Microsoft Word - 27-김윤태.doc

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자현 조
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1 J. Exp. Biomed. Sci. 10 (2004) TopoisomeraseII and Topoisomerase IV Gene Mutations Fluoroquinolone Resistance of Pseudomonas aeruginosa Yuntae Kim and Heongseok Baik 1 Department of Laboratory Medicine, Maryknoll Hospital, Pusan , Korea 1 Department of Microbiology, Pusan National University, Pusan , Korea Abstract: The Pseudomonas aeruginosa isolated from the clinical specimens has a mutation on the QRDR (quinolone resistance determining region). There were obvious mutations in both gyra and parc gene which are major targets of quinolone. Simultaneous mutations were found two sites or more on these genes in all of ten strains. GyrB or pare gene had only silent mutation without converted amino acids. We confirmed that P. aeruginosa from clinical specimens exhibited decreased sensitivity to fluroquiolone due to changed Thr-83 lle and Asp-87 Asn types on gyra and altered Ser-87 Leu type on parc. This is the first finding that a new Met-93 Thr type on parc as well as mutations on gyrb or pare genes differed from existing patterns. This study showed more mutations of gyra rather than parc, suggesting that change of Type IV topoisomerase is more serious than that of type II (DNA gyrase). Key Words: QRDR (quinolone resistance determining region), Topoisomerase IV, DNA gyrase 서 항균제의치료가별로효과가없던시절에는암, 당뇨병, 관절염, 심혈관계질병및정신질환등이차지하는비율이높았었다. 하지만요즈음에는세균에의한감염증이많이만연되어있으며특히, 만성병을앓고있는환자뿐만아니라장기이식, 암, 에이즈등면역성이약해진환자에게서더많은문제를일으키고있다. 세균의감염증은적절한항균제의치료로질병을치유할수있다. 하지만많은항생제의종류만큼이나많은세균들도항균제내성을획득하여항균제치료의역할을못하게하고있다. 따라서제약회사나의약화학자들은항생제의개발에노력하고있으며, 기존의약을개량하거나새로운부류의약을개발하고있다. 현재꾸준히연구되며광범위하게사용되고있는 quinolone 계항생제도그중하나이다. 많은 fluoroquinolone계항생제가최근호흡기계감염, 비뇨기계감염, 외상감염, 골관절염, 생식기감염등의많은감염성질환의치료에임상적으로우수한효과를나타내며, 또한호중구감소환자의균혈증을예방하는데도사용되고있다 (Cambau et al., 1995). * 논문접수 : 2004년 10월 4일수정재접수 : 2004년 11월 15일 교신저자 : 김윤태, ( 우 ) 부산광역시중구대치동 4가 12번지, 메리놀병원진단검사의학과미생물 Tel: , Fax: man171@hanmail.net 론 Quinolone 계항생제는세균성질병의치료에매우효과적이며, 항균력이강력하고스펙트럼이넓은항균제로서반합성적으로만들어지는 penicillin이나 cephalosporin 항생제와는달리전합성에의해서제조되며경구투여가가능하다는중요특징을가지고있다. 또한 quinolone의항균작용은현재사용중인다른항생제와는작용메커니즘이전혀다르며, plasimid에의한내성전달작용이이루어지지않으므로내성균이흔하지않았다 (Fukuda et al., 1995). 오늘날전통적인항생제인 penicillin과 cephalosporin, β-lactam계 Aminoglycoside, tetracycline에내성이있는균에도일반적으로약효가있다. 이러한장점에도불구하고 quinolone계항생제도역시이약제에내성을가진균주가발생하는등의문제점을가지고있으며, 위장관장애나간기능손상등의부작용도나타낸다. 이러한문제점들을극복하고자계속적으로특허나전문저널을통하여새로운 quinolone계유도체가소개되고있으며, 국내외적으로많은연구가진행중에있다 (Hallett et al., 1991). Quinolone 항균제는말라리아치료제인 nalidixic acid가요로감염증치료에사용된이후로 ciprofloxacin과 levofloxacin, ofloxacin, norfloxacin, perfloxacin, sparfloxacin, trovafloxacin 등이널리임상에서사용되고있다. Nalidixic acid는항균특이성이좁고, 경구투여시혈장단백질과친화도가높고, 몸에서쉽게배출되어몸안의농도가낮게되며, 또한내성균주의발생이빈번하게나타나는등여러가지단점들을가지고있다 (Gallert et al., 1977). 1970년이후제2세대 quinolone 항생제가개발되었으나, 제

2 1세대 quinolone 항균제에비해별로나은점이없었다. 제3 세대 quinolone 항균제는 flumequin-fluorinated quinolone으로부터개발되었으며, 여기에는 norfloxacin, enoxacin, ciprofloxacin 등이있다. 이것들도 β-lactam 계열의항균제에비하면발생빈도는적으나저항균이발생하고있다. Quinolone 항균제의 target site는 DNA의 supercoil 상태를유지하면서 DNA복제중생기는 DNA 가닥을끊어주거나다시봉합하는 topoisomeraseii (DNA gyrase) 로알려져있다 (Gellert et al., 1976). 이효소는 gyra gene에서만드는 subunit A (100 kda) 와 gyrb gene에서만드는 B subunit (90 kda) 구성되어있다 (Sugino et al., 1980; Gellert, 1981). DNA가복제되기위해서는수소결합을통하여붙어있는두개의 strand가분리되어야하며이때 strand를끊어주고다시결합시키는과정은 subunit A가하며, 이에필요한에너지를제공하는 ATPase 의기능을 sub B가담당한다 (Mizuuchi et al., 1978; Gellert et al., 1979; Sugino et al., 1980; Maxwell and Gellert, 1984). Quinolone 은 gyrase subunit A에작용하여 DNA복제를방해하는기작을일으킨다. Quinolone에대한균의내성화는다른항생제에비하여심각하지않으나입원환자들에게서보이는감염균으로요도감염의 Enterobacteriaceae, 기도감염의 Streptococcus pneumoniae, Staphylococcus aureus, Klebsiella pneumoniae 등에내성이나타나고있다. 특히 Pseudomonas aeruginosa 와 MRSA (Methcillin resistant Staphylococcus aureus) 등의균들에있어서내성의문제가심각해지고있다. 현재까지알려져있는내성기전으로는 DNA gyrase의돌연변이로 Quinolone과의친화력이감소되거나 (Cullen et al., 1989; Cambau et al., 1993), 그람음성균의경우세포외막의투과력을떨어뜨려 quinolone이균의내부에들어오는것을막거나, efflux pump를가동시켜일단유입된 quinolone을균바깥으로내보내는기작들이발견되어있다 (Cohen et al., 1989; Cohen et al., 1998; Sreedharan et al., 1990; Yoshida et al., 1990). 이러한내성균을치료할수있는새로운항생제를개발하기위해서는무엇보다내성에대한기작을밝히는것이중요하다. 이에본연구는 2003년 1년동안부산시내 종합병원에입원한환자의검체에서검출한 Pseudomonas aeruginosa 384균주중에서거의모든항생제에내성을보이는다제약제내성균주 10균주를선택하여 Quinolone계항생제의내성양상에대해서연구하였다. 또한 Pseudomonas aeruginosa의 Quinolone내성에대한메커니즘중에서 DNA gyrase와 topoisomerase IV 상의 QRDR (quinolone resistant deternining region) 내에서의변화를확인하였다. 재료및방법 1. 사용균주본실험에사용된균주는 2003년 1년동안부산소재종합병원인메리놀병원에입원한환자의검체에서검출한 Pseudomonas aeruginosa 384균주중에서뇌경색등의질환으로장기입원중인 10명의환자의가검물로부터분리된 10 균주의다약제내성 Pseudomonas aeruginosa를이용하였다. 2. 균주의동정과항생제감수성검사균주의동정은 Vitek system (biomerieux, Inc., MO, USA) 의 GNI card를, 최소억제농도 (minimum inhibitory concentration; MIC) 는 Vitek system의 GNS434 card를사용하였다. 3. 사용시약및기기 PCR에사용한 PCR premix는 Accupower PCR PreMix (Bioneer, Korea) 를사용하여 Gene Amp PCR 2400 (PERKIN ELMER) 로증폭하였다. PCR product의정제는 QIAquick Gel Extraction Kit (QIAGEN, Germany) 를사용하였으며 DNA sequencing은 Big Dye terminator II 와 Template Suppression Reagent (Applied Biosystems, USA) 를사용하여 DNA auto sequencer (ABI PRISM 310 model: Applied Biosystems, USA) 를이용하여 sequencing하였다. 4. Genomic DNA의분리 P. aeruginosa의 single colony를 LB broth 4 ml에접종하여 Table 1. Nucleotide sequences of the oligonucleotides used in this study Name Nucleotide sequence Characteristics and usage PaGyrA-F 5'-AGTCCTATCTCGACTACGCGAT-3' Forward primer for gyra QRDR PaGyrA-R 5'-AGTCGACGGTTTCCTTTTCCAG-3' Reverse primer for gyra QRDR PaGyrB-F 5'-GCGGTGGACAGGAGATGGGCAAGTAC-3' Forward primer for gyrb QRDR PaGyrB-R 5'-CTGGCGGAAGAAGAAGGTCAACAGCAGGGT-3' Reverse primer for gyrb QRDR PaParC-F 5'-GAGTTCACCGAGCAGGCCTA-3' Forward primer for parc QRDR PaParC-R 5'-GCCTCGGTATAACGCATGGC-3' Reverse primer for parc QRDR PaParD-F 5'-CGGCGTTCGTCTCGGGCGTGGTGAAGGA-3' Forward primer for pare QRDR PaParD-R 5'-TCGAGGGCGTAGTAGATGTCCTTGCCGA-3' Reverse primer for pare QRDR

3 37 에서 18시간동안배양시켜서 1.5 ml tube로옮긴후원심분리 (4, 15,000 rpm, 2분 ) 하였다. Pellet에 TE buffer (100 mm Tris-HCl; ph 8.0, 10 mm EDTA) 500 µl에재현탁시킨후 10% (w/v) SDS를최종농도가 0.5% 가되도록 25 µl첨가하고 inverting하여 65 에서 10분간반응시키고 RNase (20 mg/ml) 를 1 µl 넣고 37 에서 1시간동안 incubation시켰다. Protein을제거하기위해동일부피의 phenol을첨가하여 vortexing한후원심분리 (4, 15,000 rpm, 2분 ) 하였다. 상등액을새 tube에옮기고동일부피의 phenol/chloroform/ isoamyl alcohol (25:24:1, v/v) 을넣고 vortex 후원심분리 (4, 15,000, 2분 ) 하였다. 이과정은두번정도반복하였다. 깨끗해진상등액을새로운 e-tube로옮겨두배부피의 icecold ethanol 과 5 M NaCl 16 µl를넣고 -70 에서 15분이상방치한후원심분리 (4, 15,000 rpm, 20분 ) 하였다. 70% (v/v) ethanol로 washing 해서 15,000 rpm, 4, 5분간원심분리한후 pellet을건조시켜 TE buffer 40 µl에현탁하여 -20 에보관하였다. 5. Primer 제작및 polymerase chain reaction P. aeruginosa의 genomic DNA상의 gyra, gyrb, parc, pare gene의 QRDR (quinolone resistance determining region) 로알려진부위로부터염기서열을고안하였다. gyra는 (Gene Bank accession number L29417) forward와 reverse primer를각각 nucleotide (nt) 320~341, 676~697에서 design하였고 gyrb는 Gene Bank accession number AB005881) nt 2582~2609, 3063~3092에서 parc는 (Gene Bank accession number AB003428) nt 206~215, 521~540에서 pare는 (Gene Bank accession number AB003429) nt 1223~1250, 1787~1814에서 design 하였다. 각 oligonucleotide들의염기서열은 Table 1에나타내었다. PCR premix [Taq DNA polymerase 1 U, dntp는각각 0.25 mm, Tris-HCl (ph 9.0) 10 mm, MgCl mm, AccuPower PCR PreMix, Bioneer] 를사 용하여 target gene을증폭하였다. 10 pm의농도로희석한 primer를각 1 µl씩첨가하고 genomic DNA를 1,000배희석해서 1 µl 넣은다음, 멸균증류수를 17 µl 첨가하여최종부피가 20 µl가되도록하였다. PCR은 thermal cycler (Gene Amp PCR System 2400, perkin Elmer) 를사용하여수행하였다. 조건은 P. aeruginosa gyra gene은 94 에서 3분간 predenaturation 시킨후 denaturation 94 30초, annealing 55 30초, extention 72 1분을 30 cycle을수행한후 72 에서 7분간 final incubation 하였다. gyrb, parc, pare gene은 annealing 온도만 58 로달리하였다. 6. Agarose gel electrophoresis 및 DNA purification 증폭된각 PCR product들은 0.8% (w/v) agarose gel 상에서확인하였다. Gel은 1 Tris-acetate buffe (TAE; 40 mm Trisacetate and 1mM EDTA; ph 8.0) 에 0.8 g의 agarose를첨가하여만들고, 여기에 PCR product를 loading 하여전기영동하였다. Loading이끝난후 gel을 0.5 µg/ml 의 ethidium bromide 용액에담가염색한다음 UV transilluminator (302 nm, Hoefer scientific instrument) 에서확인하고 Polaroid type 667 film으로촬영하였다. DNA는 QIAquick gel extraction kit (QIAGEN) 를사용하여제조사의사용법에따라분리하였다. 먼저, gel에서원하는크기의 band를잘라 1.5 ml e-tube에넣고 gel 무게의 3배부피에해당하는 QG buffer를첨가하여 50 에서 10분간방치하였다. gel조각이완전히녹은후에 column으로옮겨 15,000 rpm에서 1분간원심분리하여 column을통과한하층액을버리고다시 QG buffer 500 µl를첨가하여같은방법으로원심분리한후하층액을버렸다. Washing 단계로 PE buffer 750 µl를첨가하여 1분간원심분리후하층액을버리고 PE buffer를완전히제거하기위하여다시 1분간원심분리하였다. Column을새로운 e-tube로옮긴후멸균증류수 20 µl를넣고마지막으로원심분리한뒤, -20 에서사용할 Table 2. MIC of P. aeruginosa used in this study No. of strains MIC (µg/ml) Ciprofloxacine Ofloxacin Moxifloxacin Gatifloxacin P. aeruginosa wild type <0.125 <0.125 <0.125 <0.125 PA > PA PA > PA PA PA PA > PA > PA PA

4 때까지보관하였다. 7. DNA sequencing DNA sequencing은 DNA auto sequencer (ABI PRISM 310; Applied Biosystems) 를사용하여 Big Dye-terminator 기법의방법에따라서실시하였다. PCR tube에 template DNA 4 µl와 forward 또는 reverse primer를 2 µl, Big Dye 4 µl, 멸균증류수 10 µl를넣어 total volume 20 µl로맞춘후 sequencing PCR을실시하였다. PCR 조건은 gyra fragment는 96 에서 5분간 predenaturation, 25 cycles (denaturation 96, 10초 ; annealing 53, 5초 ; extension 60, 4분 ), 60 에서 5분간 final incubation 하였다. gyrb, parc, pare 는각각 annealing 온도만 55 로달리하였다. PCR product에각각 ethanol 50 µl와 3 M sodium acetate (ph 4.6) 2 µl를첨가하여 -70 에서 1시간동안 ethanol 침전시킨후 15,000 rpm, 4 에서 25분간원심분리하여 pellet을말리고 TSR (template suppression reagent) 25 µl에 pellet을녹여 94 에서 4분간 incubation시킨후바로 ice에꽂아반응을정지시킨다음 DNA auto sequencer로분석하였다. Computer 분석은 310 Genetic Analyzer를통하여분석하여 P. aeruginosa PAO1의 gyra, gyrb, parc, pare sequence와비교하여 mutation을확인하였다. 결과 1. 항생제최소억제농도 (MIC) 시험 Vitek system의 GNS434 card를사용하여항생제최소억제농도 (minimum inhibitory concentration; MIC) 시험을실시한결과는 Table 2과같다. 2. Pseudomonas aeruginosa의 gyra, gyrb, parc, pare QRDR 에서의 mutation 확인 1) gyra, gyrb, parc, pare gene의 PCR결과 P. aeruginosa의 4개의 gene을 Table 1과같이 4 쌍의 primer 를사용하여 PCR방법으로얻었다. PaGyrA, PaGyrB, PaparC, PaparE primer를이용하여임상검체에서분리된 10균주의 P. aeruginosa에서분리한 DNA를주형 DNA로하여증폭한결과 gyra 378 bp, gyrb 512 bp, parc 304 bp, pare 592 bp 크기의 DNA단편들을얻을수있었다. Fig. 1과 Fig. 2는 PCR 결과이다. 2) 10균주의 gyra, gyrb, parc, pare QRDR 에서아미노산변화 gyra mutations: 10개 sample 모두에서 gyra의 QRDR에서아미노산치환이발견되었다. 83번 codon인 threonine (AAC) 이 isoleucine (ATC) 으로바뀌거나 87번 codon인 aspartate (GAC) 가 asparagine으로치환되었다. 이중에서 6개의 isolate 에서 double point mutation이일어났다 (Table 3). gyrb mutations: 일반적으로 mutation이가장잘일어나는 464번 codon인 serine (TCC) 에서는 mutation이발견되지않았으며 10균주모두에서 gyrb 상의아미노산의 mutation은발견되지않았다. 그러나 378번 codon인 alanine (GCG GCA), 409번 codon인 lysine (AAA AAG), 484번 codon인 glutamate (GAA GAG) 중 2~3가지의 silent mutations을가진균주들이발견되었다. 하지만 PA6번균주에서는아무런변화도관찰되지않았다. parc mutations: 10개의균주모두 87번 codon과 93번 codon에서각각 mutation이발견되었다. 87번 leucine (TCG) 이 Table 3. Amino acid changes resulting from mutations in gyra, parc and silent mutations in gyrb, pare Replacement in QRDR No. of gyra at position gyrb at position* a parc at position pare at position* strains b 83 (The-ACC) 87 (Asp-GAC) 87 (Leu-TCG) 93 (Met-ATG) PA1 Ile (ATC) - Ser (TTG) Thr (ACG) PA2 Ile (ATC) - Ser (TTG) Thr (ACG) PA3 Ile (ATC) Asn (AAC) Ser (TTG) Thr (ACG) PA4 Ile (ATC) Alanine (GCG GCA) Ser (TTG) Thr (ACG) 409 Lysine (AAA AAG) PA5 Ile (ATC) Glutamate (GAA GAG) Ser (TTG) Thr (ACG) PA6 Ile (ATC) - except PA6 strain. Ser (TTG) Thr (ACG) PA7 Ile (ATC) Asn (AAC) Ser (TTG) Thr (ACG) PA8 Ile (ATC) Asn (AAC) Ser (TTG) Thr (ACG) PA9 Ile (ATC) Asn (AAC) Ser (TTG) Thr (ACG) PA10 Ile (ATC) Asn (AAC) Ser (TTG) Thr (ACG) * a : 2 or 3 slient mutation seen in Each strains. * b : 5 or 6 slient mutation seen in Each strains Glutamate (GAA-GAG) 366 Glutamate (CAA-CAG) 367 Leucine (CTG-TTG) 374 Asparagines (AAC-AAT) 448 Glutamate (GAA-GAG) 472 Glycine (GGT-GGC) 474 Serine (AGT-AGC) 477 Alanine (GCC-GCT) 484 Isoleucine (ATC-ATT)

5 M M M M 500 bp <gyra> <gyrb> Fig. 1. Agarose gel electrophoresis of the PCR products (512 bp) amplified using PaGyrB-F and PaGyrB-R primers. M; 100 bp ladder maker. Lane 1~10; PCR products from P. aeruginosa (PA1-PA10). M M 10 M M 500 bp 400 bp 300 bp <parc> <pare> Fig. 2. Agarose gel electrophoresis of the PCR products amplified using PaParC (304 bp) and PaParE (592 bp) primers. M; 100 bp ladder maker. Lane 1~10; PCR products from P. aeruginosa (PA1-PA10). serine (TTG)으로, 93번 methinone (ATG)이 threonine (ACG)으 도 비교적 약하며 이를 협범위, 제1세대, 또는 group I qui- 로 아미노산들이 치환되었다. nolone이라 한다. 1980~1990년대에 사용되기 시작한 cipro- pare mutations: pare도 gyrb와 마찬가지로 아미노산의 변 floxacin, enoxacin, ofloxacin, pefloxacin, fleroxacin, sparfloxacin, 화는 없었고, 362번 glutamate (GAA GAG), 366번 gluta- levofloxacin은 항균범위가 P. aeruginosa 등에 까지 넓어지고 mine (CAA CAG), 367번 leucine (CTG TTG), 374번 aspa- 항균력이 강해졌으며, 이들을 광범위 또는 group II quinolone ragine (AAC AAT), 448번 glutamate (GAA GAG), 472번 이라고 한다. 1990년대에 들어서 개발된 그람양성 세균 또 glycine (GGT GGC), 474번 serine (AGT AGC), 477번 ala- 는 혐기성 세균에 대한 항균력을 높인 moxifloxacin, gatiflo- nine (GCC GCT), 484번 isoleucine (ATC ATT) 중 5~6가지 xacin, gemifloxacijn, sitafloxacin은 group III (제4세대라고도 함), 이상의 silent mutation들을 포함하였다. 또는 호흡기 감염 치료용 quinolone이라고 한다. 근래 개발 된 fluoroquinolone의 대부분은 그람양성 세균에 대한 항균 고 찰 력을 높이기 위한 것이었다. 최근 fluoroquinolone 내성균이 증가되고 있는데 fluoroquinolone 제에 따라서는 교차내성 Fluoroquinolone제는 그람음성과 양성 세균 감염치료에 널리 사용되고 있으며, 폐렴구균 등 그람양성구균에 대한 정도가 다른 것이 있고, 내성균의 출현과 확산을 막기 위한 연구들이 늘고 있다. 항균력이 강화된 새로운 제제들이 사용되기 시작하였거나 Quinolone약제의 작용표적은 세균의 type II topoisomerase 연구되고 있다. 초기의 약제인 nalidixic acid, pipemidic acid, 즉, DNAgyrase (topoisomeraseii)와 topoisomerase IV이다. DNA- oxolinic acid 및 flumequine은 그람음성 세균에 대한 항균력 gyrase와 topoisomerase IV는 DNA를 negative 초라선화 함으

6 로서 DNA 복제를가능케하는효소인데, quinolone은이작용을방해하여세균의증식을억제한다. 따라서세균이 quinolone의작용표적인 DNAgyrase (topoisomeraseii) 와 topoisomerase IV의 gene mutation을일으킴으로서곧 quinolone약제의내성이야기된다. 본연구에서는 target gene QRDR의 mutation에의한내성기전의연구를실행하였다. Gyrase A subunit의아미노산변화는촉매작용부위인 Tyr 122 근처의보존서열에서일어남이여러세균에서관찰되었다. 변화는 Ala67과 Gln106사이의한정된영역에서일어나며, 이영역을 quinolone 내성결정영역 (QRDR) 이라고한다. 아미노산의변화중에서는 Ser83이가장흔한데, 이잔기가소수성이고부피가큰아미노산으로바뀌면고도의 quinolone내성을나타낸다. 대부분의균종에있어서감수성균주의 GyrA83 위치는 serine이다. 그러나 P. aeruginosa에서는 serine 대신에 threonine이있다. P. aeruginosa 가 E. coli 보다원래부터 quinolone에대한감수성이낮은것은이차이때문으로해석된다. 본연구에서도 10균주모두 gyra의변화는 83번 threonine이 isoleucine으로아미노산의변이가나타났다. 또한몇균주는 87번 Aspartic acid가 Asparagine으로변이를나타냈다. 이러한 gyra의변화는기존의다른연구결과와일치한다 (Takaaki et al., 2001). parc gene의 mutation은고도내성의원인이된다고보고되었다 (Takaaki et al., 2001). 본연구에사용된모든균주의 MIC 값이기존에보고된다른연구들에비해현저히높은것은 parc gene의 point mutation에기인한것으로사료된다. 10균주모두가 parc에서의 Ser-87 Leu 변화역시기존의변화와일치함을나타내었다. 하지만지금까지문헌상에는없었던 parc의 Met- 93 Thr type이 10균주모두에서나타난것은새로이밝혀진것으로생각된다. 그리고, gyrb와 pare상의 mutation들도지금까지의형태와는다른양상을보였다. 아미노산의변화는없이 salient mutation 이다양하게여러균주에서나타났다. 본연구에서는 quinolone의주된표적인 gyra 보다 parc 에서의 mutation이더많은것으로나타나 Type II보다 Type IV topoisomerase의변화가더많이나타남을보여주었다. Fluorquinolone의내성기전에는 target gene (QRDR) 의 mutation외에 porin 소실에의한막투과성의감소그리고 efflux pump에의한항생제의유출등이있다. 본연구에서는 target gene의 mutation에관한연구만시행되었다. 본연구에사용된균주들의 quinolone 고도내성의포괄적인기전을밝히기위해서는차후, porin 소실과 efflux pump에대한내성기전의연구가수행되어야할것으로생각된다. 본연구는 Sequencing 을통하여임상검체에서분리된 Pseudomonas aeruginosa의 QRDR에 mutation이존재함을알수있었다. 기대했던바와같이 quinolone의주표적인 gyra, parc gene에서의 mutation이두드러졌으며 10균주모두이들유전자의두군 데이상에서동시에 mutation이일어났음을확인하였다. gyrb 나 pare gene에서는 silent mutation만관찰되었을뿐아미노산의치환은관찰되지않았다. 통상적으로임상에서분리된 P. aeruginosa의 fluroquiolone에대한감수성저하는 gyra상의 Thr-83 Ile 변화 type, Asp-87 Asn 변화 type과 parc에서의 Ser-87 Leu 변화 type이원칙적변화인것으로알려져있는데본연구에서도그러함이증명되었다. 뿐만아니라지금까지문헌상에는없었던 parc의 Met-93 Thr type이새로이밝혀졌다. 그리고, gyrb와 pare상의 mu- tation 들도지금까지의형태와는다른양상을보였다. 본연구에서는 quinolone의주된표적인 gyra보다 parc에서의 mutation이더많은것으로나타나 Type II보다 Type IV topoisomerase의변화가더심각한것으로여겨진다. REFERENCES Akasaka T, Tanaka M, Yamaguchi A, Sato K. Type II topoisomerase mutations in fluoroquinolone-resistant clinical str- ains of Pseudomonas aeruginosa Isolated in 1998 and 1999: Role of target enzyme in mechanism of fluoroquinolone resistance. Antimicob Agents Chemother : Akasaka T, Onodera Y, Tnaka M, Sato K. Cloning, expression, and enzymatic characterization of Pseudomonas aeruginosa topoisomerase IV. Antimicob Agents Chemother : Cambau E, Bordon F, Collatz E, Gutmann L. Novel gyra point mutation in a strain of E. coli resistant to fluoroquinolones but not to nalidixic acid. Antimicob Agents Chemother : Cambau E, Perani E, Dib C, Petinon C, Trias J, Jarlier V. Role of mutations in DNA gyrase genes in ciprofloxacin resistance of Pseudomonas aeruginosa susceptible or resistant to imipenem. Antimicob Agents Chemother : Chamberland S, Bayer AS, Schollaardt T, Wong SA, Bryan LE. Characterization of mechanisms of quinolone resistance in Pseudomonas aeruginosa strains isolated in vitro and in vivo during experimental endocarditis. Antimicob Agents Chemother : Cohen SP, McMurry LM, Hooper DC, Wolfson JS, Levy SB. Cross-resistance to fluoroquinolones in multiple antibioticresistant (Mar) Escherichia coli selected by tetracycline or chloramphenicol: Decreased drug accumulation associated with membrane changes in addition to OmpF reduction. Antimicob Agents Chemother : Deguchi T, Yasuda M, Kawamura T, Nakano M, Ozeki S, Kane

7 matsu E, Nishino Y, Kawada Y. Improved antimicrobial activity of DU-6859a, a new fluoroquinolone, against quinolone resistant Klebsiella pneumoniae and Enterobacter cloacae isolates with alterations in gyra and parc proteins. Antimicob Agents Chemother : Drlica K, Zhao X. DNA gyrase, topoisomerase Ⅳ, and the 4- quinolones. Microbiol Biol Rev : Fukuda H, Hosaka M, Iyobe S, Gotoh N, Nishino T, Hirai K. nfxc-type quinolone resistance in a clinical isolate of Pseudomonas aeruginosa. Antimicob Agents Chemother : Gellert M, Mizuuchi K, O'Dea MH, Nash HA. DNA gyrase: An enzyme that introduces superhelical turns into DNA. Proc Natl Acad Sci USA : Gellert M. DNA topoisomerases. Annu Rev Biochem : Gellert M, Mizuuchi K, O'Dea MH, Ito T, Tomizawa J. Nalidixic acid resistance: A second genetic character involved in DNA gyrase activity. Proc Natl Acad Sci USA : Gensberg K, Jin YF, Piddock LJV. A novel gyrb mutation in a fluoroquinolone resistant clinical isolate of Salmonella typhimurium. FEMS Microbiol Lett : Hallett P, Maxwell A. Novel quinolon resistance mutations of the Escherichia coli DNA gyrase A protein: Enzymatic analysis of the mutant proteins. Antimicob Agents Chemother, : Heisig P. Genetic evidence for a role of parc mutations in development of high-level fluoroquinolone resistance in Escherichia coli. Antimicob Agents Chemother : Hooper DC, Wolfson JS, Ng EY, Swartz MN. Mechanism of action of and resistance to ciprofloxacin. Am J Med : Inoue Y, Sato K, Fujii T, Hirai K, Inoue M, Iyobe S, itsuhashi S. Some properties of subunits of DNA gyrase from Pseudomonas aeruginosa PAO1 and its nalidixic acid resistant mutant. J Bacteriol : Ito H, Yoshida H, Bogaki-Shonai M, Niga T, Hattori H, Nakamura S. Quinolone-resistance mutations in the DNA gyrase gyra and gyrb genes of Staphylococcus aureus. Antimicob Agents Chemother : Jalal S, Wretlind B. Mechanisms of quinolone resistance in clinical strains of Pseudomonas aeruginosa. Microb Drung Resist : Kureishi A, Diver JM, Beckthold B, Schollaardt T, Bryan LE. Cloning and neucleotide sequece of Pseudomonas aeruginosa DNA gyrase gyra gene from strain PAO1 and quinolone resistant clinical isolates. Antimicob Agents Chemotherapy : Lesher G. Froelich Y, Gruett E, Gailey MD, Brundage RR. 1, 8- Naphthyridine derivatives. A new class of chenotherapeutic agents. J Med Pharm Chem : Maniatis T, Fritsch EF, Sambrook J. Molecular cloning a laboratory mannual. Cold Spring Harbor Laboratory Cold Spring Harbor Laboratory, N. Y. Masuda N, Sakagawa E, Ohya S. Outer membrane proteins responsible for multiple drug resistance in Pseudomonas aeruginosa. Antimicob Agents Chemother : Maxwell A, Gellert M. The DNA dependence of the ATPase activity of DNA gyrase. J Bio Chem : Maxwell A. DNA gyrase as a drug target. Trends Microbil : Mizuuchi K, O'Dea MH, Gellert M. DNA gyrase: Subunit structure and ATPase activity of the purified enzyme. Proc Natl Acad Sci USA : Nakamura S, Nakamura M, Kojima T, Yoshida H. gyra and gyrb mutations in quinolone resistant strains of Escherichia coli. Antimicob Agents Chemother : Nakano M, Deguchi T, Kawamura T, Yasuda M, Kimura M, Okano Y, Kawada Y. Mutations in the gyra and parc genes in fluoroquinolone resistant clinical isolates of Pseudomonas aeruginosa. Antimicob Agents Chemother : Radberg G, Nilsson LE, Svensson S. Development of quinoloneimipenem cross resistance in Pseudomonas aeruginosa during exposure to ciprofloxacin. Antimicob Agents Chemother : Rella M, Haas D. Resistance of Pseudomonas aeruginosa PAO to nalidixic acid and low levels of β-lactam antibiotics: Mapping of chromosomal genes. Antimicob Agents Chemother : Sreedharan S, Oram M, Jensen B, Peterson L, Fisher LM. DNA gyrase gyra mutations in ciprofloxacin resistant strains of Staphylococcus aureus: Close similarity with quinolone resistance mutations in Escherichia coli. J Bacteriol : Sugino A, Higgins NP, Cozzarelli NR. DNA gyrase subunit stoichiometry and the covalent attachment of subunit A to DNA during DNA cleavage. Nucleic Acid Res : Takaaki A, Mayumi T, Akihito Y, Kenichi S. Type II topoisome

8 rase mutations in fluoroquinolone-resistant clinical strains of Pseudomonas aeruginosa Isolated in 1998 and 1999: Role of target Enzyme in mechanism of fluoroquinolone resistance. Antimicob Agents Chemother : Wolfson JS, Hooper DC. Fluoroquinolone antimicrobial agents. Clin Microbiol Rev : Yamagishi JI, Yoshida H, Yamayoshi M, Nakamura S. Nalidixic acid resistant mutations of the gyrb gene of Escherichia coli. Mol Gen Gent : Yonezawa M, Takanata M, Matsubara N, Watanabe Y, Narita H. DNA gyrase gyra mutations in quinolone-resistant clinical isolates of Pseudomonas aeruginosa. Antimicob Agents Chemother : Yoshida H, Bogaki M, Nakamura S, Ubukata K, Konno M. Nu- cleotide sequence and charaterization of the Staphylococcus aureus nora gene, which confers resistance to quinolones. J Bacteriol : Yoshida H, Bogaki M, Nakamura S. Quinolone resistance determining region in the DNA gyrase gyra gene of Escherichia coli. Antimicob Agents Chemother : Yoshida H, Bogaki M, Nakamura L, Nakamura M, Nakamura S. Quinolon resistance determining region in the DNA gyrase gyrb gene of Escherichia coli. Antimicob Agents Chemother : Yoshida H, Nakamura M, Bogaki M, Nakamura S. Proportion of DNA gyrase mutants among quinolone-resistant strains of Pseudomonas aeroginosa. Antimicob Agents Chemother :

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Æ¯ÇãÃ» '' - 1 - - 2 - - 3 - - 4 - - 5 - ' - 6 - - 7 - - 8 - - 9 - - 10 - - 11 - Super-Bio Co., Ltd. KWON, Suk-Tae Thermostable DNA Polymerase-encoding Gene from Thermus sp. X-1 an d Amino Acid Sequence