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1 Korean Journal of Microbiology (2013) Vol. 49, No. 3, pp DOI Copyright c 2013, The Microbiological Society of Korea 보문 경기도내에서분리한캠필로박터제주니균의유전적특성및항생제내성연구 허은선 * 박포현 김종화 손종성 윤희정 이예은 최연숙 윤미혜 이정복 경기도보건환경연구원미생물팀 Genetic Properties and Antimicrobial Resistance of Campylobacter jejuni Isolates from Diarrhea Patients in Gyeonggi-do Eun-Seon Hur *, Po-Hyun Park, Jong-Hwa Kim, Jong-Sung Son, Hee-Jeong Yun, Yea-Eun Lee, Yun-Sook Choi, Mi-Hye Yoon, and Jong-Bok Lee Team of Microbiology, Gyeonggi Institute of Health and Environment, Suwon , Republic of Korea (Received May 6, 2013 / Accepted July 4, 2013) Campylobacter jejuni is one of important food-borne pathogens causing human gastroenteritis. We isolated 42 strains of C. jejuni from diarrhea patients and 4 food-poisoning outbreaks in 2010, Gyeonggi-do. In this study, 42 strains were tested for genetic characteristics, the serotype distribution and antimicrobial resistant rate. The presence of hipo (100%), cdtb (100%), and mutated gyra (95.2%) genes was detected in C. jejuni by polymerase chain reaction (PCR). Detection of mutated gyra gene correlated with ciprofloxacin resistance. Forty isolates had mutated gyra gene and were actually resistant to ciprofloxacin. Furthermore, comparing the gyra DNA sequence data, ciprofloxacin-resistant isolates had a mutation of the DNA sequence from ACA (threonine) to ATA (isoleucine). But 41 strains (97.6%) of patient isolates were susceptible to erythromycin and azithromycin. A total of 35.7% among 42 C. jejuni isolates were identified into 4 different serotypes. The serotype distribution of C. jejuni strains were shown to be HS2(B), HS3(C), HS4(D), HS19(O). To investigate the genotypes of C. jejuni isolated in Gyeonggi province, repetitive sequence polymerase chain reaction (rep-pcr) analysis and SmaI-digested pulsed-filed gel electrophoresis (PFGE) profile analysis were performed. From the PFGE analysis of 42 C. jejuni strains, 12 clusters of PFGE profile were obtained. On the other hand, 11 clusters of rep-pcr profile were obtained from 42 strains of C. jejuni. Keywords: Campylobacter jejuni, gyra, antimicrobial susceptibility, PFGE, rep-pcr Campylobacter jejuni는설사, 복통등의증상을일으키는식품매개장염의중요한원인균으로이미외국에서는살모넬라, 병원성대장균에의한식중독보다 C. jejuni에의한식중독이더많이발생하는것으로보고되고있다 (Altekruse et al., 1999). C. jejuni 는양쪽끝에하나씩극성편모를가지고있는그람음성의나선형간균이며, 5 10% 산소에서주로증식하는미호기성균으로대부분 42 에서잘증식하기때문에 thermophilic Campylobacter 로분류된다. 또한공기중노출이나, 건조, 가열, ph 등에감수성이있고 개의소량의균으로도식중독을일으킬수있으며, 성인보다는유아, 어린이및면역력이낮은사람에게감염률이높다 (Altekruse et al., 1999). C. jejuni는주로가금류, 소돼지등에많이분포하고, 특히닭등의가금류의경우보균률은 % 정도로매우높다 (Zhao et al., 2001; Kim et al., 2010). C. jejuni에의한식중독은여름철에가장빈번하게발생하며원 *For correspondence. hifla@gg.go.kr; Tel.: ; Fax: 인으로는조리가덜되거나, 오염된닭고기섭취와관련된경우가많다. C. jejuni에감염되면보통 2 5일후증상이발생하고전형적으로 5 8일간지속된다. 임상증상으로는설사, 구토, 발열, 메스꺼움등다양한증상을보이며, 일부면역체계가무너진경우에는 Guillan-Barré 증후군및 Reiter 증후군등의더욱심각한질병으로이어질수있다. 1978년벨기에에서 C. jejuni의 quinolone 내성율이 6.3% 임을처음보고하였고 (Vanhoof et al., 1978; Endtz et al., 1991; Piddock, 1995) 이후현재캠필로박터균치료제로 fluoroquinolone계항생제가많이사용되고있다. 그러나 fluroquinolone계항생제사용이증가함에따라이항생제에내성을가진 Campylobacter 균주가증가하고있다 (Zaman et al., 1992). Gaunt와 Poddock가분리된 Campylobacter 균주가운데 fluoroquinolone계항생제인 ciprofloxacin에의한내성균주가 4.1% 임을보고하였고 (Gaunt and Piddock, 1996), 몇몇나라에서는 Campylobacter균의 fluoroquinolone계내성이빠르게증가하여이세균에의한위중한감염의치료에문제점이제기되고있다

2 캠필로박터제주니균의항생제내성과유전적특성 229 Table 1. Sequence of primers used in this study Target PCR product size (bp) Sequence (5'->3') hipo 323 Forward 5'-ACT TCT TTA TTG CTT GCT GC-3' Reverse 5'-GCC ACA ACA AGT AAA GAA GC-3' cdtb 623 Forward 5'-ATC CGC AGC CAC AGA AAG CAA ATG-3' Reverse 5'-GCG GTG GAG TAT AGG TTT GTT GTC-3' Mutated gyra 265 Forward 5'-TTT TTA GCA AAG ATT CTG AT-3' Reverse 5'-CAA AGC ATC ATA AAC TGC AA-3' Positive gyra 368 Forward 5'-TTT TTA GCA AAG ATT CTG AT-3' Reverse 5'-CAG TAT AAC GCA TCG CAG CG-3' Sequencing primer (gyra) Forward 5'-TTA TTA TAG GTC GTG CTT TG-3' Reverse 5'-TAG AAG GTA AAA CAT CAG GTT-3' (Snchez et al., 1994; Gaunt and Piddock, 1996). 현재는 Fluoroquinolone계항생제에대한내성균주의증가로 erythromycin, azithromycin 등의마크로라이드제가대신사용되고있다 (Aarestrup and Wegener, 1999). Fluoroquinolone계항생제는 Campylobacter 등의그람음성균의 DNA gyrase와 topoquinolone 합성을억제하여항균작용을나타내는데 gyra 유전자의돌연변이여부로 fluoroquinolone계항생제인 ciprofloxacin에내성을확인할수도있다 (Charvalos et al., 1996; Zirnstein et al., 1999). 또한 Campylobacter 균종에는 C. jejuni, C. coli, C. lari, C. fetus 등다양한종류가존재하고이중식중독원인균으로중요한균은 C. jejuni이다. C. jejuni를동정하기위해서주로 hippurate 가수분해와항균제감수성시험등을이용하지만그구분이명확하지않아 PCR에의한 hipo 유전자검출이사용되고있다 (Walder, 1979). C. jejuni 균을동정하는다른방법으로는독력인자의유무를확인하는것이다. 장염을유발하는독력인자는명확하게밝혀지지않았지만최근의연구에의하면상피세포에부착, 침입하는능력, cytolethal distending toxin (CDT) 생성이관여한다는보고가있다 (Kim et al., 2008). CDT 독소는 cdta, cdtb, cdtc로이루어져있고, 그중에서 C. jejuni에의한독성에 cdtb가중요한역할을한다고알려져있다 (Purdy et al., 2000; Dassanayake et al., 2005). 방글라데시지역에서분리한 C. jejuni의 97.5% 에서 cdtb 유전자가검출되었고, 우리나라전북지역에서분리한균의경우 cdtb 유전자가 100% 검출되었다 (Kim et al., 2008; Talukder et al., 2008; Lindmark et al., 2009). C. jejuni를 typing하는방법에는혈청형, 파지형등의표현형을분석하는방법과 pulsed-field gel electrophoresis (PFGE), ribotyping, multilocus sequence typing (MLST), repetitive extragenic palindromic polymerase chain reaction (rep-pcr) 등의유전형을분석하는방법이있다. 본연구에서는경기도내병원을내원한설사환자와식중독 outbreak에서분리된 C. jejuni 균주를대상으로 C. jejuni에특이적인 hipo 유전자, 중요독력인자인 cdtb 유전자를확인하였고, gyra 유전자를 PCR과 sequencing 방법으로확인하여 ciprofloxacin에대한내성과의관련성도연구하였다. 또한 C. jejuni의 heat-stable 항원을이용해혈청형을분석하였다. 더불어 PFGE와 rep-pcr을통해분리된 C. jejuni 균의유전형을분 석하여이들사이에유전적상관성을규명하고자하였다. 재료및방법 Campylobacter jejuni의분리및동정 2010년경기도지역병원 ( 고대안산병원, 동수원병원, 성빈센트병원, 분당차병원 ) 을내원한설사환자검체 ( 급성설사질환실험실감시사업 ) 에서분리된 10균주와 4건의식중독 outbreak에서분리된 32균주등전체 42균주를연구에사용하였다. C. jejuni의분리를위해 modified Charcoal Cefoperazone Desoxycholate Agar (Oxoid, UK) 평판배지에검체를도말한후 Campygen (Oxoid) 를첨가하여 42 에서 48시간미호기배양한다음원형또는불규칙한형태의회백색집락을순수분리하였다. 분리된집락은 Campylobacter triplex PCR kit (Kogene, Korea), catalase (BD, USA), API campy (biomériux, France) 를사용해최종동정하였다. 분리된균주는 0.2% yeast extract, 20% glycerol, 5% FBS를첨가한 Brain Heart Infusion (Oxoid) 배지에넣어 -70 deep freezer에보관하였다가실험에사용하였다. DNA 추출및 hipo, cdtb, gyra 유전자검출분리동정된 C. jejuni 균을혈액한천배지에도말한후 42 에서미호기성으로 48시간배양하였다. 순수배양한집락을 200 µl 멸균증류수에부유시켜 100 에서 10분간끓인다음 12,000 rpm에서 5분간원심분리하여상층액을 PCR 주형으로사용하였다. hipo, cdtb, gyra 유전자에대한 primer 염기서열은 Table 1 과같으며, Bioneer (Korea) 에의해합성되었다. 유전자의 PCR 반응은추출한주형 DNA 2 µl, forward와 reverse primer (20 pmole/µl) 각각 1 µl, PCR mastermix (Bioneer) 를사용하여최종 20 µl가되게하였다. hipo와 cdtb 유전자의 PCR 조건은 94 에서 5분간 pre-denaturation한후 94 에서 30초간 denaturation, 57 에서 30초간 annealing, 72 에서 1분간 extension 조건으로 30 cycle 반복한다음 72 에서 5분간 post-extension하였다. Mutated gyra와 positive gyra 유전자의경우 94 에서 3분간 pre-denaturation한후 94 에서 30초간 denaturation, 50 에서 30초간 annealing, 72 에서 20초간 extension 조건으로 30 cycle 반복한다음 72 에서 5분간 post-extension하였다. PCR

3 230 Hur et al. Table 2. Rep-PCR condition Table 3. Outbreak cases of food-borne gastroenteritis by C. jejuni Initial denaturation Repeat cycle: Denaturation Annealing Extension Final extension Rep-PCR protocol 94 2 min 35 cycles sec sec sec 70 3 min Outbreak cases Region No. of C. jejuni Month EnterNet Gyeonggi-do 10 (23.8%) 4 8 Case 1 Gimpo 12 (28.6%) 11 Case 2 Siheung 6 (14.3%) 7 Case 3 Suwon 2 (4.8%) 8 Case 4 Gwangmyeong 12 (28.6%) 8 반응후생성물은 cyber green 염색시약이포함된 2% agasose gel상에서전기영동하여결과를확인하였다. Genomic DNA 추출과 mutated gyra 유전자염기서열분석 C. jejuni 균을혈액한천배지에도말한후, 42 에서미호기성으로 48시간배양한균의 genomic DNA를 QiAmp DNA mini kit (Qiagen, Germany) 를사용해추출하였다. Ciprofloxacin 내성과관련된 gyra 유전자의돌연변이여부를확인하기위해 Table 1의 gyra sequencing primer를사용하여염기서열분석을의뢰하였다 (Solgent, Korea). 항생제감수성시험항생제감수성시험은표준디스크확산법으로실험하였다. 5% sheep blood를포함한 Muller-Hinton agar (Oxoid) 를사용하였다. 혈액배지에서 42, 48시간동안순수배양한균을 TSB (Oxoid) 에부유하여 MacFarland 0.5로맞추고배지에고르게도말하였다. 37 에서미호기상태로 48시간동안배양후억제환의크기를측정하여내성유무를판독하였다. 정도관리를위하여 E. coli ATCC 균주를함께실험하였다. 사용된항생제디스크는 Nalidixic acid (30 µg), Ciprofloxacin (5 µg), Erythromycin (15 µg), Azithromycin (15 µg), Cephalothin (30 µg), Imipenem (10 µg), Chloramphenicol (30 µg), Tetracycline (30 µg) 을사용하였다 (Oxoid). 혈청형시험 C. jejuni에대한혈청형은 Campylobacter antisera (Denka seiken, Japan) 를사용하여 passive hemagglutination (PHA) 법으로실시하였다. 혈액한천배지에서 42, 48시간순수분리한 C. jejuni의 heat-stable antigen을제조사의실험방법으로추출하여항원액을준비하고 fixed chick red blood cells과혼합한후 37 에서 30분간반응시켜감작세포를제조하였다. Microplate well (V bottom) plate에각각의항혈청 1방울씩첨가하고, 각 well에감작세포를 25 µl를넣어잘혼합한후습윤상자에넣어 30분간반응시킨후응집유무를판독하였다. PFGE (Plused-field gel electrophoresis) C. jejuni의 PFGE 분석은표준화된국가실험실망인 PulseNet 방법으로실험하였다. 순수분리된균을면봉으로묻혀낸다음, 2 ml의 cell suspension TE (100 mm Tris; ph 7.5 and 100 mm EDTA; ph 8.0) 에넣어 VITEK colorimeter (biomériux) 를사용하여 20% 의투명도로현탁시켰다. 현탁액 200 µl를 1.5 ml tube 에넣고 1.2% plug용 seakem gold agarose 200 µl를넣어가볍게섞은후바로 plug mold에넣어굳혔다. 2 ml tube에 ES buffer (0.5 M EDTA; ph 8.0, 1% sodium-lauroyl- sarcosine) 와 proteinase K (20 mg/ml) 40 µl가첨가된 lysis solution 1.5 ml에잘굳은 plug를넣고 55 진탕항온수조에서 1시간동안반응시킨다. Plug wash TE buffer (10 mm Tris; ph 7.5 and 1 mm EDTA; ph 8.0) 를밀폐된용기나 PVC tube에넣고 55 진탕항온수조 ( rpm) 에서 20분동안 plug를세척한다. 위의과정을 5회실시한후세척이끝난 plug를 1 mm 두께로잘라 40 U/µl SmaI 제한효소 (Roche, USA) 를이용하여 37 에서 2시간 30분동안반응시킨다. 제한효소를처리한 plug gel을전기영동장치 (CHEF DR3, Bio-Rad) 를사용해 initial time 6.76 sec, final time sec, 전압 6 v/cm, 120, 18시간동안전기영동하였다. 전기영동이완료되면 cyber gold 염색시약 (Invitogen, USA) 에 gel을넣어 30분간염색을한다. 염색이끝나면증류수를이용하여 1시간동안탈색을시킨후 UV로확인하였다. 확인된사진은 Bionumerics 프로그램을이용하여분석하였다. Repetitive sequence polymerase chain reaction (rep-pcr) 순수배양한 C. jejuni의 genomic DNA를 MoBio Ultra clean Microbial DNA isolation kit (MoBio Laboratories, USA) 를사용하여추출하였다. 추출한 DNA 2 µl, rep-pcr MM1 18 µl, GenAmp 10X PCR buffer 2.5 µl, primer mix 2.0 µl, amplitaq DNA Polymerase 0.5 µl를혼합해 rep-pcr (Campylobacter kit, biomérieux) 을실시하였다. PCR 증폭은 validation된 personal thermal cycler (Biometra, Germany) 로수행되었고, PCR 반응조건은 Table 2와같다. 증폭된 PCR 산물을 micro-fluidic chips 에주입하여전기영동한후 Caliper Labchip Agilent 2100 Bioanalyzer (Agilent Technologies, USA) 로분석하였다. Diversilab Web interface software를사용해 C. jejuni의 rep-pcr profiles을 98% cutoff로하여유전적연관성을확인하였다. 결과및고찰경기도내 Campylobacter jejuni 의분리경향 2010년경기도내에서분리된 C. jejuni의균주는총 42주로도내 4개의종합병원설사환자 ( 급성설사질환실험실감시사업 ) 를대상으로 10균주, 4건의식중독 outbreak를통해분리된균주가 32균주였다 (Table 3). mccda 선택배지상에서원형또는불규칙한형태의회색집락을종특이유전자 PCR, catalase 양성, API campy 실험을통해분리동정하였다. 월별로살펴보면 8월

4 캠필로박터제주니균의항생제내성과유전적특성 231 Table 4. Frequency of drugs resistance in 42 C. jejuni isolated from patients with diarrhea Antimicrobial drugs Conc. (µg/ml) No. of resistance strains (N=42) Nalidixic acid (95.2%) Ciprofloxacin 5 40 (95.2%) Erythromycin 15 1 (2.4%) Azithromycin 15 1 (2.4%) Cephalothin (100%) Imipenem 10 1 (2.4%) Chloramphenicol 30 0 (0.0%) Tetracycline (69%) 에가장높은분리율 (40.4%) 을보였고 6 8월까지 66% 가분리되어주로여름철에집중적으로분리됨을알수있었다. 또한 11월에도 11건의 C. jejuni 균이분리되었는데, 급식으로나온삼계탕을먹고학교에서집단으로식중독이발생한 case에서모두분리되었다 (Fig. 1). 질병관리본부 (CDC) 자료를살펴보면매년 C. jejuni의분리율이높아지고있다. 실제 년평균치보다 2009년과 2010년에분리율이더높게나타나식중독원인균으로 C. jejuni 가점점더중요해지고있다. 또한 6 8월사이온도가높은여름철에분리율이높았으며, 이는서울지역 (Lee et al., 2002), 부산 지역 (Park et al., 2007) 설사환자로부터분리한 C. jejuni의분리경향과동일하였다. C. jejuni에의한식중독발생시원인식품을살펴보면치킨, 삼계탕, 닭육회등닭고기음식이대부분이였다. 국내에서닭의 C. jejuni 균분리율은 Kim 등이 (2008) 52% 로보고하였고, 일반적으로 C. jejuni균의보균율이 % 로매우높다고알려진바, 덜익히거나오염된닭고기가이균에의한감염원으로매우중요함을알수있다. 따라서이들식육제품의위생적처리가무엇보다중요하다고하겠다. 설사환자에서분리된균주의 hipo, cdtb 유전자검출분리된 42균주모두가선택배지상에서전형적인집락이였으며생화학테스트결과 C. jejuni로확인되었으나, hipo 종특이유전자검출여부를통해최종적으로확인, 동정하였다 (Wang et al., 2002). 또한 C. jejuni의독성여부를확인하기위해세포를비정상적으로팽창시키는 CDT (cytolethal distending toxin) 의독소유전자인 cdtb의존재여부를 PCR로확인하였다. CDT 는 1988년경 Shigella, E. coli, C. jejuni에서처음으로확인되었다 (Johnson and Lior, 1988). 대부분의미생물에서 CDT는 cdta (30 kda), cdtb (29 kda), cdtc (21 kda) 로구성되며그중 cdtb 유전자는 C. jejuni와 C. coli 모두에서발견되었으나, CDT 활성은 C. jejuni에서만나타난다고하였다 (Dassanayake et al., 2005). 실험결과설사질환감시사업과식중독 outbreak에서분리한 42균주모두에서 C. jejuni에특이적인 hipo 유전자와독소유전자인 cdtb가 100% 검출되었다 (Fig. 2 and Table 5). Fig. 1. Prevalence of C. jejuni in stool sample from diarrhea patients by month. C. jejuni의 fluroquinolone 계항생제내성과연관된 gyra 유전자돌연변이검출및 gyra 유전자염기서열분석 C. jejuni의치료제로쓰이는 fluroquinolone계항생제인 ciprofloxacin 내성은 Ruiz 등 (1998) 에의하면스페인장염환자에서분리한 C. jejuni의경우 1990년 47.5% 에서 1994년 88% 로두배가까이증가하였고, 국내의경우 Park 등 (2007) 은 2005년환자검체에서분리한균주에서 37%, Kim 등 (2008) 에의하면 2007년환자에서분리한균주모두 (100%) 에서내성을보였다고보고하였다. 이러한 C. jejuni의 ciprofloxacin에대한높은내성율은 gyra 유전자변이때문이라고알려졌다 (Zirnstein et al., 1999). Fig. 2. Electrophoresis of PCR products for the hipo (A) and cdtb gene (B). Lanes: 1 to 10, C. jejuni; M, size marker; N, negative control. Fig. 3. Electrophoresis of PCR products for the mutated gyra gene (A) and wild-type gyra gene (B). Lanes: 1 to 10, C. jejuni; M, size marker.

5 232 Hur et al. 따라서 ciprofloxacin 내성과관련있는 gyra 유전자의돌연변이를 PCR로확인하였다. 그결과 42균주중 40균주 (95.2%) 에서 gyra 돌연변이유전자가검출되었다. 반면 positive gyra 유전자는 42균주모두에서정상적으로확인되었다 (Fig. 3 and Table 5). 또한 ciprofloxacin에내성을나타내는균주에서 C. jejuni의 QRDR (quinolone resistance determining region) 부위의아미 Table 5. Biochemical and genetic characteristics of C. jejuni from patients with diarrhea Number of isolation Outbreak cases hipo gene cdtb gene mutated gyra gene GyrA QRDR DNA sequence Nalidixic acid Susceptibility Ciprofloxacin 1 EnterNet ATA R R 2 " ATA R R 3 " ATA R R 4 " ATA R R 5 " ATA R R 6 " ATA R R 7 " ATA R R 8 " ATA R R 9 " ACA S S 10 " ATA R R 11 case ATA R R 12 " ATA R R 13 " ATA R R 14 " ATA R R 15 " ATA R R 16 " ATA R R 17 " ATA R R 18 " ATA R R 19 " ATA R R 20 " ATA R R 21 " ATA R R 22 " ATA R R 23 case ATA R R 24 " ATA R R 25 " ATA R R 26 " ATA R R 27 " ATA R R 28 " ATA R R 29 case ACA S S 30 " ATA R R 31 case ATA R R 32 " ATA R R 33 " ATA R R 34 " ATA R R 35 " ATA R R 36 " ATA R R 37 " ATA R R 38 " ATA R R 39 " ATA R R 40 " ATA R R 41 " ATA R R 42 " + + ATA R R

6 캠필로박터제주니균의항생제내성과유전적특성 233 Table 6. Serotype distribution of C. jejuni isolates from diarrhea patients Serotype (Penner s No) No. of strains (N=42) HS2 (B) 3 (7.1%) HS3 (C) 1 (2.4%) HS4 (D) complex (4/13/16/43/50) 5 (11.9%) HS19 (O) 6 (14.3%) Untypable 27 (64.3%) Total 42 (100%) 노산서열이트레오닌에서이소루신으로변이되어있다고보고한 (Zirnstein et al., 1999) 바 PCR 결과검출된 gyra 유전자의돌연변이여부를실제로확인하기위해염기서열을분석하였다. 그결과 fluoroquinolone계항생제인 ciprofloxacin 내성과관련있는 C. jejuni의 gyra QRDR 단백질의 86번아미노산코돈부위가 ACA ( 트레오닌 ) 에서 ATA ( 이소루신 ) 로변이되어있음을확인하였다 (Fig. 4). gyra 돌연변이 PCR 결과와마찬가지로설사질환감시사업분리균주 9번과수원시식중독 (case 3) 분리균주 29번만 wild type C. jejuni와염기서열이같았고, 나머지 40 균주 (95.2%) 에서돌연변이가확인되었다 (Fig. 4 and Table 5). 항균제감수성특성도내병원을대상으로하는급성설사질환실험실감시사업 Fig. 4. Comparison of C. jejuni gyra QRDR DNA sequences. Sequence WT is a portion of the gyra QRDR of C. jejuni UA580 (GenBank no. L04566). 과식중독 outbreak에서분리한 42균주의 C. jejuni에대해항균제내성정도를확인하였다. C. jejuni의치료제로쓰이는 nalidixic acid, ciprofloxacin, erythromycin, azithromycin 과그밖에 cephalothin, imipenem, chloramphenicol, tetracycline 등 8종류의항균제를사용하여디스크확산법으로실험하였다 (Table 4). Quinolone계항생제인 nalidixic acid와 fluoroquinolone계항생제인 ciprofloxacin의경우전체 42균주중 40균주 (95.2%) 가내성을보였다 (Table 4). 분리된 C. jejuni 대부분이이들항생제에높은내성율을보였고, 감수성을나타내는균주는설사질환감시사업분리균주 9번과수원시식중독 (case 3) 분리균주 29 번이었다 (Table 5). 이 2균주는 gyra 돌연변이유전자 PCR 결과돌연변이유전자가검출되지않았고, gyra DNA 염기서열분석결과정상유전자를가진균주와일치하였다 (Table 5). 따라서 C. jejuni의 gyra 유전자가 ACA ( 트레오닌 ) 에서 ATA ( 이소루신 ) 로돌연변이되면 nalidixic acid와 ciprofloxacin 항균제에내성을보임을알수있다. 이는다른그람음성균과는달리 nalidixic acid에내성인 C. jejuni 균주의경우 ciprofloxacin에교차내성을보이기때문이다 (Gootz and Martin, 1991). 그러나이외에 C. jejuni에치료제로쓰이는 macrolide계항균제인 erythromycin, azithromycin에는 41균주 (97.6%) 가감수성을보였다 (Table 4). 아직까지 erythromycin과 azithromycin이치료제로유효함을알수있었으나, 내성균주가 1균주발견되어 C. jejuni 감염치료시이들항균제에대한내성여부도확인이필요할것으로생각된다. 이는부산 (Park et al., 2007) 과전북지역 (Kim et al., 2008) 에서분리된 C. jejuni의경우 erythromycin 에대해모두감수성을나타낸것과는다른결과로질병관리본부에문의한결과우리나라에서분리된 C. jejuni에서드물게 erythromycin에내성을나타내는균주가발견된다 (not published data) 고하였다. 그밖에 cephalothin에는 100%, tetracycline에는 69% 가내성인반면 imipenem에는 97.6%, chloramphenicol에는 100% 감수성이었다 (Table 4). 이는우리나라전북지역과부산지역에서분리된 C. jeuni 항생제내성특징처럼 cephalothin과 tetracyclin (51.9% 93%) 에는높은내성을, imipenem과 chloram phenicol 에는높은감수성을보이는결과와비슷하다 (Park et al., 2007; Kim et al., 2008). 혈청형분포분리된 C. jejuni 균주의 heat-stable (HS) antigen을추출한다음 PHA법으로실험한결과 42균주중 15균주 (37.5%) 에서 4종의혈청형이확인되었으며그분포는 Table 6과같다. 확인된혈청형은 HS2(B), HS3(C), HS4(D), HS19(O) 형이며, 이중가장많이분포된혈청형은 HS19(O) 형으로 14.3% 였다. 그러나전체 42균주중 27균주 (64.3%) 에서는혈청형이확인되지않았는데, 혈청형실험에사용된 Campylobacter antisera (Denka Seiken) 이외에혈청형이존재할수있으며 PHA법의감도상문제일수도있어좀더많은연구가필요할것으로생각된다. 우리나라의경우 Park 등 (2007) 에의하면부산지역설사환자에서분리한 C. jejuni에서 HS1/44(A), HS2(B), HS4(D),

7 234 Hur et al. HS19(O), HS21(P) 형이분리된다고보고하였고, 40.7% 에서는혈청형을확인할수없다고보고하였다. 또한전라북도지역설사환자에서분리된균주의경우 HS4(D) 가가장많이분리되었고, 그다음은 HS2(B) 형이검출되었으며 47.5% 는혈청형을확인할수없다고보고하는등위의방법으로혈청형을확인할수없는경우가많았다 (Choi et al., 2008). Takahashi 등 (2005) 은일본의경우 Guillain-Barre syndrome 환자에서주로 HS19(O) 형이분리된다고보고하였다. C. jejuni의혈청형은분리지역에따라다양한종류가보고되고있으나, 본연구에서분리된균주의경우기존에우리나라에서보고되는혈청형분석결과와유사하였다. PFGE (pulsed-field gel electrophoresis) 에의한 C. jejuni 유전형분석전체분리된 42균주의 C. jejuni DNA를 SmaI 제한효소로처리한후 PFGE 실험법으로유전형을분석한결과 12개의 cluster 로분류되었다 (Fig. 5). 설사질환감시사업을통해분리된 10균주는전체 6개의 cluster로분류되어다양한유전형을가진균이발견되었다. 4개의식중독 outbreak에서분리된균주의유전형을살펴보면김포시식중독 (case 1) 에서분리된 12균주는 cluster 5로모두같은유전형이었고, 시흥시식중독 (case 2) 에서분리된 6균주는 cluster 1, 8, 12로 3가지다른유전형이확인되었다. 또한수원시식중독 (case 3) 은 2균주가각각다른유전형 (cluster 10, 11) 을가지고있었고, 광명시식중독 (case 4) 은 cluster 3, 9로 2가지유전형을가진균이확인되었다. 즉두가지이상의유전형을가진 C. jejuni에의해식중독이발생하였음을알수있다. Rep-PCR (repetitive extragenic palindromic polymerase chain reaction) 에의한 C. jejuni의유전형분석분리된 C. jejuni 42균주의유전형을 rep-pcr을통해확인해보았다. Rep-PCR은증폭된 product의 size와 density 둘다고려하므로 98% 이상유사도가있을때같은유전형을가진균으로판단하였는데, 그결과 11개의 cluster로분류되었다 (Fig. 6). 김포시식중독 (case 1) 의경우 PFGE 결과와마찬가지로분리된 12균주가모두동일한유전형 (cluster 10) 으로확인되었고, 광명시식중독 (case 4) 의경우도분리된 12균주가 cluster 7, 9의두가지의유전형으로확인되었다. 그에반해시흥시 (case 2) 와수원시 (case 3) 식중독의경우는 PFGE와는다르게각각 2가지 (cluster1, 4) 와 1가지 (cluster 1) 로확인되었다. 즉 rep-pcr을통한 C. jejuni의유전형분석은 PFGE와완전히일치하지않았으며차이점이있음이기존의보고처럼확인되었다 (Wilson et al., 2009). 그러나 rep-pcr 역시분리된균주의유전형을확인하고이들의유전적연관성을살펴보는데유용하며, scatterplot 형태를통해서도연관성을한눈에확인할수있는장점이있다. Fig. 5. UPGMA dendrogram of SmaI PFGE patterns from 42 C. jejuni isolates from diarrhea patients.

8 캠필로박터제주니균의항생제내성과유전적특성 235 Fig. 6. Rep-PCR result of 42 C. jejuni isolates from diarrhea patients. 적요 참고문헌 Campylobacter jejuni는사람에서매우중요한식중독원인균의하나이며, 2010년경기도내병원을내원한설사환자와 4번의식중독 outbreak에서 42균주를분리하였다. 본연구에서는분리된 C. jejuni 42균주의유전적특성과혈청형, 항균제내성율을분석하였다. hipo 종특이유전자 (100%), cdtb 독소유전자 (100%) 가검출되었고, gyra 돌연변이유전자 (95.2%) 가 PCR 실험결과검출되었다. gyra 돌연변이유전자는 ciprofloxacin 내성과연관이깊으며, 디스크확산법에의해실험한결과 gyra 돌연변이유전자가검출된 40균주 (95.2%) 에서실제 ciprofloxacin 에대해내성을보였다. 분리된 42균주 C. jejuni에대한 gyra 유전자의염기서열을분석한결과 ciprofloxacin에내성을가진 40 균주에서아미노산서열이 ACA ( 트레오닌 ) 에서 ATA ( 이소루신 ) 으로돌연변이되어있음을확인하였다. 하지만대체치료제인 erythromycin과 azithromycin에대해서는 97.6% (41균주) 감수성을보였다. 또한 C. jejuni의혈청형을분석한결과 4가지타입으로분류되었는데, HS2(B), HS3(C), HS4(D), HS19(O) 로확인되었다. 도내에서분리한 C. jejuni 42균주의유전형을 rep-pcr 과 PFGE로확인한결과 PFGE에의해서는 12 cluster, rep-pcr 에의해서는 11 cluster의유전형으로구분되었다. Aarestrup, F.M. and Wegener, H.C The effects of antibiotic usage in food animals on the development of antimicrobial resistance of importance for humans in Campylobacter and Escherichia coli. Microbes Infect. 1, Altekruse, S.F., Stern, N.J., Fields, P.I., and Swerdlow, D.L Campylobacter jejuni-an emerging foodborne pathogen. Emerg. Infect. Dis. 5, Charvalos, E., Peteinaki, E., Spyridaki, I., Manetas, S., and Tselentis, Y Detection of ciprofloxacin resistance mutations in Campylobacter jejuni gyra by nonradioisotopic single-strand conformation polymorphism and direct DNA sequencing. J. Clin. Lab. Anal. 10, Choi, K.M., Lee, J.H., Park, Y.K., Kim, N.R., Soo, H.A., Jang, Y.M., Kim, C.H., Na, S.E., Lim, S.C., and Park, M.Y Genomic characterization and antibiotic resistance of Campylobacter jejuni isolated from poultry, bovine and human in Jeonbuk province. The report of Jeollabukdo institute of Health & Environment Research, Dassanayake, R.P., Zhou, Y., Hinkley, S., Stryker, C.J., Plauche, G., Borda, J.T., Sestak, K., and Duhamel, G.E Characterization of cytolethal distending toxin of Campylobacter species isolated from captive macaque monkeys. J. Clin. Microbiol. 43, Endtz, H.P., Ruijs, G.J., van Klingeren, B., Jansen, W.H., van der Reyden,

9 236 Hur et al. T., and Mouton, R.P Quinolone resistance in Campylobacter isolated from man and poultry following the introduction of fluoroquinolones in veterinary medicine. J. Antimicrob. Chemother. 27, Gaunt, P.N. and Piddock, L.J Ciprofloxacin resistant Campylobacter spp. in humans: an epidemiological and laboratory study. J. Antimicrob. Chemother. 37, Gootz, T.D. and Martin, B.A Characterization of high-level quinolone resistance in Campylobacter jejuni. Antimicrob. Agents Chemother. 35, Johnson, W.M. and Lior, H A new heat-labile cytolethal distending toxin (CLDT) produced by Campylobacter spp. Microb. Pathog. 4, Kim, J.M., Hong, J., Bae, W., Koo, H.C., Kim, S.H., and Park, Y.H Prevalence, antibiograms, and transferable tet(o) plasmid of Campylobacter jejuni and Campylobacter coli isolated from raw chicken, pork, and human clinical cases in Korea. J. Food Prot. 73, Kim, S.M., Kim, E.C., Choi, M.R., So, H.A., Shim, E.S., Kim, E.S., Park, S.C., Seong, C.N., and Chong, Y Cytolethal distending toxin production, genotypes and antimicrobial susceptibility of Campylobacter jejuni isolates from diarrhea patients and chickens. J. Bacteriol. Virol. 38, Lee, J.K., Kim, K.Y., Koo, M.S., Yong, D.E., and Kim, E.C Detection of Campylobacter jejuni by multiplex PCR and patterns of pulsed-field gel electrophoresis. Kor. J. Clin. Microbiol. 5, Lindmark, B., Rompikuntal, P.K., Vaitkevicius, K., Song, T., Mizunoe, Y., Uhlin, B.E., Guerry, P., and Wai, S.N Outer membrane vesicle-mediated release of cytolethal distending toxin (CDT) from Campylobacter jejuni. BMC Microbiol. 9, 220. Park, E.H., Kim, J.A., Choi, S.H., Bin, J.H., Cheigh, H.S., Suk, D.H., Lee, S.C., and Kim, Y.H Isolation and antimicrobial susceptibility of Campylobacter Jejuni from diarrhea patients. J. Life Sci. 17, Piddock, L.J Quinolone resistance and Campylobacter spp. J. Antimicrob. Chemother. 36, Purdy, D., Buswell, C.M., Hodgson, A.E., McAlpine, K., Henderson, I., and Leach, S.A Characterisation of cytolethal distending toxin (CDT) mutants of Campylobacter jejuni. J. Med. Microbiol. 49, Ruiz, J., Goni, P., Marco, F., Gallardo, F., Mirelis, B., Jimenez De Anta, T., and Vila, J Increased resistance to quinolones Campylobacter jejuni: a genetic analysis of gyra gene mutations in quinolone-resistant clinical isolates. Microbiol. Immunol. 42, Snchez, R., Fernndez-Baca, V., Daz, M.D., Muoz, P., Rodrguez-Crixems, M., and Bouza, E Evolution of susceptibilities of Campylobacter spp. to quinolones and macrolides. Antimicrob. Agents Chemother. 38, Takahashi, M., Koga, M., Yokoyama, K., and Yuki, N Epidemiology of Campylobacter jejuni isolated from patients with Guillain-Barre and Fisher syndromes in Japan. J. Clin. Microbiol. 43, Talukder, K.A., Aslam, M., Islam, Z., Azmi, I.J., Dutta, D.K., Hossain, S., Nur, E.K.A., Nair, G.B., Cravioto, A., and Sack, D.A Prevalence of virulence genes and cytolethal distending toxin production in Campylobacter jejuni isolates from diarrheal patients in Bangladesh. J. Clin. Microbiol. 46, Vanhoof, R., Vanderlinden, M.P., Dierickx, R., Lauwers, S., Yourassowsky, E., and Butzler, J.P Susceptibility of Campylobacter fetus subsp. jejuni to twenty nine antimicrobial agents. Antimicrob. Agents Chemother. 14, Walder, M Susceptibility of Campylobacter fetus subsp. jejuni to twenty antimicrobiol agents. Antimicrob. Agents Chemother. 16, Wang, G., Clark, C.G., Taylor, T.M., Pucknell, C., Barton, C., Price, L., Woodward, D.L., and Rodgers, F.G Colony multiplex PCR assay for identification and differentiation of Campylobacter jejuni, Campylobacter coli, Campylobacter lari, Campylobacter upsaliensis, and Campylobacter fetus subsp. fetus. J. Clin. Microbiol. 40, Wilson, M.K., Lane, A.B., Law, B.F., Miller, W.G., Joens, L.A., Konkel, M.E., and White, B.A Analysis of the pan genome of Campylobacter jejuni isolates recovered from poultry by pulsed-field gel electrophoresis, multilocus sequence typing (MLST), and repetitive sequence polymerase chain reaction (rep-pcr) reveals different discriminatory capabilities. Microb. Ecol. 58, Zaman, R Campylobacter enteritis in Saudi Arabia. Epidemiol. Infect. 108, Zhao, C., Ge, B., De Villena, J., Sudler, R., Yeh, E., Zhao, S., White, D.G., Wagner, D., and Meng, J Prevalence of Campylobacter spp., Escherichia coli, and Salmonella serovars in retail chicken, turkey, pork, and beef from the Greater Washington, D.C., area. Appl. Environ. Microbiol. 67, Zirnstein, G., Li, Y., Swaminathan, B., and Angulo, F Ciprofloxacin resistance in Campylobacter jejuni isolates: detection of gyra resistance mutations by mismatch amplification mutation assay PCR and DNA sequence analysis. J. Clin. Microbiol. 37,