< 겉표지, 속표지 > 16S rrna methylase 생성 그람음성간균의내성양상과 분자유전학적특성 연세대학교대학원 의학과 이혁민
< 제출서 > 16S rrna methylase 생성 그람음성간균의내성양상과 분자유전학적특성 지도교수 이경원 이논문을박사학위논문으로제출함 2007 년 11 월일 연세대학교 대학원 의학과 이혁민
< 인준서 > 이혁민의박사학위논문을인준함 심사위원이경원인 심사위원김준명인 심사위원조상래인 심사위원김명희인 심사위원최종락인 연세대학교대학원 2007 년 11 월일
감사의글 이논문이완성되기까지부족한저에게많은격려와가르침을주신이경원교수님과바쁘신중에도많은지도와깨우침을주신김준명교수님, 조상래교수님, 김명희교수님및최종락교수님께깊은감사를드립니다. 또한본연구에많은도움을주신정윤섭교수님, 염종화교수님께도감사를드리며, 논문의실험을도와수고해주신기타모든선생님들께도깊은감사를드립니다. 마지막으로어려운와중에서도항상옆에서힘이되어준아내은정이와힘들때마다웃음을선사해주었던승준이와예준이두아들에게도진심으로감사합니다. 이혁민
< 차례 > 국문요약 1 I. 서론 4 I. 재료및방법 8 1. 시험균주의수집 8 2. 균종동정및 16S rrna methylase 생성선별검사 8 3. 항균제감수성시험 8 4.β-lactam 항균제내성기전규명 9 가.Extended-spectrum β-lactamase 생성시험 9 나.Plasmid-mediatedAmpC β-lactamase 생성시험 9 다.Carbapenemase 내성시험 10 (1)Imipenem-Hodge 변법 10 (2)Imipenem-EDTA+SMA doubledisksynergy 법 10 5.16S rrna methylase 유전자검출 10 6.Plasmid-mediatedquinolone 내성유전자검출 11 7.16S rrna methylase 생성균주의분자유전학적 연관성규명 11 I. 결과 14 1.16S rrna methylase 양성율 14 2.16S rrna methylase 유전형분포 16 3.16S rrna methylase 생성균주의항균제내성양상 18 4.16S rrna methylase 생성균주의다제내성양상 20 5.16S rrna methylase 생성균주의유전적연관성 20 IV. 고찰 25 V. 결론 31 -i-
참고문헌 32 영문요약 39 - i-
< 그림및표차례 > 그림차례 Fig.1.Pulsed-fieldgelelectrophoresispaternofarmA and qnrb-producinge.coliandk.pneumoniaeisolates showedpolyclonalpaterns. 24 표차례 Table1.PrimersusedforPCR detectionof16s rrna methylasegenesandqnrgenes 13 Table2.Theratesof16S rrna methylase-producing isolatesinseveranceandmyongjihospital from 2006to2007 15 Table3.Distributionof16S rrna methylasein gram-negativebacili 17 Table4.ComparisonsofMICs(μg/mL)ofantibioticsfor 16S rrna methylase-positiveand-negative gram-negativebacili 19 Table5.Comparisonsoftheratesofβ-lactam resistance andquinoloneresistancein16s rrna methylase-positive and-negativegram-negativebacili 22 - i-
Table6.ComparisonsoflevofloxacinMICsinqnr-positive and-negativegram-negativebacili 23 -iv-
국문요약 16S rrna methylase 생성그람음성간균의 내성양상과분자유전학적특성 Aminoglycoside 항균제는세균의 ribosome 과불가역적으로결합하여단백합성을저해하는살균성항균제로, 단독또는병합요법으로흔히사용된다. 근래에 aminoglycoside 제의작용표적인 30S ribosome 을구성하는 16S rrna 를 methylation 하여임상적으로유용한모든 4,6-substituted deoxystreptamine 항균제에고도내성을보이게하는새로운내성기전이보고되었으나, 이에대한국내의연구는드물다. 이에본연구에서는서울과경기도에소재하는 2차와 3차병원의환자에서분리되는그람음성간균중에서 16S rrna methylase 를생성하는균주의빈도와그내성유전형, 또한이들세균중에 β-lactam 제와 fluoroquinolone 제등에대한다제내성양상을규명하고자하였다. 2006 년 7월부터 2007 년 6월까지경기도화정에위치한 2차병원과 2007 년 4월부터 6월까지서울에위치한 3차병원에내원한환자에서분리한일련의균주, 즉 Enterobacteriaceae, Pseudomonas, Acinetobacter 균종및 Stenotrophomonasmaltophilia 를대상으로하였으며, 중복분리주는제외하였다. 균종동정은전통적인생화학적방법과상품화된 kit 를이용하였다. 수집한균주는디스크확산법과한천희석법으로 β-lactam 제, aminoglycoside 제및 fluoroquinolone 제에대한항균제감수성을시험하였다.Extended-spectrum β-lactamase(esbl) 생성은 doubledisk synergy 법으로 시험하였고,plasmid-mediated AmpC β-lactamase -1-
(PABL) 생성은 cefoxitin 감수성시험결과로추정하였다. Carbapenemase 의생성은 modified-hodge 법과, imipenem-edta doubledisksynergy 법으로시험하였다. 16S rrna methylase 생성은 arbekacin 디스크를이용하여선별한후,PCR 로유전자 (arma,rmta,rmtb,rmtc 및 rmtd) 를검출하였고유전자염기서열을분석하여빈도와유전형을결정하였다. Plasmid-mediated quinolone 내성기전은 qnra, qnrb, qnrs 및 qepa 유전자에대한 PCR 과염기서열분석으로시험하였다.16S rrna methylase 와 qnr 유전자양성인균주의유전적연관성을규명하기위해 pulsed-fieldgelelectrophoresis 를시행하였다. 16S rrna methylase 는 2007 년 4 월부터 6 월에세브란스병원에서 분리된임상균주중,E.coli 2주 (<1%),K.pneumoniae 24 주 (11%),K.oxytoca1 주 (2%),Citrobacter4 주 (10%),Enterobacter2 주 (4%),S.marcescens 2주 (4%),Achromobacterxylosoxidans 1주 (20%),Acinetobacter11 주 (10%) 및 S.maltophilia1 주 (2%) 에서검출되었고,2006 년 7월부터 2007 년 6월에명지병원에서분리된균주에서는,E.coli8 주 (1%),K.pneumoniae 51 주 (21%),Citrobacter 3 주 (8%), Enterobacter 2주 (2%), S. marcescens 4주 (8%), P. miriabilis 2주 (4%), P. aeruginosa 1주 (<1%) 에서확인되었다. arma 는세브란스병원분리주 48 주중 43 주 (90%) 에서, 명지병원분리주 75 주중 70 주 (93%) 에서양성이었다. E. coli 2주, K. pneumoniae2 주,Citrobacter 균종 2주및 Providencia 균종 3주에서는 rmtb 유전자가분리되었으며, 이중 4주에서는동시에 arma 유전자가분리되었다.armA 와 rmtb 가동시에분리되는균주는 E.coli1 주,K.pneumoniae2 주및 P.retigeri1 주였으며, 분리된환자사이 -2-
에역학적인연관성은없었다.A.xylosoxidans1 주에서는 rmta 유전자가양성이었다.16S rrna methylase 생성 Enterobacteriaceae 의 cefoxitin 및 levofloxacin 에대한내성율은 85% 및 81% 로음성인균주의 68% 및 36% 보다높았다.16S rrna methylase 를생성하는균주에대한 aminoglycoside 항균제의 MIC 는모두 >128 μg/ml 으로높았고감수성인균주는없었다. 16S rrna methylase 생성 K. pneumoniae 의 ESBL 및 PABL 양성율은 59% 및 92% 로음성균주의 43% 및 64% 에비해서높았으며, 특히 16S rrna methylase 를생성하는 K. pneumoniae 의 91% 가 qnrb 를동시에가지고있었다. Plasmid-mediated quinoloneeflux pump 를생성하는 qepa 유전자는 rmtb 유전자양성인 E.coli 및 C.freundi 와 16S rrna methylase 음성인 1주의 E.coli 에서양성이었다.16S rrna methylase 양성인 Pseudomonas 및 Acinetobacter 균종에서 metalo-β-lactamase 를생성하는균주는없었다.16S rrna methylase 를생성하는균주의유전적연관성을알아보기위해시행한 PFGE 에서는다양한양상을보였다. 이상으로, 국내에서 16S rrna methylase 유전자에의한 aminoglycoside 고도내성인그람음성간균은외국에비하여흔하였고, 여러균종에널리퍼져있으며, 유전적구조도다양한것으로판단된다. 또한이들균주들은 ESBL,PABL 및 qnrb 같은내성유전자를동시에갖는경우가흔하였다. 핵심되는말 :16S rrna methylase,arma,rmtb,aminoglycoside, 그람음성간균 -3-
< 본문 > 16S rrna methylase 생성그람음성간균의 내성양상과분자유전학적특성 < 지도교수이경원 > 연세대학교대학원의학과 이혁민 Ⅰ. 서론그람음성간균은중요한지역사회및원내감염균으로,Escherichia coli 및 Klebsielapneumoniae 등을포함하는 Enterobacteriaceae 와 Pseudomonasaeruginosa 및 Acinetobacter 균종을포함하는포도당비발효성그람음성간균등의다양한균종으로이루어져있다. 그람음성간균에의한감염증의치료에는세균의 penicilin-binding protein 에결합하여항균작용을나타내는 β-lactam 항균제, 세균의 DNA gyrase 와 topoisomerase 에결합하여 DNA 합성을저해하는 fluoroquinolone 항균제및세균 ribosome 의 30S subunit 에불가역적으로결합하여 mrna 의번역을방해하고,peptide 연장을저해함으로써, 살균작용을나타내는 aminoglycoside 항균제가주로사용되나, 근래에이들항균제에대한내성이증가하여임상적으로큰문제가되고있다.2003 년에국내 44 개병원에서수집하여분석한내성율자료에의하면 1,K.pneumoniae 의항균제내성율은 ceftazidime25%, cefoxitin 23%,fluoroquinolone19% 및 amikacin 13% 로,1997 년의 -4-
25%,16%,7% 및 8% 에비해일부증가하거나여전히높았다. Acinetobacter 균종의항균제내성율은 2003 년도에 ceftazidime54%, imipenem 13%,fluoroquinolone58% 및 amikacin 56% 로외국에비하여높았다. 국내의높은항균제내성율중,β-lactam 항균제와 aminoglyoside 항균제에대한내성은 extended-spectrum β -lactamase(esbl),plasmid-mediated β-lactamase(pabl) 및 metalo-β-lactamase(mbl) 같은다양한 β-lactam 항균제분해효소와 aminoglycoside 를불활화하는 AAC(6 )-I 등의 aminoglycoside-modifyingenzyme 의확산에의한것으로보고되었다 2. Aminoglycoside-modifying enzyme 은임상검체에서분리되는 aminoglycoside 내성균에서가장흔한내성기전으로, acetyl transferase (AAC),phosphotransferase (APH) 및 adenyltransferase (ANT 또는 AAD) 의 3 종류가있으며작용하는 amino 기또는 hydroxyl 기의위치에따라 AAC(6`) 과같이표기한다 2. 각각의효소는다시불활성화하는항균제의특이성에따라서 AAC(6`)-I 등과같은 subgroup 으로분류되며, 임상검체에서분리되는 aminoglycoside 내성균은생성하는수식효소의종류에따라, 내성을보이는 aminoglycoside 의종류가다르고,arbekacin 에고도내성을일으키는효소는아직까지보고된바없다. 그러나최근들어 arbekacin 및 amikacin 을포함한임상적으로유용한모든 aminglocoside 에고도내성을일으키는내성기전이보고되었다 3-4. 새로운내성기전은 16S rrna methylase 유전자로부터생성된 methylase 가 aminoglycoside 제의작용표적인 30s ribosome 을구성하는 16S rrna 를 methylation 하여 amikacin 및 gentamicin 을포함한모든 4,6-disubstituted deoxystreptamine 항균제에고도내성을보이는것 -5-
으로,plasmid 를통해다른균주로쉽게전달된다. 그람음성간균에서 16S rrna methylase 를생성하는내성유전자로는최근까지 Serratia marcescens 에서 arma 3,P.aeruginosa 에서 rmta 4,S.marcescens 에서 rmtb 5,P.mirabilis 에서 rmtc 6 가각각보고되었으며, 브라질에서는 metalo-β-lactamase 의일종인 SPM-1 을가진 P.aeruginosa 에서 rmtd 7 가보고되었다. 새로운내성기전에대한역학적인조사는매우드물지만,Yan 등은 2004 년에대만에서분리된 E.coli2,559 주와 K.pneumoniae1,624 주를대상으로 16S rrna methylase 유전자검출을시험하여,armA 양성균주와 rmtb 양성균주가 E.coli 중각각 12 주와 2주,K. pneumoniae 중각각 16 주와 5주있었고,16S rrna methylase 를생성하는균주중,CTX-M,TEM 또는 SHV 등의 ESBL 이나,CMY-2 등의 PABL 을생성하는균주가흔함을보고하였고 8, 임상검체에서분리된 16S rrna methylase 를생성하는많은균주가 carbapenem 을 제외한대부분의 β-lactam,aminoglycoside 및 fluoroquinolone 항균 제에다제내성을보인다고하였다. 국내에서는일부제한된균종에서 16S rrna methylase 에대한보고가있었다. 이등은 2003 년과 2005 년에국내의일개대학병원에서수집한일부균주를대상으로시행한연구에서,armA 유전자에의한 aminoglycoside 고도내성이국내에도드물지않고, 대부분이 ESBL 과 PABL 양성이면서 levofloxacin 에내성인것을보고하였다 9. 한편, quinolone 항균제의내성기전은크게 DNA gyrase 와 topoisomeraseiv 의변이에의한것과능동적인유출에의한것이있다. 이두가지기전은모두세균염색체의변이에의해일어나고수직으로전달되며, 전이성인자에의해서는전달되지않는다 10. 그러나 -6-
최근 plasmid 에의해전달되는 fluoroquinolone 내성기전이보고되었는데,Martinez-martinez 등에의한 qnr 내성기전과 Yamane 등에의한 plasmed-mediated activeeflux pump(qepa) 이다 11-12. 일부보고에의하면 qnr 내성기전은 ESBL 을생성하는세균에서흔하다고하였으나 13,ESBL 과자주동반되는 16S rrna methylase 와의관계에대해서는명확하지않으며,qepA 에의한 fluoroquinolone 내성은 16S rrna methylase 에의한내성과연관이있으나국내에서는이에대한연구가없다. 이와같이 16S rrna methylase 생성균주는세균감염증환자치료에유용한 aminoglycoside 제와다른중요항균제에다제내성을보여임상적으로매우중요하나국내에서는이에대한연구가거의없는실정이다. 본연구에서는서울과경기도에소재하는 2차와 3차병원의환자에서분리되는그람음성간균중에서 16S rrna methylase 를생성하는균주의빈도와그내성유전형, 또한이들세균중에 β -lactam 제와 fluoroquinolone 제등에대한다제내성양상을규명하고 자하였다. -7-
Ⅱ. 재료및방법 1. 시험균주의수집 2007 년 4월부터 2007 년 6월까지서울에위치한세브란스병원과 2006 년 7월부터 2007 년 6월까지경기도화정에위치한명지병원에입원한환자에서분리되는 Enterobacteriaceae, Pseudomonas, Acinetobacter 균종및 Stenotrophomonasmaltophilia 를대상으로일련의분리된균주모두를수집하였으며, 한환자에서중복분리된균주는제외하였다. 2. 균종동정및 16S rrna methylase 생성선별검사균종동정은전통적인생화학적방법과상품화된 kit 를이용하였다. Arbekacin 에대한감수성선별은 arbekacin 디스크 (30 μg,eiken Chemical,Tokyo,Japan) 를사용하여 ClinicalLaboratory Standards andinstitute(clsi) 디스크확산법으로시행하였고 14, 디스크억제대가 13 mm 이면내성으로, 억제대가없으면고도내성으로간주하였다 9. 3. 항균제감수성시험 항균제감수성은 CLSI 한천희석법으로시험하였다. 감수성시험용배지는 Mueler-Hinton I 배지 (BBL,Cockeysvile,MD,USA) 를사용하였고, 항 균제는 ceftazidime (GlaxoSmithKline, Greenford, United Kingdom), cefoxitin 및 imipenem (Merck/Sharp & Dohme,Rahway,NJ,USA), levofloxacin(daichipharmaceuticalco.ltd.,tokyo,japan),arbekacin (MeijiSeika,Tokyo,Japan),amikacin(Dong-A Pharmaceutical,Seoul, Korea),gentamicin 및 tobramycin (Dong WhaPharmaceutical,Seoul, -8-
Korea) 을사용하였다. 순배양한시험세균을 Steers replicator (Craft MachineInc.,Woodline,PA,USA) 를사용하여약 10 4 colony forming unit 을접종한후,35 에서배양후에판독하여 minimum inhibitory concentration(mic) 을결정하였다.Arbekacin 의 breakpoint 는 4μg/mL 를감수성,8 μg/ml 를중간, 16 μg/ml 을내성으로정하였고, 정도관리를위해서 E.coliATCC 25922 및 P.aeruginosaATCC 27853 균주를동시에시험하였다. 4.β-lactam 항균제내성가.Extended-spectrum β-lactamase 생성시험 Cefotaxime,ceftazidime 및 aztreonam 항균제의억제대지름이각각 27 mm, 22 mm 및 27 mm 이면 ESBL 생성균주를의심하였다. ESBL 생성균주가의심되면 double disk synergy (DDS) 시험으로 ESBL 생성을확인하였다. 즉,ESBL 생성이의심되는시험세균을 McFarland 0.5 탁도로 Mueler-Hinton I한천에접종하고,amoxicilin-clavulanic acid (20/10 μg) 를중앙에놓고디스크가장자리로부터 10 mm 되게 cefotaxime, ceftazidime, cefepime 등의디스크를놓은후에, 디스크에의한억제대가상승작용에의하여확장되는경우양성으로판단하였다. 나.Plasmid-mediatedAmpC β-lactamase 생성시험 E.coli 와 K.pneumoniae 에서 PABL 생성여부를선별하기위하여 cefoxitin 항균제의 MIC 를시험하였다.E.coli 와 K.pneumoniae 는 AmpC β-lactamase 가발현되지않거나없으므로,cefoxitin 에대해서내성인균주는 PABL 을생성하는것으로판정하였다. -9-
다.Carbapenemase 생성시험 (1)Imipenem-Hodge 변법지시세균인 E.coliATCC 25922 를 McFarland0.5 관탁도로맞추고 Mueler-Hinton I한천에면봉으로고루접종하였다. 물기가마른뒤에배지중앙에 imipenem 디스크의놓을자리를정하고그곳으로부터배지접시가장자리를향해 carbapenemase 생성이의심되는시험세균을진하게획선접종하였다.35 에 15 분간두었다가 imipenem 디스크를중앙에놓고하루밤배양후, 지시세균의억제대안에있는시험세균의증식선에따라서지시세균의억제대가들어가면양성으로판독하였다. (2)Imipenem-EDTA+SMA DDS 법 Carbapenemase 생성이의심되는세균을식염수를써서 McFarland 0.5 관의탁도로희석하고 Mueler-Hinton I한천에면봉으로접종하였다. 표면이마른뒤에 imipenem 디스크를놓고, 적당한두께의여과지로만들어멸균한디스크를그가장자리사이의거리가 10 mm 되게놓은후에, 빈디스크에 0.5 M EDTA+SMA 용액 10 μl 를넣었다. 하루밤배양후에두디스크사이의억제대가커지면양성으로판독하였다. 5.16S rrna methylase 유전자검출 Arbekacin 디스크확산법에서내성인균주를대상으로,16S rrna methylase 유전자 (arma,rmta,rmtb,rmtc 및 rmtd) 를 PCR 로 검출하였다 (Table 1). 백금침으로시험세균을채취하여 200 μl 의증 류수에부유한뒤에 8 분간끓이고 2 분간 13,000 rpm 으로원심분리한 -10-
상청액을 template 로사용하였다. 상청액 1 μl,20 pmol 의 primer 각 각 1 μl,1 U 의 Taq DNA polymerase 가들어있는 PreMix (Bioneer, Daejeon) 에증류수를첨가하여총 20 μl 가되게하여 PCR 을시행하 였다. 증폭은 Mastercycler gradient 5331 (Eppendorf, Hamburg, Germany) 을사용하였고, 조건은 predenaturation 94 5분, denaturation 94 30 초, annealing 55 (arma, rmta, rmtb; Multiplex),rmtC 55 및 rmtd 62 30 초,extension 72 1분의조건으로모두동일하였다.PCR 증폭산물은 1% 의 agarosegel100ml 에 0.005% 의농도로 ethidium bromide 를첨가하여만든 gel 에서 10x loading bufer(takara,otsu,japan)1 μl 를첨가하여 Mupidsystem (Seoulin Bioscience,Seoul) 으로 100 V에서 30 분간전기영동하였다. 증폭산물의크기를비교하기위해서는 100 bp 의 DNA ladder (Takara) 를사용하였고,band 는 UVIpro (Uvitec Ltd.,Cambridge, England) 로관찰하였다. 일부균주는필요에따라서 gelextraction kit (Qiagen,Hilden,Germany) 를사용하여 DNA 를추출하고 ABI 3700 장비 (Perkin-Elmer,FosterCity,CA,U.S.A.) 로 methylase 유전자의염기서열을분석하여,methylase 의종류를확인하고, 유전적인변이형 (Geneticvariant) 이존재하는지를선별하였다. 6.Plasmid-mediatedquinolone 내성유전자검출 Plasmid 에의해전달되는 quinolone 내성유전자인 qnra,qnrb, qnrs 및 qepa 를 PCR 로검출하였다 15.DNA 는 16S rrna methylase 를검출하기위해추출한것을사용하였다. 상청액 1 μl,20 pmol 의 primer 각각 1 μl,1 U의 Taq DNA polymerase 가들어있는 PreMix (Bioneer) 에증류수를첨가하여총 20 μl 가되게하여 PCR 을시행하 -11-
였다. 증폭은 Mastercycler gradient 5331 (Eppendorf, Hamburg, Germany) 을사용하였고, 조건은 predenaturation 94 5분, denaturation 94 30 초, annealing 55 (qnra, qnrb 및 qnrs; Multiplex), 및 qepa 61 30 초,extension 72 1분의조건으로시행하였다. 일부균주에서는 ABI3700 장비로염기서열을분석하여유전형을확인하였다. 7.16S rrna methylase 생성균주의분자유전학적연관성규명 16S rrna methylase 를생성하는균주를균종별로모아염색체 DNA 를추출한후, 제한효소로절단하여 pulsed-field gel electrophoresis (PFGE) 를시행하여 clonality 를확인하였다. 실험균주들을각각 LB broth5ml 에접종하고 20 시간배양한뒤,Lysozyme (10 mg/ml) 1 μl 와 2% Incert agarose (Cambrex Bio Science RocklandInc.,Rockland,ME,U.S.A.)140 μl 를섞어 mold 에넣고굳힌후에 4 에보관하였다. Plug 를 mold 에서떼어낸후, lysis solution 1 ml와 lysozyme 1 μl 를넣고 1시간동안 rotator (Cole-ParmerInstrument,Chicago,IL,U.S.A.) 로회전시키면서용균하였다.TE bufer (1 mm EDTA,10 mm Tris-HCl) 을사용하여 lysozyme 을제거한후에 XbaI(Takara) 제한효소 30U 을사용하여 DNA 를절단하였다.EDTA 100 μl를사용하여제한효소의작용을중단시키고,1% agarose gel(sigma) 을사용하여, 전기영동을시행하였다. 전기영동은 CHEF DR I(Bio-Rad,Hercules,CA,U.S.A.) 을사용하여 6 V에서시작 0.5 초, 마지막 30 초의조건으로시행하였다. Ethidium bromide 0.5 μl/ml 로 30 분간염색한후 UVI pro (Uvitec,Ltd.) 로 band 를확인하였다. -12-
Table1.PrimersusedforPCR detection of16s rrna methylase genes,qnr,andqepa genes Name NucleotideSequence(5 -> 3 ) Product size(bp) GenBank AccessionNo. arma F arma R rmta F rmta R rmtb F rmtb R rmtc F rmtc R AGG TTG TTT CCA TTT CTG AG TCT CTT CCA TTC CCT TCT CC CTA GCG TCC ATC CTT TCC TC TTT GCT TCC ATG CCC TTG CC CCC AAA CAG ACC GTA GAG GC CTC AAA CTC GGC GGG CAA GC CGA AGA AGT AAC AGC CAA AG ATC CCA ACA TCT CTC CCA CT 590 AB116388 635 AB083212 584 AB103506 711 AB194779 rmtd F rmtd R ATG AGC GAA CTG AAG GAA AAA CTG C GCT CCA AAA GCG GCA GCA CCT TA 532 DQ914960 qnra F qnra R AGA GGA TTT CTC ACG CCA GG TGC CAG GCA CAG ATC TTG AC 580 qnra1 qnra6* qnrb F qnrb R GGA ATT GAA ATT CGC CAC TG TTT GCC GCC CGC CAG TCG AA 264 qnrb1 qnrb6* qnrs F qnrsr GCA AGT TCA TTG AAC AGG GT TCT AAA CCG TCG AGT TCG GCG 428 qnrs1 qnrs2* qepa F qepa R CCG ACA GGC CCA CGA CGA GGA TGC TCG GCG GCG TGT TGC TGG AGT TCT 549 AB263754 * Primers designed for multiplex PCR ofvarious qnr genes by CatoirV,etal 15. -13-
Ⅲ. 결과 1.16S rrna methylase 양성율 2006 년 7월부터 2007 년 6월사이에명지병원에서는 134 주,2007 년 4월부터 6월사이에세브란스병원에서는 83 주의 arbekacin 내성그람음성간균이분리되었다.16S rrna methylase 양성균주는세브란스병원분리주중,E.coli2 주 (<1%),K.pneumoniae 24 주 (11%),K. oxytoca1 주 (2%),Citrobacter 균종 4주 (10%),Enterobacter 균종 2 주 (4%), S. marcescens 2주 (4%), A. xylosoxidans 1주 (20%), Acinetobacter 균종 11 주 (10%) 및 S.maltophilia 1주 (2%) 이었고, 명지병원분리주중에서는,E.coli8 주 (1%),K.pneumoniae 51 주 (21%),Citrobacter 균종 3주 (8%),Enterobacter 균종 2주 (2%),S. marcescens 4 주 (8%),P.miriabilis 2 주 (4%),P.aeruginosa 1 주 (<1%) 이었다. 그람음성간균전체에대한양성율은세브란스병원 4% 및명지병원 5% 이었다 (Table2). -14-
Table2.Theratesof16S rrna methylase-producing isolatesin Severanceand Myongjihospitalfrom 2006to2007 SeveranceHospital MyongjiHospital Arbekacin Arbekacin Bacterialspecies No. Methylase No. Methylase Screening Screening isolated Positive(%) isolated Positive(%) Positive Positive E.coli 416 3 2(<1) 646 11 8(1) K.pneumoniae 215 29 24(11) 245 60 51(21) K.oxytoca 44 1 1(2) ND Citrobacterspp 45 4 4(10) 37 3 3(8) Enterobacterspp 52 3 2(4) 129 3 2(2) S.marcescens 48 3 2(4) 52 5 4(8) P.mirabilis ND 57 2 2(4) M.morgani ND 27 1 1(4) Providenciaspp ND 21 3 3(14) A.xylosoxidans * 5 1 1(20) ND P.aeruginosa 248 9 0(0) 257 14 1(<1) Acinetobacterspp 112 13 11(10) ND S.maltophilia 66 17 1(2) ND Total 1251 83 48(4) 1471 134 75(5) * A.xylosoxidans:rmtA positive. Abbreviations:ND,Notdetermined. -15-
2.16S rrna methylase 유전형분포 16S rrna methylase 양성균주중에서가장흔한것은 arma 이었다. 세브란스병원분리주 48 주에서 43 주 (90%), 명지병원분리주 75 주에서 70 주 (93%) 가 arma 양성이었다.E.coli2 주,K.pneumoniae2 주,Citrobacter 균종 2주및 Providencia 균종 3주에서는 rmtb 유전자가검출되었으며, 이중 4주에서는동시에 arma 유전자가검출되었다. arma 와 rmtb 가동시에분리되는균주는 E.coli 1주,K. pneumoniae 2주및 P.retigeri1 주였으며, 균종별및분리병원별분포가다양하였고, 분리된환자간의역학적연관성은없는것으로판단되었다.A.xylosoxidans 1주에서는 rmta 유전자가양성이었다. 유전자의변이형을선별하기위해서세브란스병원에서분리된 E.coli 1주,K.pneumoniae 2주,C.freundi1 주,A.baumanni1 주및 S. maltophilia 1주와명지병원에서분리된 E.coli1 주,K.pneumoniae 3주,C.freundi 1주,P.retigeri 1주,M.morgani 1주및 P. aeruginosa1 주에서 arma 유전자염기서열을분석하였으나모든균주에서동일한염기서열을보였다.rmtB 유전자가검출된 9주에대해서도유전자를증폭하여염기서열을분석하였으나, 염기서열의변이는관찰되지않았다 (Table3). -16-
Table3.Distributionof16srRNA methylaseingram-negativebacili Bacterialspecies Severancehospital Myongjihospital arma rmtb arma+rmtb arma rmtb arma+rmtb E.coli 0 1 1 8 0 0 K.pneumoniae 24 0 0 49 0 2 K.oxytoca 1 0 0 ND Citrobacterspecies 2 2 0 3 0 0 Enterobacterspecies 2 0 0 2 0 0 S.marcescens 2 0 0 4 0 0 P.mirabilis ND 2 0 0 M.morgani ND 1 0 0 Providenciaspecies ND 0 2 1 A.xylosoxidans* 0 0 0 ND P.aeruginosa 0 0 0 1 0 0 Acinetobacterspecies 11 0 0 ND S.maltophilia 1 0 0 ND Total 43 3 1 70 2 3 *A.xylosoxidans:rmtA-positive. Abbreviation:ND,Notdetermined. -17-
3.16S rrna methylase 생성균주의항균제내성양상 16S rrna methylase 를생성하는균주중,Enterobacteriaceae 에속하는 133 주와 P.aeruginosa9 주및 Acinetobacter 균종 13 주를대상으로항균제감수성을시험하였다.16S rrna methylase 를생성하는 Enterobacteriaceae 에대한 ceftazidime,cefoxitin 및 imipenem 의 MIC 90 은 >128 μg/ml, >128 μg/ml 및 4 μg/ml 로 16S rrna methylase 음성균주의 >128 μg/ml,128 μg/ml 및 1 μg/ml 과비슷하였으나, 내성율은 16S rrna methylase 양성균주에서각각 66%, 85% 및 4% 로 16S rrna methylase 음성인균주의 63%,68% 및 0% 보다높았다.16S rrna methylase 양성인 Enterobacteriaceae 의 levofloxacin 에대한내성율은 81% 로음성인균주의 36% 와비교하여매우높았다.Aminoglycoside 에대해서는 16S rrna methylase 양성인균주는 arbekacin,amikacin,gentamicn 및 tobramycin 의 MIC 가모두 128 μg/ml 이상이었으나, 음성인균주는 arbekacin 및 amikacin 에 50% 의균주가감수성이었다.16S rrna methylase 양성인 P. aeruginosa 와 Acinetobacter 균종중에서 ceftazidime 에감수성인균주는없었으며,imipenem 의 MIC 90 은 4 μg/ml 으로모두감수성이었다.16S rrna methylase 를생성하지않고 arbekacin 에내성인균주의 45% 가 ceftazidime 에,72% 가 imipenem 에내성인것과차이를보였다.16S rrna methylase 음성인균주의 levofloxacin 에대한 MIC 90 과내성율은각각 128 μg/ml 과 90% 로양성인균주의 32 μg/ml 과 63% 에비교하여높았다. 16S rrna methylase 양성인균주의 aminoglycoside 항균제에대한 MIC 가모두 >128 μg/ml 으로 Enterobacteriaceae 와마찬가지로높았고감수성인균주는없었다 (Table4). -18-
Table 4.Comparisons ofmics (μg/ml)ofantibiotics for16s rrna methylase-positive and -negative gram-negativebacili Antimicrobialagents 16S rrna methylase-positive 16S rrna methylase-negative MIC range MIC 50 MIC 90 %R MIC range MIC 50 MIC 90 %R Enterobateriaceae(133) Ceftazidime 0.12 ->128 64 >128 66 1->128 32 >128 63 Cefoxitin 0.5 ->128 >128 >128 85 8->128 32 >128 68 Imipenem 0.06-32 0.25 2 4 0.06-4 0.25 1 0 Levofloxacin 0.06 ->128 64 128 81 0.12->128 2 128 36 Arbekacin >128 >128 >128 100 2->128 16 >128 50 Amikacin >128 >128 >128 100 8->128 16 >128 50 Gentamicin >128 >128 >128 100 8->128 128 >128 100 Tobramycin >128 >128 >128 100 32->128 64 >128 100 Pseudomonas(9)andAcinetobacter(13) Ceftazidime 128->128 >128 >128 100 2->128 16 >128 45 Imipenem 1-8 4 4 0 1-32 16 32 72 Levofloxacin 4-64 8 32 63 2->128 64 128 90 Arbekacin >128 >128 >128 100 2->128 64 >128 63 Amikacin >128 >128 >128 100 4->128 64 >128 90 Gentamicin >128 >128 >128 100 2->128 >128 >128 90 Tobramycin >128 >128 >128 100 0.5->128 128 >128 90-19-
4.16S rrna methylase 생성균주의다제내성양상 16S rrna methylase 양성 E.coli 의 ESBL,PABL 및 qnr 양성율은각각 70%,70% 및 30% 로, 음성균주의 50%,25% 및 0% 와비교하여높았으나, 균주수가각각 10 주와 4주로적었다.K.pneumoniae 의 ESBL 및 PABL 양성율은 16S rrna methylase 양성균주에서 59% 및 92% 로, 음성균주의 43% 및 64% 에비해서높았으며, 특히 16S rrna methylase 를생성하는 K.pneumoniae 의 91% 가 qnrb 를동시에가지고있었다 (Table 5). 기타 Enterobacteriaceae 에서도 methylase 의유무에따른 ESBL 생성율은양성균주중,50% 및음성균주중,25% 로양성균주가높았으며,qnr 양성율도각각 43% 및 25% 이었다. qnr 양성인 K. pneumoniae 는음성균주에비해 MIC 50,MIC 90 이 2-4 배높았으며, 내성율은각각 87% 및 70% 이었다 (Table6). 기타 Enterobacteriaceae 균종에서 arma 를생성하는균주는 26 주였으며,qnrB 를동시에생성하는균주는 9주 (35%) 이었고, 그중 7주가 Citrobacter 균종에속하였다.Plasmid-mediated quinolone eflux pump 인 qepa 유전자는 rmtb 유전자양성인 E.coli 및 C. freundi 와 16S rrna methylase 음성인 1주의 E.coli 에서양성이었고 (Table5),3 주모두의염기서열은문헌에보고된것과 100% 일치하였으며, 각각의유전적연관성은없는것으로생각되었다. 16S rrna methylase 양성인 Pseudomonas 및 Acinetobacter 균종에서 metalo-β-lactamase 를생성하는균주는없었다. 5.16S rrna methylase 생성균주의유전적연관성 16S rrna methylase 를생성하는균주의유전적연관성을알아보 기위해세브란스병원과명지병원에서분리된 E. coli 와 K. -20-
pneumoniae 를대상으로 PFGE 를시행하였다.8 주의 E.coli 는 A-G 의 7개의유형과 1개의아형으로분류되었으며, 각병원과분리주간에유전적인연관성이없었다.17 주의 K.pneumoniae 는 A-J 의 10 개의유형과 1개의아형으로분류되었다.C 유형과 G 유형은세브란스병원분리주와명지병원분리주에서모두관찰되었으나역학적인조사에서연관성은없었다.armA 와 qnrb 양성인 K.pneumoniae 는세브란스병원분리주에서 A,B,C,E 및 G 유형이었고, 명지병원분리주에서는 C,G1,I,J,K,L 및 J유형으로다양하여균주간의유전적인연관성은없는것으로생각되었다. -21-
Table 5.Comparisons of the rates of β-lactam resistance and quinolone resistance in 16S rrna methylases-positiveand-negativegram-negativebacili No.(%)ofotherresistancemechanisms Bacterialspecies(No.ofisolates) ESBL PABL qnra qnrb qnrs qepa * 16S rrna methylase-positive E.coli(10) 7(70) 7(70) 0(0) 2(20) 1(10) 1(10) K.pneumoniae(75) 44(59) 69(92) 1(2) 68(91) 0 0 OtherEnterobacteriaceae(26) 13(50) NT 2(8) 9(35) $ 0 1(4) Pseudomonasspp.andAcinetobacterspp.(12) 0 # NT 0 1(8) 0 0 16S rrna methylase-negative E.coli(4) 2(50) 1(25) 0 0 0 1(25) K.pneumoniae(14) 6(43) 9(64) 0 8(57) 1(7) 0 OtherEnterobacteriaceae(4) 1(25) NT 0 1(25) 0 0 Pseudomonasspp.andAcinetobacterspp.(11) NT NT 0 4(36) 0 0 *2of3qepA-positivestrainswerermtB-positivestrains. $ 7qnrB-positivestrainswereCitrobacterspecies. #Metalo-β-lactamaseproductiontestedinP.aeruginosa. -22-
Table6.ComparisonsoflevofloxacinMICsinqnr-positiveand-negativegram-negativebacili Bacterialspecies(No.ofisolates) MICsoflevofloxacin(μg/ml) Range 50 90 %R qnr-positive K.pneumoniae(79) 0.12- >128 64 128 87 Othergram-negativebacili(103) 0.12- >128 64 128 84 qnr-negative K.pneumoniae(10) 0.06- >128 16 64 70 Othergram-negativebacili(69) 0.12-64 4 64 46-23-
PFGE type Hospital StrainNo. Species Methylase qnrgene A S 77 E.coli arma Negative B S 31 E.coli Negative Negative C M 1 E.coli arma Negative C1 M 8 E.coli arma qnrb D M 16 E.coli arma Negative E M 28 E.coli arma Negative F M 31 E.coli arma qnrb G M 48 E.coli arma Negative A S 3 K.pneumoniae arma qnrb B S 7 K.pneumoniae arma qnrb C S 11 K.pneumoniae arma qnrb D S 33 K.pneumoniae Negative qnrb A S 37 K.pneumoniae arma qnrb PFGE type Hospital StrainNo. Species Methylase qnrgene E S 43 K.pneumoniae arma qnrb F S 44 K.pneumoniae Negative Negative G S 45 K.pneumoniae arma qnrb H S 71 K.pneumoniae Negative Negative Failed G1 M 43 K.pneumoniae arma qnrb C M 57 K.pneumoniae arma Negative C1 M 61 K.pneumoniae arma qnrb I M 78 K.pneumoniae arma qnrb J M 81 K.pneumoniae Negative qnrb K M 83 K.pneumoniae arma qnrb L M 84 K.pneumoniae arma qnrb J M 87 K.pneumoniae arma qnrb Fig.1.Pulsed-fieldgelelectrophoresispaternofarmA andqnrb-producing E.coliandK.pneumoniae isolatesshowedpolyclonalpaterns. -24-
Ⅳ. 고찰 Aminoglycoside 항균제는다양한그람양성과음성세균에효과적인항균제로주요감염질환에널리사용되고있으며, 구성성분중 cyclitol 의종류에따라서 streptomycin 등의 streptidine 항균제와 kanamycin 및 gentamicin 등의 deoxystreptamine 항균제등으로분류된다 2. 세균의 aminoglycoside 내성기전에는작용표적인 ribosome 의돌연변이 16, 막투과성의저하 17 또는 active eflux 18 및 aminoglycoside 의일부구조를변경시켜약제를불활성화하는 aminoglycoside-modifying enzyme 의생성등이알려져있었으나, 근래에 16S rrna methylase 에의한 aminoglycoside 내성기전이보고되었다. 16S rrna methylase 에의한 aminoglycoside 내성은 aminoglycoside 를합성하는 Actinomycetes 균종에서처음발견되었으며, 세균이생성하는 aminoglycoside 항균제로부터자신을보호하는역할을한다. Actinomycetes 균종에의해생성되는 16S rrna methylase 는 N1 지역의 A1408 부위를 methylation 하여,gentamicin 을 제외한 kanamycin 및 tobramycin 등에대한내성을유발하는것과 N7 지역의 G1405 부위를 methylation 하여 arbekacin,amikacin 및 gentamcin 을포함한모든 4,6-disubstituted deoxystrepamtine 항균제에대한고도내성을일으키는것으로분류된다 19-21. 최근까지 16S rrna methylation 에의한 aminoglycoside 내성은그람음성간균에존재하지않는것으로생각되었으나,Galimand 등에의해서 arma 가 Yokoyama 등에의해서 rmta 가각각보고되었고 3-4, 현재까지보고된모든 16S rrna methylase 는 N7 지역의 G1405 부위를 methylation 하는것으로알려져있다. 그람음성간균에서분리된 16S rrna -25-
methylase 의기원에대해서는아직명확하지않으나, 가장처음보고된 arma 와 Actinomycetes 균종에서보고된 16S rrna methylase 의상동성이 37-47% 로상이하고,rmtA,rmtB,rmtC 및 rmtd 역시마찬가지로기존의 16S rrna methylase 와는낮은상동성을나타내는것으로보아알려지지않은기원으로부터유래되었을것으로생각되고있다 3-7. 16S rrna methylase 유전자의전이에대해서는아직알려진바가많지않다. Galimand 등은유럽각지에서분리된다양한 Enterobacteriaceae 에 arma 유전자가존재하며, 내성유전자가 IncL/M plasmid 의 Tn1548 에위치하여그람음성간균사이에서쉽게전파될수있음을보고하였다 21.rmt 유전자역시일부에서전이가가능한유전자구조에위치함이알려졌는데,Yamane 등은 rmta 유전자가 Tn5041 같은일부유전자구조에의해서다른균주로전달됨을 22,Wachino 등은 rmtc 의전파에 ISEcp1 이관여함을보고하였다 23. 이러한여러내성전달기전에도불구하고 16S rrna methylase 의역학적분포에관한보고는많지않다.Yan 등은 2004 년에대만에서분리된 E.coli2,559 주와 K.pneumoniae 1,624 주를대상으로 arma 양성균주와 rmtb 양성균주가 E.coli 중각각 12 주와 2주,K. pneumoniae 중각각 16 주와 5주가있었고, 양성율은 E. coli0.5% 및 K.pneumoniae 1.3% 로보고하였다 8.Bogaerts 등은 2000 년부터 2005 년사이에벨기에의 2개병원에서수집한 15,386 주의그람음성간균을대상으로시행한연구에서 K.pneumoniae 10 주,E.coli4 주, E.cloacae 1주,E.aergenes2 주및 C.amalonaticus1 주에서 arma 유전자를 E.coli1 주에서 rmtb 유전자를검출하여총 19 주 (0.12%) 의 16S rrna methylase 생성균주를보고하였다 24. 또한 Yamane 등 -26-
은일본전역의 169 개병원에서수집한 87,626 주의그람음성간균중, P.aeruginosa14 주 (0.08%),E.coli3 주 (0.02%),Klebsiela 균종 1 주 (0.008%),Enterobacter 균종 2주 (0.03%),Acinetobacter 균종 4주 (0.13%) 및 Proteus 균종 2주 (0.08%) 에서 26 주 (0.03%) 가 16S rrna methylase 를생성하였고, 유전형분포는 rmta 14 주,armA 9 주,rmtB 1주및 rmtc 2주이었음을보고하였다 25. 본연구에서는 2,722 주의그람음성간균을시험하여 123 주의 16S rrna methylase 양성세균을검출하였고, 양성율은 4.5% 로기존의보고에비해높은결과를나타내었다. 특히 K.pneumoniae 의양성율이세브란스병원 11% 및명지병원 21% 로다른균종에비하여높았으며, 기타균종의양성율은병원별로 0.5% 부터 14% 까지다양하였다. 16S rrna methylase 를생성하는균종의종류는기존에보고되었던.E.coli,K. pneumoniae,k.oxytoca,c.freundi,e.aergogenes,e.cloacae,p. mirabilis,providenciaretgeri,p.stuarti 및 Acinetobacter 균종이대부분이었으나,C.koseri(armA) 및 Morganela morgani(arma) 같은 Enterobacteriaceae 와 Achromobacter xylosoxidans (rmta) 및 S.maltophilia(armA) 같은포도당비발효그람음성간균에서처음으로 16S rrna methylase 유전자를검출하였다. 이는국내에서분리되는임상균주의 16S rrna methylase 생성균주의비율이외국에비하여월등히높을뿐아니라, 기존의보고보다다양한균종으로확산되고있음을나타내는것으로생각되었다. PCR 및염기서열분석을통해확인한 16S rrna methylase 의유전형은 123 주중,armA 113 주 (92%),rmtA (0.8%) 및 rmtb 5주 (4%) 으로,armA 유전자가대부분을차지하여이등 9 및박등 26 이보고와일치하였고,rmtA 가주로분리되는일본과는다르게 arma 가흔 -27-
한유럽과유사한양상을나타내었다.16S rrna methylase 의유전형이지리적으로가까운일본보다유럽과유사한양상을나타낸이유에대해서는추가적인연구가필요할것으로판단된다. 또한기존에는국내에서드물게보고되던 rmtb 유전자 9,26 가 9균주 (8%) 에서검출되어이전에비해 rmtb 유전자의확산이증가했음을알수있었다. rmtb 유전자의확산원인은다양하나, 최근중국에서보고한바에의하면 aminoglycoside 를먹이에혼합하여사육한돼지에서분리된 E. coli 의 32% 가 rmtb 유전자를가지고있다고하여 27, 환경에서존재하는 rmtb 유전자의전파를주의해야할것으로생각되었다. 또한 16S rrna methylase 에관한기존의모든보고에서는한균주에서하나의 16S rrna methylase 유전자만이보고되었으나, 본연구에서는 4 균주에서 arma 와 rmtb 를동시에생성하는것을확인할수있었다. 이들균주의분자유전학적인특성에대해서는추가적인연구가필요할것으로생각된다. 유전형의변이를관찰하기위해 10 주의 arma 양성균주와 9주의 rmtb 양성균주에대해시행한염기서열분석에서는모두동일한염기서열을보여, 유전형의분화는아직일어나지않는것으로판단되었다. 16S rrna methylase 를생성하는균주는임상적으로유용한모든 aminoglycoside 에고도내성을보이는것외에도다양한항균제에다재내성을보이는것으로알려져있다.16S rrna methylase 와흔히동반되는내성기전은 ESBL 과 PABL 에의한 β-lactam 항균제내성이다.Galimand 등에의하면유럽에서분리되는 arma 유전자양성균주의모두에서 CTX-M 형의 ESBL 유전자가검출됨을알수있고 21,Yan 등의보고에서도 CTX-M-3,CTX-M14,SHV-5 등의 ESBL 유전자와 CMY-2 같은 PABL 유전자가높은빈도로검출된다고하 -28-
여 8,16S rrna methylase 를생성하는대부분의균주가 β-lactam 항균제에내성임을보고하였다.Golebiewski 등은 CTX-M-3 유전자와 arma 유전자양성인균주에대한분자유전학적인분석에서두내성유전자는동일 plasmid 에존재하지만멀리떨어진위치에존재함을보고하였다 28. 본연구에서도 16S rrna methylase 양성균주는 ceftazidime 및 cefoxitin 에대한내성율과 ESBL 생성양성율이음성균주에비해서높았다. 국내에서분리되는 16S rrna methylase 생성균주가 CTX-M 형의 ESBL 생성주인지에대해서는추가적인분석이필요하지만, 국내에서분리되는 K.pneumoniae 에서가장흔한 ESBL 유전형이 SHV-12 으로외국과는다른양상일수도있을것으로생각된다 29. 한편일부균종에서는 carbapenemase 와 16S rrna methylase 를동시에생성하는균주가보고되었다.Yu 등의보고에의하면중국전역의 19 개병원에서수집한 carbapenem 내성 A.baumanni342 주중에서 arma 생성균주는 221 주 (65%) 이었고, 크게 3종류의 pulsotype 으로분류되었으나,MBL 생성균주는없었다 30.Doi 등은미국 Pennsylvania 에서분리된 5주의 arma 생성주중에서 2주가 OXA-23 을생성하고 carbapenem 에고도내성을보였으며, 이들은유전적으로연관되어있다고하였다 31. 또한 MBL 인 SPM-1 과 rmtd 를동시에생성하는균주에의한집단감염도브라질에서보고되어, 16S rrna methylase 를생성하는일부균주가 carbapenemase 를동시에생성할수있음을증명하였다 32. 본연구에서는 carbapenem 내성인 P. aeruginosa 중 1주에서 arma 가분리되었으나. modified-hodge 법과 imipenem-edta doubledisk synergy 법에서음성으로 carbapenemase 를생성하는균주는없었으며,16S rrna methylase 를생성하는 Acinetobacter 균종중에서 carbapenem 에내 -29-
성인균주는없었다. 그러나국내에서 2003 년과 2005 년에국내 1개대학병원에서분리된 Acinetobacter 균종중,16S rrna methylase 를생성하는균주의대부분이 carbapenem 에내성이었다는보고도있어 9, 이에대한추가연구가필요할것으로판단된다. 16S rrna methylase 생성균주는 levofloxacin 에대해서도높은내성율을나타내었다.Fluoroquinolone 에대한내성기전으로는세균염색체의변이에의한 quinolone-resistance determining region (QRDR) 의변화 33 와 eflux pump 의증가 34 및 porin 의감소 35 등이주로알려져있다. 그러나최근에 plasmid 를통해다른균주로전파가능한 fluoroquinolone 내성기전이보고되었는데,pentapeptide repeat family 에속하는 Qnr 단백질에의한내성기전 11 과 plasmid-mediated activeeflux (qepa gene) 에내성기전 12 이여기에속한다.Qnr 단백질에의한내성은 qnra,qnrb 및 qnrs 유전자에의해서일어나며, 각유전형별로호발하는균종에차이가있으며, 일부에서는 ESBL 유전자와함께검출되는경우가흔하다 10. 본연구에서는 arma 를생성하는 K.pneumoniae 의 91% 에서 qnrb 유전자가검출되어매우높은연관성을보여주었다. 이는 arma 와 qnrb 를동시에갖는 K. pneumoniae 의확산에의한것으로생각할수도있으나 PFGE 에서다양한유형을보여,armA 와 qnrb 의확산이내성유전자에의한수평확산일가능성이높음을알수있었다.qepA 유전자는 E.coli 에서처음보고되었으며,rmtB 유전자와함께 transposable element 에존재한다. 본연구에서도 qepa 유전자양성인 3주의균주중,2 주에서 rmtb 가검출되어유사한양상을보여주었다. qepa 에의한 fluoroquinolone 내성은현재까지는매우낮으나 rmtb 가확산될경우, 동시에확산될가능성이있어주의가필요할것으로판단되었다. -30-
Ⅴ. 결론국내에서 16S rrna methylase 유전자에의한 aminoglycoside 고도내성인그람음성간균의양성율은세브란스병원 4% 및명지병원 5% 로외국에비하여흔하였다. 또한 16S rrna methylase 를생성하는균종의종류는기존에보고되었던.E.coli,K.pneumoniae,K. oxytoca, C. freundi, E. aergogenes, E. cloacae, P. mirabilis, Providencia retgeri,p.stuarti 및 Acinetobacter 균종이대부분이 었으나, C. koseri (arma) 및 M. morgani (arma) 같은 Enterobacteriaceae 와 A. xylososidans (rmta) 및 S. maltophilia (arma) 같은포도당비발효그람음성간균에서도 16S rrna methylase 생성유전자를검출되어, 다양한균종으로여러내성유전자가전파되고있을것으로생각되었다. 또한 16S rrna methylase 에의한 aminoglycoside 고도내성 E. coli 의 extended-spectrum β -lactamase 와 AmpC β-lactamase 양성율이각각 70% 및 plasmid-mediated quinolone 내성유전자양성율이 40% 이었고,K. pneumoniae 의 extended-spectrum β-lactamase 양성율 59%,AmpC β-lactamase 양성율 92% 및 qnr 내성유전자양성율 93% 이었으며, 기타 Enterobacteriaceae 균종의 extended-spectrum β-lactamase 양성율이 50% 및 plasmid-mediated quinolone 내성유전자양성율이 47% 로 16S rrna methylase 생성균주중다제내성균주가흔함을알수있었다. -31-
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< 영문요약 > Abstract Molecularandphenotypicalcharacteristicsof 16S rrna methylaseproducinggram-negativebacili HyukminLee DepartmentofMedicineorMedicalScience TheGraduateSchool,YonseiUniversity (DirectedbyProfessorKyungwonLee) Aminoglycoside antibiotics,widely used in clinicalsetings as monotherapy and combination therapy, bind to 16S rrna of bacterial ribosome irreversibly and interfere with the protein synthesis.recently a novelplasmid-mediated resistantmechanism thatconferred methylation of16s rrna and high-levelresistance to 4,6-substituted deoxystreptamine antibiotics was reported.but thereportto this novelresistantmechanismswererare in Korea. The aims ofthis study were to determine the prevalence ofthe 16S rrna methylase genes in clinicalisolates ofgram-negative rods such as Enterobacteriaceae, Pseudomonas aeruginosa and Acinetobacterspeciesand to characterizethecoresistanceto other -39-
antibioticssuchas β-lactamsandfluoroquinolones. Consecutive non-duplicate gram-negative bacili were isolated from clinicalspecimens ata Korean secondary hospitalfrom July 2006 to June 2007 and a tertiary-care hospitalfrom Aprilto June 2007.The species were identified by conventionalmethods orby using the Vitek systems. The antimicrobialsusceptibility was tested by the CLSIdisk difusion and agardilution method using ceftazidime,cefoxitin,imipenem,arbekacin,amikaicin,gentamicin, tobramycin and levofloxacin. Extended-spectrum β-lactamase (ESBL)production wasconfirmed by doubledisk synergy testand the production of plasmid-mediated AmpC β-lactamase (PABL) was analyzed by cefoxitin susceptibility.imipenem-nonsuceptible isolates were tested for carbapenemase production by the modified-hodge and imipenem-edta double disk synergy test. Polymerasechain reaction was performed to detectthe 16S rrna methylase genes (arma, rmta, rmtb,rmtc, and rmtd) in the arbekacin-resistant isolates and plasmid-mediated quinolone resistantgenes (qnra,qnrb,qnrs,and qepa) were detected in 16S rrna methylase-positive isolates. To analyze the genetic relationships,pulsed-field gelelectrophoresiswasperformed in 16S rrna methylase and plasmid-mediated quinolone resistance gene-positiveisolates. 16S rrna methylasegenesweredetectedin 2(<1%)isolatesof E.coli,24 (11%)K.pneumoniae,1 (2%) K.oxytoca,4 (10%) Citrobacterspp.,2(4%)Enterobacterspp.,2(4%)S.marcescens, -40-
1(20%)Achromobacterxylosoxidans,11(10%)Acinetobacterspp., and 1 S.maltophilia attertiary-care hospital,8 (1%)E.coli,51 (21%) K. pneumoniae, 3 (8%) Citrobacter spp., 2 (2%) Enterobacterspp.,4 (8%)S.marcescens,2 (4%)P.miriabilis,1 (<1%)P.aeruginosaatsecondary-carehospital.armA aleleswere detected 90% of 16S rrna producing isolates at tertiary-care hospital and 93% of isolates at secondary-care hospital. rmtb genesweredetected in 2 E.coli,2 K.pneumoniae,2 Citrobacter spp.and 3Providenciaspp.,and 4ofrmtB-positiveisolateswere positive for arma genes, simultaneously. In 16S rrna methylase-producing Enterobacteriaceae, the resistance rates of cefoxitin and levofloxacin were very high (85% and 81%) compared with methylase non-producing isolates(68% and 36%). The positive rates ofesbl and PABL production were 59% and 92% in16s rrna methylase-positiveisolatesand43% and64% in 16S rrna methylase-negative isolates and 91% of 16S rrna methylase-producing K.pneumoniae werepositiveforqnrb genes. qepa genes, plasmid-mediated quinolone eflux pump, were detected in rmtb-positve E.coli and C.freundi and one 16S rrna methylase-negativee.coli.therewasnombl producersin 16S rrna methylase-producing Pseudomonas and Acinetobacter species.pulsed-field gelelectrophoresis showd polyclonalpaterns between16s rrna methylase-producing isolates. In conclusion,thenovelaminoglycosideresistantmechanismsby 16S rrna methylasewasmoreprevalentandwidely distributedin -41-
gram-negativebaciliin Korea,otherresistantmechanismssuchas ESBL,PABL and qnrwere commonly associated with 16S rrna methylaseresistanceingram-negativebaciliinkorea. Key Words :16S rrna methylase,arma,qnrb,aminoglycoside, gram-negativebacteria -42-