임상분리균주와국내병원들에서분리한 42 주의 MRSA 임상분리균주, 그리고 1999 년도강원도원주시에소재하고있는원주기독병원진단검사의학과에서분리한 36 주의 MRSA 임상분리균주를대상으로자동화분석기기인 VITEK system 과 E-test 를이용한항균물질에대한감수성시험을통하여 MIC 를측정하고, 분자생물학적인진단방법인중합효소연쇄반응을이용하여 meca 유전자의검출을시행하였다. 121 st GeneralHospital 에서분리한 MRSA 임상분리균주들과국내병원들에서분리한 MRSA 임상분리균주들은항생제에따라내성률및내성도의차이가나타났으며국내에서감염되고있는 MRSA 임상분리균주들이 121 st GeneralHospital 에서분리한 MRSA 임상분리균주들에비해항생제에대한내성도가높은것을확인할수있었으며국내병원에서분리된 MRSA 임상분리균주들의경우 1999 년과 2004 년도의시기적인차이에따라내성도의강도가높아졌음을확인할수있었다. 또한모든 MRSA 임상분리균주들에서 meca 유전자를검출하기위한분자생물학적인검출법인중합효소연쇄반응을시행하였으며 SCCmectype 을알아보기위해다중중합효소연쇄반응을시행하였다. 항생제에내성도에따른 MRSA 임상분리균주들간의분자역학적인검사법을이용하여항생제에대한내성도를분류할수있으며 MRSA 임상분리균주들을대상으로분자역학적인실험으로의적용이가능할것으로사료된다.
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Abstract Paternsofantimicrobialresistanceand detection of meca genefrom methicilin resistantstaphylococcus aureusisolated from healthcarefacilitiesand U.S.military hospitalin Korea Sin,ChinSu Dept.ofBiomedicalLifeScience TheGraduateSchoolofHealthandEnviornment YonseiUniversity A totalof108 strains ofmrsa clinicalisolates was colected from 121 st generalhospital(u.s.military hospital),korean healthcarefacility from January to March in 2005 and WonJu Christian hospitalin 1999.To analyze and determine the type of resistance to antimicrobial agents, antimicrobial susceptibility test by Vitek System and MIC test using oxacilin and cephalothinstripesby E-Test. PCR based detection of meca gene were performed and the location of SCCmec were tested on the alofmrsa clinicalisolates by multiplex PCR andfoundthelocationofpcr products. In conclusion,mrsa clinicalisolates was characterized with the results from antimicrobialagents resistance paterns,pcr based detection of meca gene and validation ofthe multiplex PCR strategy ofsccmec among 121 st generalhospital,khf,andwonjuclinicalisolates. Keywords:MRSA,VITEK,E-test,MIC,mecA,PCR,SCCmec,Multiplex PCR