Ann Clin Microbiol Vol. 16, No. 3, September, 213 http://dx.doi.org/1.5145/acm.213.16.3.126 ISSN 2288-585 Molecular Characteristics of bla OXA-23 -Producing Acinetobacter baumannii Isolated from a University Hospital In-Ho Jang 1, Soon Deok Park 1, Young Uh 1, Gyu-sang Lee 2, Jong-Bae Kim 2, Il Choi 3 1 Department of Laboratory Medicine, Yonsei University Wonju College of Medicine, 2 Department of Biomedical Laboratory Science, College of Health Science, Yonsei University, 3 Department of Animal Science and Technology, College of Life Science and Natural Resources, Sangi University, Wonju, Korea Background: Multi-drug resistant (MDR) Acinetobacter baumannii has emerged as a significant infectious agent in hospitals worldwide. The purpose of this study was to determine the molecular characterization of MDR A. baumannii clinical isolates. Methods: Two hundred eighty-five strains of non-duplicated A. baumannii collected from March to November 211 from a university hospital laboratory located in the Wonju area of the Gangwon province of Korea were analyzed for MDR genes. Results: All of the 285 imipenem-resistant A. baumannii isolates were encoded by a bla OXA-23-like gene, and all isolates with the bla OXA-23-like gene had the upstream element ISAba1. The 16S rrna methylase gene arma was detected in 153 (5.2%) clinical isolates, but rmta, rmtb, rmtc, rmtd and npma were not detected in any isolates in the present study. The gene encoding aac(6')-ib was the most prevalent aminoglycoside-modifying enzyme. The sequencing data for the quinolone resistance-determining region of gyra and parc revealed the presence of Ser (TCA) 83 to Leu (TTA) and Ser (TCG) 8 to Leu (TTG) substitutions. All but one of the 285 A. baumannii isolates showed similar band patterns on repetitive extragenic palindromic-pcr profiles. Conclusion: The molecular characteristics of the resistance genes of MDR A. baumannii isolates obtained from the Wonju area of Gangwon province were similar to those of other areas in Korea. (Ann Clin Microbiol 213;16:126-133) Key Words: Acinetobacter baumannii; Beta-lactamases; Genes, Multidrug resistance; Imipenem INTRODUCTION Acinetobacter baumannii에의한감염증치료에는 imipenem, meropenem과같은 β-lactamase에비교적안정한 carbapenem 계열의항생제들이사용되어왔으나, 다제내성 A. baumannii 균주들의증가로인하여치료약제를선택하기가어려워졌다. Lockhart 등 [1] 은병원내중환자실에서분리된 A. baumannii 중 3% 정도가 carbapenem과 quinolone계항균제가포함된적어도 3가지이상의항균제계열에내성을나타내는임상분리균주임을보고한바있다. Acinetobacter spp. 의 carbapenem 내성의주된기전은 OXA형의 carbapenemase 로서 OXA-23, OXA- 24/4, OXA-51 및 OXA-58의 4개주요군이있으며, 최근에는브라질에서분리된 A. baumannii에서 OXA-143 이확인되었고 [2], OXA-182 는최초로국내에서분리된 A. baumannii에서검출되 었다 [3]. 현재까지보고된 OXA형 carbapenemase 는주로 OXA- 23-like (OXA-23, -27) 와 OXA-24-like (OXA-24, -25, -26, -4) 의두가지다른무리로분류된다 [4-6]. OXA-23은 1985년스코틀랜드에서분리된 imipenem 내성 A. baumannii에서처음검출되었고, 국내에서는 24년에 imipenem 내성을획득한 A. baumannii의 77.8% 에서 OXA-23 생성을보고하였으며 [7], 26년에는 imipenem 내성을획득한 Acinetobacter spp. 75주중 25주 (33.3%) 에서 OXA-23 생성을보고하였다 [8]. A. baumannii에서발견되는 insertion sequence ISAba1은 OXA-23을생성하는 A. baumannii의경우에 bla OXA-23 유전자의 upstream에존재하여 promoter로작용하고 bla OXA-23 유전자를과도발현시켜다제내성을유발하는데관여하는것으로알려져있다 [9]. OXA-51-like 는모든 A. baumannii의염색체에존재하므로균종의동정에도사용할수있으며, OXA-51, -64, -65, -66, -68, -69, -7, -71, -78, Received 18 March, 213, Revised 1 May, 213, Accepted 27 May, 213 Correspondence: Young Uh, Department of Laboratory Medicine, Yonsei University Wonju College of Medicine, 162, Ilsan-dong, Wonju 22-71, Korea. (Tel) 82-33-741-1592, (Fax) 82-33-731-56, (E-mail) u93118@yonsei.ac.kr c The Korean Society of Clinical Microbiology. This is an Open Access article distributed under the terms of the Creative Commons Attribution Non-Commercial License (http://creativecommons.org/licenses/by-nc/3.) which permits unrestricted non-commercial use, distribution, and reproduction in any medium, provided the original work is properly cited. 126
In-Ho Jang, et al. : bla OXA-23-Producing A. baumannii 127-79, -8, -82 등이 OXA-51-like 에속한다 [1]. OXA-51의 carbapenem 분해능은매우약하며, ISAba1이 OXA-51-like 유전자의 upstream에위치하지않은경우에는 carbapenem 감수성에영향을거의미치지않는다 [11]. 그러나 ISAba1이 upstream에위치하게되면이 insertion sequence는 OXA-51-like 유전자에 promoter sequences를공급하여, OXA-51의과량생성을유발하지만 OXA-51의미약한 carbapenem 분해능때문에 OXA-51이과량생성되어도 A. baumannii 균주에대한 carbapenem의최소억제농도는 3배정도만증가하는것으로알려져있다 [12]. Ambler class A에속하는 bla PER-1 유전자는국내에서분리되는 A. baumannii가 cefepime에대한내성을획득하는데중요한기전중하나로알려져있는데, cefepime 내성 A. baumannii 에서 PER-1 효소의검출률은 37.2-86.9% 로보고되었다 [13-15]. Acinetobacter spp. 의 quinolone계항균제에대한내성은 DNA gyrase (GyrA) 와 topoisomerase IV (ParC) 의 subunit A의돌연변이에의하여야기된다. 가장중요한돌연변이는 quinolone resistance-determining region (QRDR) 이라불리는 GyrA와 ParC의특정위치에서발생하며, 주로 GyrA의 83번째와 ParC 의 8번째코돈에서치환이발생한다 [16,17]. GyrA의추가적인돌연변이는 Gly81, Ala84, Glu87로알려져있으며, 이들돌연변이로인해 quinolone계항균제에내성을유도하며, ParC의경우는 Gly78과 Glu84의아미노산치환이 Ser83과 Ser8과같이확인되는경우에는 quinolone에높은수준의농도에서까지내성을유발하는것으로알려져있다 [18,19]. Aminoglycoside 항생제에대한주요내성기전은 acetylation, adenylation, phosphorylation과같은화학적변화에의한 aminoglycoside의불활성화이며 [2], ArmA, RmtA, RmtB, RmtC, RmtD와 NpmA와같은효소들에의하여 16S rrna A site의변화가유발되어대부분의모든 aminoglycoside 항균제에내성을보이게된다 [21]. 23년에는 16S rrna를 methylation하여고도내성을나타내는새로운기전이규명되었다 [22]. 23년과 25년에국내환자에서분리된 Acinetobacter 균주중에는 arma 유전자가비교적흔하였다고보고되었다 [23]. A. baumannii의 carbapenem 내성유전자의분포는지역적으로차이가있으므로이들 carbapenem 내성유전자의분포조사는 A. baumannii의역학조사와 carbapenem 내성의특성연구에필수적이다. 본연구에서는강원도원주시소재의대학병원에서분리된 A. baumannii 중 imipenem 내성 A. baumannii를선별하여 β-lactam, aminoglycoside와 quinolone계에대한내성기전을조사하였으며, repetitive extragenic palindromic (REP) sequence-based polymerase chain reaction (PCR) 법을시행하여 imipenem 내성 A. baumannii의유전적근연도를조사하였다. MATERIALS AND METHODS 1. 시험균주 211년 3월부터 11월까지임상검체에서분리된 A. baumannii를대상으로균동정과항균제감수성검사결과를바탕으로중복분리주를제외한 285주의 imipenem 내성 A. baumannii 를선별하여본시험에사용하였다. 임상검체별로는객담 (218 주 ), 흡인관끝 (9주), 혈액 (4주), 기관지세척액 (23주), 가슴관끝 (1 주 ), 카테터끝 (3주), 상처 (4주), 소변 (2주), 기타검체 (21주) 였다. 2. 시험균주의동정임상검체에서분리된세균의동정은전통적동정법과 MicroScan COMBO NC44 (Siemens Healthcare Diagnostics, Sacramento, CA, USA) 로동정하였다. 3. Amplified ribosomal DNA restriction analysis (ARDRA) 를이용한 A. baumannii 의유전종동정균종의유전종 (genomic species) 은 ARDRA 기법 [24] 을사용하여확인하였다. PCR 반응에사용한 primer는 16S rrna의 conserved region이포함된곳으로 primer sequence는 16S rrna 유전자의 5' 시작부위의서열인 5 -TGGCTCAGATTGAACGC TGGCGGC-3 과 16S rrna 유전자의 3' 말단부분의서열인 5 -TACCTTGTTACGACTTCACCCCA-3 를사용하였다. 4. 항균제감수성검사선별된 A. baumannii의항균제감수성검사는 Clinical and Laboratory Standards Institute (CLSI) 에서권장하는디스크확산법 [25] 을시행하였다. 시험대상항균제는 piperacillin, ceftazidime, cefepime, cefoperazone/sulbactam, piperacillin/tazobactam, imipenem, meropenem, aztreonam, gentamicin, tobramycin, amikacin, levofloxacin, trimethoprim-sulfamethoxazole 과 colistin이었다. Colistin의항균제감수성검사는 CLSI[25] 의 Pseudomonas aeruginosa 판정기준에따랐다. 항균제감수성사정도관리를위하여 Escherichia coli American Type Culture Collection (ATCC) 25922, Pseudomonas aeruginosa ATCC 27853을사용하였으며, β-lactam/β-lactamase inhibitor 혼합제제의정도관리를위하여 E. coli ATCC 35218을사용하였다. 항균제디스크는 BD (Becton Dickinson, Franklin Lake, NJ, USA) 의제품을이용하였다. 5. Carbapenemase 활성검사 Imipenem 내성 A. baumannii에대한 carbapenemase의활성을검사하기위하여 modified Hodge test와 imipenem-edta disk synergy test를시행하였다 [26].
128 Ann Clin Microbiol 213;16(3):126-133 6. 중합효소연쇄반응을이용한 β-lactamase 유전자의증폭 bla OXA-23-like, bla OXA-24-like, bla OXA-51-like와 bla OXA-58-like를동시에검출할수있는다중중합효소연쇄반응 [27] 을실시하였다. PCR 반응이끝난후 2% 의 agarose gel을사용하여전기영동을시행하고, 증폭산물을비교관찰하였다. Ambler class A에속하는 bla PER-1 유전자를증폭하기위해 PCR을시행하였다 [15]. 7. Insertion sequence ISAba1 검출및촉진자역할확인 ISAba1 유전자를확인하기위하여 PCR을시행하였다 [28]. ISAba1 유전자의존재가확인되면 bla OXA-23 의 upstream에 ISAba1가존재하여 promotor로작용하는지를확인하기위하여, ISAba1을증폭하기위한 forward primer와 bla OXA-23 를증폭하기위한 reverse primer를사용하여중합효소연쇄반응으로확인하였다 [11]. 8. 중합효소연쇄반응과염기서열분석법을이용한 quinolone계항균제의내성기전조사 Quinolone계항균제에내성을유발하는 A. baumannii의 gyra와 pacc 유전자의돌연변이를확인하기위하여 Hujer 등 [29] 의방법에따라 QRDR을중합효소연쇄반응으로증폭하여염기서열을분석하였다. 증폭된 PCR 산물의염기서열분석을위하여 Applied Biosystems 373XL 96 capillary DNA Analyzer (Applied Biosystems, Foster city, USA) 를사용하였고, ABI Prism R BigDye TM Terminator version 3.1 (Applied Biosystems, Foster city, USA) 을이용하여염기서열을결정하였다. 염기서열결정결과는 A. baumannii의 gyra와 parc 유전자의표준염기서열로각각 GenBank (www.ncbi.nlm.nih.gov/ GenBank) 에 accession number X82165과 X95819로등록되어있는유전자서열과비교분석하여돌연변이여부를확인하였다. 9. 중합효소연쇄반응을이용한 aminoglycoside계항균제의내성기전조사 Aminoglycoside 항생제에내성을유발하는유전자를확인하기위하여 PCR을시행하였다 [21,3]. PCR 반응이끝난후 2% 의 agarose gel을사용하여전기영동을시행하고, 각각의증폭산물의크기를 1 bp DNA plus ladder와비교관찰하였다. 1. REP-PCR 을통한균주간근연도조사 Brain heart infusion broth에 A. baumannii로동정된균주를접종하여 37 o C에서 24시간배양하고, 배양액 1 ml를 12, rpm에서 1분간원심분리하였다. 상청액을제거하고 saline (.85% NaCl) 1 ml에부유시켜원침하여생긴 pellet을 DOKDO-Prep R Genomic DNA Purification Kit (ELPIS-Biotech Inc., Daejeon, Korea) 의술식에따라 genomic DNA를분리하였 다. REP-PCR에사용된 primer는 REP1 (5'-IIIGCGCCGICATC AGGC-3') 과 REP2 (5'-ACGTCTTATCAGGCCTAC-3') 로사용하여세균의 genomic DNA의 REP 서열을증폭하였다. 주형 DNA 2 μl에 datp, dgtp, dttp, dctp를각각 2.5 mm이되도록혼합한 dntps 를최종농도가 2 μmol이되도록첨가하였다. 그후 1 buffer (1 mm Tris-HCl, 4 mm KCl, 1.5 mm MgCl 2) 2 μl, SP-Taq DNA polymerase (Cosmo Genetech Co., Seoul, Korea).5 U, MgCl 2.8 μl를첨가하였다. 각각의 primer set 1 pmol/μl를최종반응농도가 2 pmol이되도록넣은후, 멸균증류수로최종반응하는양이 2 μl가되도록하여 DNA의증폭을시행하였다. PCR 반응은총 3 cycle을시행하였으며, 첫 cycle이시작하기전에 94 o C에서 1분간가온한후에매 cycle 당 94 o C에서 6초동안 denaturation, 45 o C에서 6초동안 annealing, 72 o C에서 2분동안 extension 반응을시행하였다. 그리고완전한 extension을위해 72 o C에서 16분간지속하였다. PCR 반응이끝난후 2.5% 의 agarose gel을사용하여전기영동을시행하고, Molecular Imager R Gel Doc TM XR + Imaging System (Bio-Rad) 로각각의증폭산물을비교관찰하였다. RESULTS 1. 임상분리균주의동정생화학시험으로 A. baumannii로동정된 285주의시험대상균주는 ARDRA 시험에서 Dijkshoorn 등 [24] 의결과와같이모두 A. baumannii로확인되었고, 또한시험균주모두 bla OXA-51-like 이검출되어 A. baumannii임을확인할수있었다. 2. 항균제내성률 285주의 A. baumannii는 piperacillin, ceftazidime, meropenem, piperacillin/tazobactam과 levofloxacin에 1% 내성이었고, cefepime과 trimethoprim-sulfamethoxazole에 98.2%, tobramycin 96.5%, gentamicin 96.1%, aztreonam 95.4%, cefoperazone-sulbactam 78.6% 및 amikacin 7.2% 의순으로내성률을보였으며, colistin에는모두감수성이었다 (Table 1). 3. Carbapenemase 활성 285주의 A. baumannii 모두에서 modified Hodge test 양성이었고, Imipenem-EDTA disk synergy test에서는모두음성이었다. 4. OXA형 β-lactamase와 ISAba1 검출 OXA형 β-lactamase 유전자검출을위한다중중합효소연쇄반응에서 285주의 A. baumannii 모두에서 bla OXA-23-like와 bla OXA-51-like가검출되었고전기영동에서도증폭산물이확인되었다. 또한 bla OXA-23-like가검출된모든임상분리균주들에
In-Ho Jang, et al. : bla OXA-23-Producing A. baumannii 129 Table 1. Antimicrobial resistance for 285 imipenem-resistant A. baumannii isolates Antimicrobial classes Antimicrobial agents % susceptibility S I R Penicillins β-lactam/β-lactamase inhibitor Cephems Carbapenem Monobactam Aminoglycosides Quinolone Folate pathway inhibitor Lipopeptide Piperacillin Cefoperazone/sulbactam Piperacillin/tazobactam Ceftazidime Cefepime Meropenem Aztreonam Amikacin Gentamicin Tobramycin Levofloxacin Trimethoprim/sulfamethoxazole Colistin 1.4.4.4 9.5 2.5 3.2.4 1 2 1.4 4.2 2.4 1.4.4 1.4 1 78.6 1 1 98.2 1 95.4 7.2 96.1 96.5 1 98.2 Abbreviations: S, susceptible; I, intermediate; R, resistant. Table 2. Distribution of quinolone resistant genotypes in A. baumannii Target genes gyra parc Amino acid substitution Polymorphism Amino acid substitution Polymorphism Genotypes Ser 83 to Leu Ser 71 Arg 162 Ser 8 to Leu Pro 19 Pro 19 Lys 124 Lys 126 서 ISAba1 유전자가검출되었다. 5. bla PER-1 의중합효소연쇄반응 Mutations TCA TTA GGT GGG CGA CGT TCG TTG CCT CCA CCT CCG AAA AAG TCG TCA Number of isolates (%) 285 (1.%) 285 (1.%) 285 (1.%) 285 (1.%) 149 (52.3%) 136 (47.7%) 136 (47.7%) 136 (47.7%) 285주의 A. baumannii 모두에서 bla PER-1 유전자는검출되지않았다. 6. Quinolone 내성유발 gyra와 parc 유전자의 QRDR 염기서열분석 285주의 A. baumannii 모두에서 GyrA의 83번째코돈인 serine (TCA) 이점돌연변이에의하여 leucine (TTA) 으로치환되었다. 추가적으로모든균주에서코돈의치환이발생하지않는돌연변이로 GyrA의 71번째코돈인 Ser에서염기서열인 GGT 가 GGG로, 162번째코돈인 Arg에서 CGA가 CGT로염기서열이바뀐것을확인할수있었다 (Table 2). parc 유전자의경우모든균주에서내성을유발하는부위로알려진 ParC의 8번째코돈인 serine (TCG) 이 leucine (TTG) 으로치환되었다. 또한코 Table 3. Distribution of aminoglycoside resistance genes in A. baumannii Genotypes Number of isolates (%) aac(3)-ia aac(3)-iia aac(6')-ih aac(6')-ib aph(3')-ia aph(3')-vi ant(2'')-ia rrn aac(3)-ia+aac(6')-ib aac(3)-ia+aph(3')-ia+aac(6')-ib arma rmta rmtb rmtc rmtd npma arma+aac(3)-ia arma+aac(6')-ib arma+aac(3)-ia+aph(3')-ia arma+aac(3)-ia+aph(3')-ia+aac(6')-ib 81 (28.4) (.) (.) 11 (35.4) 28 (9.8) (.) (.) (.) 52 (18.3) 28 (9.8) 143 (5.2) (.) (.) (.) (.) (.) 1 (.3) 17 (6.) 46 (16.1) 26 (9.1) 돈의치환이발생하지않는점돌연변이가 3곳에서확인되었는데, 첫번째는 19번째코돈인 proline에서 CCT가 CCA로점돌연변이가발생한균주가 149주 (52.3%) 에서확인되었고, CCT가 CCG로확인된균주가 136주 (47.7%) 였으며, 두번째로 124번째코돈인 lysine에서 AAA가 AAG로점돌연변이가발생한균주가 136주있었고, 세번째로 126번째코돈인 lysine에서 TCG가 TCA로점돌연변이가발생한균주가 136주에서확인되었다. 아미노산의변화가없는 19번째코돈에서의 CCG 로의점돌연변이가발생한 136주는 124번째와 126번째에도
13 Ann Clin Microbiol 213;16(3):126-133 돌연변이가발생하였다 (Table 2). 7. Aminoglycoside 계내성유발유전자분포조사 16S rrna methylase 유전자의중합효소연쇄반응에서 143주 (5.2%) 에서 arma 유전자가검출되었으나, rmta, rmtb, rmtc, rmtd와 npma 유전자는검출되지않았다 (Table 3). 다중중합효소연쇄반응에의한 AME 유전자검출률은 aac(3)-ia 28.4%, aac(6')-ib 35.4% 와 aph(3')-ia 9.8% 였으며, 세종류의유전자가모두검출된균주는 28주 (9.8%) 였고, 26주는세종류 AME 유전자와 arma 유전자를동시에가지고있었다 (Table 3). 8. REP-PCR 을이용한균주간의근연도검사 REP-PCR 후전기영동에서증폭산물의크기가 1 bp에서 3, bp 사이에 8-11개의밴드들을확인하였다. 대조균주로 A. baumannii ATCC 1966을사용하여 MDR A. baumannii 임상분리균주와비교해본결과다제내성을나타내는임상분리균주는대조균주와증폭산물의크기와개수의차이가확인되었다. 다제내성임상분리균주의대부분의증폭산물들은비슷한밴드양상을나타냈고, 특정증폭산물의결여를통한 DNA band 수의차이와 1 bp DNA plus ladder와의증폭산물의크기로균주들간의차이를확인할수있었다. 증폭된산물의 DNA band들은 Quantity One version 4.5. program (Bio-Rad) 을사용하여유전적근연도의차이를 unweighted pair group method with mathematical averaging (UPGMA) 방법을이용하여 dendrogram을작성하였다. REP-PCR 증폭산물 DNA 의근연도는 tolerance setting을 5.% 로하여 band-based Dice coefficient로계산하였다. Dendrogram에서의결정값을 8% 수준에서 REP-PCR pattern 들을구분하여근연도를가지는 4개의군 (group) 으로구분하였다 (Fig. 1). 세부적으로군 1을두개의아군 (sub-group) 으로구분하였으며, 근연도 6% 미만으로구분되는 1개의균주를기타로구분하여각군의내성표현형을확인하였다 (Table 4). DISCUSSION 국내 24개병원에서분리된 Acinetobacter spp. 의 imipenem 내성률은 1997년 1% 에서 27년 22% 로꾸준한증가를보이다가 29년에는 51% 로급격히증가하였고이러한급격한증가는 OXA형 carbapenemase의생성에의한것이며, 특히 A. baumannii의경우 bla OXA-23-like의생성이주된원인으로보고하였다 [31]. 또한 quinolone, amikacin, ceftazidime에대한내성률은 1999년부터 27년까지감소하였으나, 29년다시증가하는경향을보이면서각각 67%, 66% 와 48% 까지증가하였다 [31]. 25년 1-8월까지국내 17개병원과한곳의임상검사센터에서수집된 144주의 imipenem 내성 Acinetobacter spp. 중에서 Fig. 1. Dendrogram of the similarity index by unweighted pair group method with mathematical averaging (UPGMA) among two hundred sixty-five A. baumannii isolates provided by REP-PCR analysis. 49주의 A. baumannii에서 bla OXA-23 유전자가존재하므로 bla OXA-23 유전자가 carbapenem 내성의주요원인임을보고되었다 [32]. 21년충청지역의대학병원에서분리된 MDR A. baumannii 중 77% 에서 bla OXA-23 유전자가확인되었으며, 이들모두에서 ISAba1이확인되었다 [33]. 26년에서 27년까지 Asia-Pacific (APAC) 지역의 1개국 41개병원에서분리된 imipenem 내성 Acinetobacter spp. 는 bla OXA-23 유전자의분포가가장높았다 [34]. 따라서국내를비롯한아시아태평양지역에서분리된 A. baumannii의 imipenem 내성은 bla OXA-23 유전자가가장흔한원인으로여겨진다. 또한본연구를포함한국내의자료를종합해보면 bla OXA-23 유전자가시간이지날수록더우세하게분포하는것을알수있었다. 21년강원도춘천에서분리된 86주의 A. baumannii도대부분의 β-lactam계와 quinolone계항균제에내성을나타내었으며, cefepime 과 aminoglycoside계항균제
In-Ho Jang, et al. : bla OXA-23-Producing A. baumannii 131 Table 4. Molecular characterization group of MDR A. baumannii by REP-PCR similarity index Number of isolates showing resistance patterns (%) Aminoglycoside Quinolone β-lactam gyra parc 16S rrna methylase Aminoglycoside modifying enzyme Number of isolates (n=285) Group Substitution Polymorphism Substitution Polymorphism aac(3)-ia aac(6')-ib aph(3)-ia arma ISAba1/ 83 71 162 8 19 (A) 19 (G) 124 126 blaoxa-23-like blaoxa-23-like/ blaoxa-51-like 26 (72.2) 28 (1.) 3 (5.2) 79 (73.8) 26 (72.2) 28 (1.) 3 (5.2) 79 (73.8) 26 (72.2) 28 (1.) 3 (5.2) 79 (73.8) 1 (27.8) 55 (94.8) 55 (1.) 28 (26.2) 1 (1.) 36 (1.) 28 (1.) 57 (1.) 55 (1.) 17 (1.) 1 (1.) 36 (1.) 28 (1.) 57 (1.) 55 (1.) 17 (1.) 1 (1.) 36 (1.) 28 (1.) 57 (1.) 55 (1.) 17 (1.) 1 (1.) 36 (1.) 28 (1.) 57 (1.) 55 (1.) 17 (1.) 1 (1.) 22 (61.1) 24 (85.7) 3 (5.3) 92 (86.) 4 (11.1) 8 (13.8) 23 (21.5) 16 (44.4) 2 (71.4) 2 (35.1) 3 (5.4) 61 (57.) 12 (33.3) 8 (28.6) 8 (13.8) 3 (5.4) 57 (53.3) 36 (1.) 28 (1.) 57 (1.) 55 (1.) 17 (1.) 1 (1.) 36 (1.) 28 (1.) 57 (1.) 55 (1.) 17 (1.) 1 (1.) 36 28 57 55 17 1 1 1-sub 2 3 4 Other 에도높은내성률이었고, colistin에는모두감수성이었는데 [15] 본연구의강원도원주지역에서도 imipenem 내성 A. baumannii는 colistin을제외한대부분의시험한항균제에다제내성이었다. 본연구의 A. baumannii의 imipenem 내성원인은 bla OXA-23-like 유전자를가지고있는모든균주가 bla OXA-23-like 유전자의 upstream에 ISAba1이존재하여내성을유도하는것으로확인되었다. 21년강원도춘천소재의대학병원에서분리된 86주의 A. baumannii에서도본연구와동일하게 bla OXA-23- like와 bla OXA-51-like가동시에검출되었고, ISAba1이 bla OXA-23- like의 upstream에존재하였다 [15]. 이러한결과로볼때강원도영서지역은 ISAba1이 upstream에존재하는 bla OXA-23-like 유전자를생성하는 A. baumannii가확산되어만연되어있어임상검체에서흔히분리되며, carbapenem계항균제에내성을유발하는것으로확인되었다. 그러나 bla OXA-23 유전자의발현에의한 carbapenem 내성의확산이 bla OXA-23 유전자의수평적전달에의한것인지 bla OXA-23 유전자를보유한세균의클론확산 (clonal spread) 에의한것인지는불분명하다. 본연구의 imipenem 내성 A. baumannii는 cefepime에 98.2% 의내성률을보였으나 cefepime 내성을획득하는데중요한기전중하나인 bla PER-1 유전자는모든균주에서존재하지않았다. 강원도춘천에서분리된 MDR A. baumannii에서도본연구에서확인된 GyrA와 parc의돌연변이에의한코돈의치환이확인되었다 [15]. 충청지역의대학병원에서분리된 A. baumannii에서는 GyrA의 83번째 codon인 Ser과 ParC의 8번과 84번코돈의변화가보고되었는데 [35], ParC는본연구에서도 8번코돈의치환이있었으나, 84번코돈의치환은없는것으로보아국내에서도유전자치환이지역적인차이가있는것으로여겨진다. 아미노산의치환이나타나지않는 gyra와 parc 의다형태가 quinolone계열항균제내성에영향을주는지를확인하기위해서는다양한종류의 quinolone계열항균제에대한 MIC 농도를측정해볼수있을것이다. A. baumannii의 aminoglycoside계항균제내성기전은 16S rrna methylase에의한 post-transcriptional rrna methylation 과 AME에의한것이중요내성기전이다 [1]. 본연구에서는 arma 유전자가 5.2% 로가장흔하였고 rmta, rmtb, rmtc, rmtd, rmte과 npma는검출되지않았으며, AME 중에서는 aac(6')-ib가 28.4% 로가장흔하였다. 25년충청지역에서분리된 A. baumannii는 aac(3)-ia, aac(6')-ib, ant(3 )-Ia, aph(3 )-Ia 와 aph(3')-vi 등의유전자가검출되었고, ant(2")-ia와 ant(3")-ia 를같이갖고있는균주도보고하였으나 [36] 본연구에서는 aminoglycoside nucleotidyltransferase (ANT) 를생성하는 A. baumannii는검출되지않았다. 21년강원도춘천에서분리된 A. baumannii도 ANT 종류의 AME가없었으며, arma, aac(3)- Ia, aac(6')-ib와 aph(3')-ia를생성하는균주비율은 52% 로원주지역보다높았다 [15]. 이런결과로볼때강원도영서지역에서
132 Ann Clin Microbiol 213;16(3):126-133 는아직 nucleotidyltransferase를생성하는 A. baumannii가만연하지않은것으로여겨진다. REP-PCR에의한균주간의근연도 8% 이상에서크게 4개의군으로구분되었고, 이중 1번군은두개의소집단으로구분이가능하였다. 각군별분포는군 4가 17주로가장많은분포를나타내었다. 각군별항생제내성양상의특성으로군 1-1의경우 (28주) 는 AME 유전자중 aph(3')-ia가존재하지않았으며, parc 유전자의염기서열에서 19번째코돈에서의다형태가모든 균주에서 G로확인되어다른군과차이를나타내었다. 군 3 (55주) 의경우는군 1-1과마찬가지로 AME 유전자중 aph(3')- Ia가존재하지않았으며, arma도없었고, parc 유전자염기서열에서 19번째코돈에서의다형태가모든균주에서 A로확인되었으며 124, 126번째코돈에서의다형태는나타나지않았다. MDR A. baumannii의항균제내성률과내성유전자의분포는지속적으로모니터링하여병원내전파나지역내확산을조기에감지할수있는시스템을구축해야할것이다. 또한지속적인모니터링데이터는 MDR A. baumannii에의한감염증의치료지침과내성세균확산방지를위해필요한기초자료로활용할수있을것으로생각한다. REFERENCES 1. Lockhart SR, Abramson MA, Beekmann SE, Gallagher G, Riedel S, Diekema DJ, et al. Antimicrobial resistance among Gramnegative bacilli causing infections in intensive care unit patients in the United States between 1993 and 24. J Clin Microbiol 27; 45:3352-9. 2. Higgins PG, Poirel L, Lehmann M, Nordmann P, Seifert H. 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