Journal of Bacteriology and Virology 2006. Vol. 36, No. 2 p.99 107 Newcastle Disease Virus 의 F 와 HN 유전자재조합 DNA 제조및면역원성 충남대학교수의과대학, 국립수의과학검역원 1, 충남대학교형질전환복제돼지연구센터 2 김지영 초가기 박종현 1 서상희 박창식 2 김명철 전무형 * Construction of Recombinant DNA with F and HN Genes of Newcastle Disease Virus and Its Immunogenicity Ji-Young Kim, Jiaqi Chu, Jong-Hyeon Park 1, Sang-Heui Seo, Chang-Sik Park 2, Myung-Cheol Kim and Moo-Hyung Jun * College of Veterinary Medicine, Chungnam National University, Daejeon 305-764, 1 National Veterinary Research and Quarantine Service, Anyang, 430-824, 2 Research Center for Transgenic Cloned Pigs, Chungnam National University, Daejeon 305-764, Korea Received : April 25, 2006 Accepted : June 12, 2006 Recombinant DNA vaccines, based on plasmid vectors expressing an antigen under the control of a strong promotor, have several advantages over traditional vaccines. They have been shown to induce a full spectrum of immune responses for humoral and cellular systems and to secure the higher safety and the simplicity of administration. Thus, establishment of DNA vaccines against Newcastle disease virus (NDV) in poultry has been widely investigated using various virus strains and vector systems. In this study, the F and HN genes of NDV CBP-1 strains isolated from diseased pheasants and attenuated by serial passages in egg embryos were cloned using pslia vector and constructed two recombinants of pslia-tsf and pslia-tshn. The recombinant plasmids were transfected into COS-7 cell and the expression of HN and F proteins were verified by immunofluorescence, SDS-PAGE and Western blot. The recombinant plasmids were injected intramuscularly and intradermally into C57B/6 mouse and a significant increment of HN and F antibodies was detected by ELISA. According to the results, it was implicative that the recombinant DNA could be utilized for development of recombinant DNA vaccine for NDV. Key Words: NDV vaccine, F and HN gene, Recombinant NDV vaccine 서 Newcastle disease virus (NDV) 는뉴캣슬병 (Newcastle disease; ND) 의원인체로써 family Paramyxoviridae의 genus Avulavirus에속하며, 병원성독주는닭을비롯한조류에서높은이병율과폐사를일으키며, 사람에감염시결막염증세 * 교신저자 : 전무형. 305-764, 대전광역시유성구궁동 220, 충남대학교수의과대학미생물학교실 Phone: 042-821-6753, Fax: 042-821-6753, e-mail: mhjun@cnu.ac.kr 론 를동반하는인수공통전염병의병원체이다 (1,16,17). NDV는 150~300 nm 크기로다양한형태를나타내며, 비리온은외피막 (envelope) 을가지며, herringbone-shaped, 나선대칭형뉴클레오캡시드를가진다. 유전자는 negative-sense, single-stranded RNA이며 15~16 kb 크기로구성되며, NP (nucleoprotein), P (phosphoprotein), M (matrix protein), F (fusion protein), HN (hemagglutinin-neuraminidase), 및 L (RNA-directed RNA polymerase) 의 6가지단백을암호하는유전자들로구성되어있다 (1,18). 이중바이러스외피막에존재하는 F와 HN 단백은 NDV의병인기전과면역방어기전에중요한역할을한다 99
100 김지영, 초가기, 박종현, 서상희, 박창식, 김명철, 전무형 (1,18,20,27). F 단백은바이러스외피막에있는두가지돌기중에서적은것으로써, NDV가세포침입전단계에서바이러스와세포막이융합되게하며, 뉴클레오캡시드와그부속단백이세포속으로들어가게하여바이러스의감염을돕는다. 또한침입된뉴클레오캡시드를해체하고, 감염세포와세포간에융합이일어나도록유도하여합포체를형성하게하는역할을한다 (1,35). 또한 NDV의복제과정중합성된 F 단백 F 0 는세포내효소에의해 F 1 과 F 2 아단위로절개되며, F 단백의이러한 cleavage activation은 NDV의병원성과밀접하게관련이있다 (1,19,29). HN 단백은바이러스외피막에있는돌기중에서큰돌기로써혈구응집소와뉴라미니다제 (neuraminidase) 의기능을한다. HN은비리온을세포표면에존재하는 sialic acid-함유수용체에부착시킴으로써 NDV가다양한동물의적혈구와응집반응을일으키게하며, F 단백을중계하여바이러스가세포에쉽게침입할수있도록도와주는기능을한다. 또한뉴라미니다제가활성화되면세포수용체의파괴기능이있다. 그러므로 HN은 NDV의감염과병원성발현에중요한역할을하는물질이다 (15,29,30,35). ND는국내양계농장에서빈번히발병되어많은경제적손실을야기하는질병이며, 본병방역을위해서는백신접종이필수적이다. 현재국내양계장에서사용할수있는 ND 백신은약독생독백신과불활화백신이있으며, 이두백신에대한장점과단점이다각도로평가되고있다. 한편기존백신의결점을보완하기위해국내외연구진들에의해 subunit vaccine과재조합백신에대한연구가수행중에있다 (12,14). 최근 NDV에대한분자유전학적연구를바탕으로병원성과밀접한관계를가진 F 및 HN 유전자를 vaccinia virus (20), fowl pox virus (14,33), Marek's disease virus type 1 (25), human cytomegalovirus (34), baculovirus (6,18,19), turkey herpesvirus (23) 등다양한백터에재조합하여항원을발현시키고, 이를응용한유전자재조합백신생산에대한연구가추진중에있으며, 닭생체내에접종시면역원성이인정된다고보고된바도있다 (13,18,23,28). 또한편에서는보다시술이간편하고면역원성이높은 "the third generation vaccine" 이라고도불리는핵산또는 DNA 백신을연구하고있으며 (9,21,24,32,34), herpes viruses, rabies virus, rotavirus, paramyxoviruses 등동물바이러스에대한 DNA 백신이제조되고효능에대한시험결과가보고된바있다 (2,3,9). 본연구에서는 ND에이환된꿩에서분리하여부화계란에서 250대계대배양한 NDV CBP-1 주의 F와 HN 유전자를 RT-PCR 로증폭하고 CMV (cytomegalovirus) promoter와 BGH (bovine growth hormone) poly (A) signal 을지닌 pslia vector 에재조합하여 DNA 백신을제조하였다. 또한제조된 psliatsf와 pslia-tshn 재조합 DNA를 COS-7 세포에 transfection 하여 F와 HN 단백발현을확인하고, C57B/6 마우스에접종하여면역원성을측정하였다. 재료및방법 1. 바이러스 ND에이환된꿩에서분리하여부화계란에서 250대계대배양한 NDV CBP-1주 (7) 를사용하였으며, 생독백신주인 Hitchner B1과 LaSota-IB를참조주로사용하였다. NDV CBP-1주는 9~10일령된 SPF 부화계란의요막강내접종방법에의해증식하였다. 2. Primer 제조 GenBank에서검색하여얻은 B1주 (Accession# U37187) 의 F와 HN 유전자의염기서열과 Chang et al (6,7) 의방법을참고하여 Clone Manager6, version 6.00 (Scientific & Educational Software) 을이용하여작성하였다. F 유전자 (1,710 bp) 와 HN 유전자 (1,795 bp) 를증폭하고클론닝하기위해각각 BamHI site ( 밑줄부분 ) 를삽입하여 F 유전자에대해 F1 forward primer; 5'-GATTCTGGATCCCGG- TTGGCGCTTTCTAGG-3' (11 nt - 40 nt) 와 F4 reverse primer; 5'-CGCGGATCCCATCTGTGTTCACATTTTTGT-3' (1,687 nt - 1,717 nt) 를제조하고, HN 유전자에대해 HN1 forward primer; 5'-CGCGGATCCCGACAGCAGTCCTCAGTCATG-3' (103 nt - 123 nt) 와 HN4 reverse primer; 5'-CGCGGATCCACTC- AACTAACCAGACCTGGC -3' (1,840 nt - 1,860 nt) 를제조하여 RT-PCR 에사용하였다. 3. 바이러스 RNA 추출바이러스가증식된장뇨막강액 400 µl에 500 µl의 denaturing solution [Sol D: 4M guanidium isothiocynate (ultra pure, BRL), 25mM sodium citrate (ph 7.0, Fisher Scientific), 0.5% N-laurylsarcosine (Sigma), 0.1 M 2-β-mercaptoethanol (Sigma)] 을첨가하여 37 에서 1시간반응시킨후, 2 M sodium acetate (ph 4.5) 50 µl와 600 µl의 P/C/I (phenol/chloroform/isoamylalcohol ; 25 : 24 : 1, Sigma) 를넣고교반기로잘혼합시킨후실온에서 14,000 g로 10분간원심하였으며상층액을새시험관에옮겨, 다시여기에 550 µl의 P/C/I를첨가하여교반기로잘혼합한후, 실온에서 14,000 g로 10분간원심시킨다음, 상층액 750 µl를새시험관에넣었다. 그리고동량의 isopropanol (Sigma) 을넣어실온에서 10분간정치시킨후, 14,000 g로 4 에서 20분간원심하여 RNA를침전시켰다.
Newcastle Disease Virus 의 F 와 HN 유전자재조합 DNA 제조및면역원성 101 시험관의상층액을제거하고다시 Sol D와 isopropanol을각각 300 µl를넣고실온에서 10분간정치시키고 14,000 g 에서 20분간원심하여얻은 RNA를다시침지시킨후, 75% 의에타놀로두번세척하고실온에서건조한다음 0.1% 의 DEPC용액 (10 µl) 에녹였다. 4. Reverse transcription - polymerase chain reaction (RT-PCR) 추출된 viral RNA template 20 µl에 F와 HN 유전자에대한 F1와 HN1 primer (50 pmol/µl) 를각각 1 µl씩첨가하고 70 에서 30분간처리하고, 4 에서 5분간반응시켜 template에 primer를접합하였다. 그리고이반응물에 0.1% 의 DEPC용액을더첨가하여 RT-Premix (Bioneer, Korea) 와잘혼합한다음, automated thermal cycler (Perkin Elmer Cetus Co., USA) 에서 37 에서 60분, 42 에서 60분간반응하여 cdna를합성하였다. 유전자의증폭은 Expand long Template PCR system kit (Roche, Germany) 를사용하여수행하였다. 앞서합성한 cdna 5 µl에 F와 HN 유전자에대하여각각 F1 (F), F4 (R) primer와 HN1 (F) 와 HN4 (R) primer를각각 1 µl (50 pmol/µl) 씩넣고 Long Template PCR system buffer1 5 µl와 10 mm dntp 1.75 µl, Polymerase mix 1 µl, 멸균증류수 35 µl를첨가하여서 automated thermal cycler 로 F 유전자는 93 에서 2분간예비열처리하고, 93 에서 10초, 50 에서 30초, 68 에서 3분동안반응하는과정을 10회반복하고, 93 에서 10 초, 50 에서 1분, 68 에서 3분동안반응하는일련의과정을 20회반복하면서 extention time을매사이클마다 20초씩추가하여반응시켰다. HN 유전자는 93 에서 2분간예비열처리하고, 93 에서 10초, 46 에서 30초, 68 에서 3분동안반응하는과정을 10회반복하고, 93 에서 10초, 46 에서 30초, 68 에서 3분동안반응하는일련의과정을 20회반복하면서매사이클마다 annealing time을 2초씩, extention time은 20초씩추가하여반응시켰다. PCR product는 1.2% ethidium bromide agarose gel을이용하여전기영동으로분석하였고 Image analyzer (Pharmacia, Sweden) 로판독하고분석하였다. 5. cdna 클론닝클론닝백터로 CMV promoter와 BGH poly (A) signal을가지고있는 pslia plasmid (Veterinary Infectious Disease Organization, Canada) 를사용하였으며, F와 HN 유전자를클론닝하기위해 BamHI (TaKara, Japan) 으로처리하여 linear vector로만들고자가융합을억제시키기위하여 37 에서 1 시간 calf intestine alkaline phosphatase (Takara, Japan) 로처리 하였다. 증폭된 F와 HN 유전자의 PCR product를 30 에서 1시간 BamHI (TaKara, Japan) 으로처리하여준비한 pslia plasmid에융합하였고, 이렇게하여얻어진플라스미드를각각 pslia-tsf와 pslia-tshn이라하였다. E. coli DH5α competent cell을재조합 pslia-tsf와 psliatshn plasmid로형질전환하여클론화한다음, 앰피실린이포함된 5 ml의 LB broth에접종하고 37 에서 18시간진탕배양하고 QIAGEN plasmid purification kit (QIAGEN, USA) 를이용하여 plasmid DNA를추출하였다. 유전자의삽입여부를확인하기위해재조합플라스미드를 BamHI, EcoRI, PstI, 및 EcoRV로처리하여삽입유전자를확인하였다. 6. Transfection Lipofectamine plus (GIBCO BRL, USA) 를사용하여 psliatsf와 pslia-tshn plasmid를 COS-7 cell에 transfection 하였다. Transfection 하기전에 COS-7 세포는트립신처리하고세포수가 2 10 5 개 /200 µl가되게하여마이크로플레이트 (96 wells) 에주입하였다. Transfection 과정을약술하면시험관에 plasmid DNA를 PLUS reagent (plasmid DNA 1 µg, PLUS reagent 6 µg and Opti-MEM 100 µl) 와혼합하여실온에서 15분동안반응시켰다. 다른시험관에 lipofectamine 4 µl를 Opti- MEM 0.8 ml에희석하고, 이두용액을혼합하고실온에서 15분간반응시킨다. 이반응시간동안세포가들어있는 well에 Opti-MEM을넣고여기에반응시킨 DNA-PLUSlipofectamine complex를한방울씩잘섞이게떨어뜨린후 5% CO 2 incubator (37 ) 에서 3시간반응시킨다음, 새 MEM 배지 (10% 우태아혈청가 ) 를더첨가하여 24시간반응시킨후 pslia-tsf와 pslia-tshn plasmid가 transfection 되었는지를시험하였다. 7. 발현단백확인 1) 간접형광항체법 pslia-tsf와 pslia-tshn plasmid를 transfection 하여 48시간지난 COS-7 세포를 phosphate buffered saline (PBS, ph 7.2) 으로 1회세척한다음 80% 아세톤으로 5분간고정한후, PBS로 1번세척하고 F와 HN 단백에대한각각의 anti- NDV monoclonal antibody (mouse ascites, Jeno Biotech. Korea; 1:500) 와 37 에서 1시간반응시켰다. 그리고 PBS로 3회세척하고 2차항체인 FITC-conjugated anti-mouse antibody (Cappel. USA; 1:100) 와 37 에서 1시간반응하고다시 PBS로 5 회세척한후, 형광현미경으로관찰하였다. 2) SDS-PAGE pslia-tsf, pslia-tshn plasmid를 transfection하여 48시간지난 COS-7 세포를수확하여 1,200 rpm에서 3분동안원침
102 김지영, 초가기, 박종현, 서상희, 박창식, 김명철, 전무형 Table 1. Immunization of the mice against recombinant DNA with F and HN genes Groups * Immunogens No. of mouse Routes Dose at weeks (µg) 0 2 4 6 I pslia-tsf 5 IM 100 100 100 Sacrificed II pslia-tshn 5 IM 100 100 100 Sacrificed III pslia-tsf 5 ID 100 100 100 Sacrificed IV pslia-tshn 5 ID 100 100 100 Sacrificed V Control 5 IM 100 100 100 Sacrificed *Mouse: C57BL/6, IM: Intramuscular injection in quadriceps muscle. ID: Intradermal injection on tail. Control group was injected intramuscularly with pslia alone. 한후침전세포를 100 µl의 PBS에부유시킨후 SDS reducing sample buffer [0.5 M Tris-HCl 1 ml, 10% SDS (ph 6.8), 2-mercaptoethanol 0.4 ml, 0.05% bromphenol blue, glycerol 2 ml, H 2 O 7 ml] 300 µl를첨가하여 95 에서 5분동안끓인후, 12,000 rpm에서 3분동안원침하여얻은상층액을시험하였다. 준비한시료를주입하고, tris-glycine electrophoresis buffer 를사용하여 80 V에서 30분동안 prerunning 시킨후, 150 V 에서 2시간정도전기영동하였다. 분자량을측정하기위해 prestained protein molecular weight standards (GibcoBRL. USA) 를사용하였고, 전기영동이완료된겔을분리하여염색액 [Coomassie Brilliant Blue R-250 0.25 g, methanol 50 ml, H 2 O 40 ml, acetic acid 10 ml] 에 1시간염색한후탈염색액 [methanol 30%, H 2 O 60%, acetic acid 10%] 으로탈색시켜관찰하였다. 3) Western blot XCell II Blot Module (Invitrogen, USA) 과 Vectastain ABC reagent kit (Vector Lab., USA), DAB substrate kit (Vector Lab., USA) 를이용하였다. SDS-PAGE가완료된겔과니트로셀루로즈막 (Osmonics, USA) 을 25 V로 3시간불로팅시킨후, 니트로셀루로즈막을꺼내어 blocking solution [10 mm Tris-Cl (ph 8.0), 150 mm NaCl, 0.05% (v/v) Tween 20, 5% Skim milk (Difco, USA), 5% Lacto-albumin (Difco, USA)] 에담가 4 에서 24시간반응하고, PBST [1.37 mm NaCl, 2.7 mm KCl, 10 mm Na 2 HPO 4, 2 mm KH 2 PO 4, 0.05% (v/v) Tween 20] 로 2번세척하였다. 그다음각각 F와 HN 단백에대한 anti-ndv monoclonal antibody로 37 에서 1시간반응시킨후, 위와같은방법으로세척하고, biotinylated goat anti-mouse IgG [H+L] (Vector Lab., USA) 를 1시간, 그리고 Vectastain ABC reagent kit (Vector Lab., USA) 의 A와 B solution을 PBS에섞어 37 에서 1시간반응시켰다. 그리고 DAB substrate (5 ml) 로 5분동안반응한후멸균증류수를이용하여세척하였다. 8. 마우스접종및면역원성시험앞서작제한 pslia-tsf와 pslia-tshn plasmid로형질전환된 E. coli (DH5α) 를앰피실린 (100 µg/ml) 이첨가된 LB broth (1l당 Bacto-tryptone 10 g, Bacto-yeast extract 5 g, NaCl 10 g, ph 7.0) 에대량배양하여 plasmid mega kit (QIAGEN, USA) 로플라스미드 DNA를추출하였고, 자외선분광기로 260 nm에서측정하여정량하고 -20 에저장하였다. 추출된플라스미드의순도 (A260/280 ratio) 는 1.8~1.9이었으며, 접종시안전성을높이기위하여 triton X-114 (Cotten et al., 1994) 로처리하여 lipopolysaccharide를제거하였다. C57B/6 마우스 (4~8주령) 를 Table 1과같이 5개군으로나누고, pslia-tsf 와 pslia-tshn plasmid를근육과피내에접종하였다. 근육접종군은왼쪽과오른쪽대퇴근에 50 µg씩 1마리당 100 µg 을 2주간격으로 3차례접종하였고, 피하접종군은 1마리당 100 µg씩을 2주간격으로꼬리부위피내에 3차례접종하였으며, 대조군에는 pslia 100 µg을근육접종하였다 (Table 1). 6주째에 Microtainer Brand Serum Separator tube (Becton Dickinson, USA) 를사용하여꼬리에서채혈하였다. 채혈된혈액은 ELISA (Avian Newcastle Disease Virus Antibody ELISA kit, Jeno Biotech.) 를이용하여면역원성을측정하였다. NDV 항원이흡착된 96 well 마이크로플레이트에가검혈청 (1:100) 100 µl를넣고 37 에서 1시간반응시킨후, washing buffer 200 µg로 3회세척하고, Peroxidase-labeled horse anti-mouse IgG (H+L) (Vector, USA) (1:1000) 를 100 µl 넣고 37 에서 1시간반응시켰다. 그후, 같은방법으로 3회세척하고 O-phenylenediamine 2HCl이첨가된발색제 (TMB substrate) 를 100 µl 넣고실온에서약 10분간반응시키고정지액을넣어발색을중지시킨후, Emax microplate reader (Molecular devices, USA) 의 450 nm에서흡광도 (OD 450 ) 를측정하였다. 양성대조군으로 NDV F와 HN 단백에대한 monoclonal antibody (1:5000) 를사용하였다.
Newcastle Disease Virus 의 F 와 HN 유전자재조합 DNA 제조및면역원성 103 A B Figure 1. Amplification patterns of NDV F gene (A) and HN gene (B) by the RT-PCR. Lane M: 1 kb DNA ladder marker, lane 1: CBP-1, lane 2: Hitchner B1, lane 3: LaSota-IB strain. A B Figure 2. Cleavage patterns of F gene (A) and HN gene (B) inserted into pslia by various restriction endonucleases. Lane M: 1 kb DNA ladder marker, lane 1: BamHI, lane 2: EcoRI, lane 3: PstI, lane 4: EcoRV. 결 과 1. F 와 HN 유전자증폭과클론닝 NDV CBP-1주, Hitchner B1주, 및 LaSota-IB 백신주에서추출한 cdna로 F1 forward primer, F4 reverse primer 와 HN1 forward primer, HN4 revers primer를각각이용하여 RT-PCR 을수행한바, 증폭된 1,710 bp 크기의 F 유전자와 1,795 bp 크기의 HN 유전자에대한밴드가각각관찰되었다 (Fig. 1). 재조합 pslia-tsf와 pslia-tshn를 BamHI으로처리하여전기영동한결과 pslia-tsf에서 1.7 kb, pslia-tshn에서 1.8 kb 크기의뚜렷한 insert DNA와 5.2 kb 크기의 pslia의백터 DNA를확인할수있었다 (Fig. 2). 또한 F와 HN 유전자에대한제한효소 cleavage patterns과 pslia에삽입된상태를확인하기위해제한효소를처리한결과, pslia-tsf는 EcoRI 에서는 6,003 bp, 911 bp, 그리고 PstI에서는 6,714 bp, 200 bp 크기로추정되는밴드가각각관찰되었고, EcoRV에서는 6,914 bp 크기의단일밴드가확인되었다 (Fig. 2-A). psliatshn는 EcoRI에서 6,376 bp, 636 bp, PstI에는 5,394 bp, 923 bp, 466 bp, 219 bp 크기로추정되는밴드들이관찰되었으며, EcoRV에서는절단부위가관찰되지않았다 (Fig. 2-B). B Figure 3. Detection of F and HN proteins expressed by recombinant pslia-tsf and pslia-tshn by immunofluorescent assay using monoclonal antibodies. A: Control cells, B: pslia-tsftransfected COS-7 cells, C: pslia-tshn-transfected COS-7 cells. 2. pslia-tsf 와 pslia-tshn 의 transfection 과발현 pslia-tsf와 pslia-tshn를 COS-7 세포에각각 transfection하고 monoclonal antibody를사용하여면역형광항체시험을한결과, F 단백과 HN 단백의발현상태를확인할수있 A C
104 김지영, 초가기, 박종현, 서상희, 박창식, 김명철, 전무형 Figure 4. SDS-PAGE patterns of F and HN proteins in COS-7 cell transfected with pslia-tsf and pslia-tshn plasmids. Lane M: pre-stained protein marker, lane 1: pslia-tsf, lane 2: pslia, lane 3: Control, lane 4: pslia-tshn, lane 5: pslia, lane 6: Control. Figure 6. Comparison of ELISA values in the mice injected by intramuscular (IM) and intradermal (ID) routes with the pslia-tsf and pslia-tshn. ELISA values were measured at 6 weeks after immunization with the plasmids as shown in Table 1. I and II: injected intramuscularly, III and IV: injected intradermally, V (control): injected intramuscularly with pslia alone. 의하게높았으며, 근육접종군과피내접종군간비교에서 pslia-tsf를접종한군 (I, III) 이 pslia-tshn을접종한군 (II, IV) 보다더높게나타났다. 접종부위별비교에서는근육접종군 (I, II) 이피내접종군 (III, IV) 보다 ELISA value가높았다 (Fig. 6). 고 찰 Figure 5. Western blot analysis of F and HN proteins in COS-7 cell transfected with pslia-tsf and pslia-tshn plasmids. Lane M: pre-stained protein marker, lane 1: pslia-tsf, lane 2: pslia, lane 3: Control, lane 4: pslia-tshn, lane 5: pslia, lane 6: Control. 었다 (Fig. 3). 또한, SDS-PAGE 와 Western blot를수행한결과, F 단백에대한 55 kda의밴드와 HN 단백에대한 74 kda 의밴드를확인할수있었고, F와 HN 유전자가삽입되지않은 pslia와대조군에서는밴드가관찰되지않았다 (Fig. 4 & 5). 3. 마우스접종및면역원성 pslia-tsf와 pslia-tshn를각각 C57B/6 마우스 (4~8주령 ) 의대퇴근에 1마리당 100 µg씩 2주간격으로 3차례접종하였고, 같은방법으로 1마리당 100 µg씩 2주간격으로꼬리부위피내에 3차례접종하고, 6주째에채혈하여얻어진혈청을군별로합쳐서 ELISA를 3회수행하였다. 그결과 ELISA value는모든접종군 (I-IV) 에서대조군 (V) 보다유 NDV는닭에감염하여급성전염병을일으키는바이러스로써최근에는집단사육하고있는꿩과메추리에도감염하여피해를주고있다. 최근 ND 예방을위해사용되고있는백신의문제점을극복할수있는 subunit vaccine과재조합백신에대한연구가활발히진행중에있으며 (12,14,21,24), NDV에대한분자유전학적연구를바탕으로병원성과밀접한관계를가진 F 및 HN 유전자재조합백신과시술이간편하고면역원성이높은 DNA 백신에대한연구가추진되고있다 (13,18,23). 또한최근 PCR 법과특이유전자검출기법의효능성이확인됨으로써바이러스배양법에서 PCR 법으로진단법이개선되고있다 (6,7,25). 본연구에서는 ND에이환된꿩으로부터분리하여부화계란에서 250대계대배양한내열성 NDV CBP-1주를공시하여 RT-PCR 기법을확립하였고, ND 재조합 DNA 백신제조를위해 pslia에 F와 HN 유전자를재조합하고클론닝하여단백질의발현상태와제조된재조합 DNA 백신의면역원성을확인하기위한일련의연구를수행하였다. CBP-1주와 Hitchner B1주및 LaSota-IB 백신주에대하여단일 primer set를이용한 RT-PCR 을수행하였던바, 1,710 bp 의 F 유전자와 1,795 bp의 HN 유전자에대한 cdna를증폭할수있었으며, 이와같은결과는여러연구자 (5,6,7,8,25,
Newcastle Disease Virus 의 F 와 HN 유전자재조합 DNA 제조및면역원성 105 26,29) 들이 PCR로 NDV F나 HN 유전자를증폭하였던결과와일치하였다. 또한 Chang et al (6,7) 은 CBP-1주와약독백신주의 F 및 HN 유전자의염기서열을비교분석하여 F 유전자는 98~99%, HN 유전자는 97.8~98.4% 의상동성이있음을보고한바있다. 본시험에서 F와 HN 유전자를 RT-PCR 로증폭한후, CMV (cytomegalovirus) promoter와 BGH (bovine growth hormone) poly (A) signal을지닌 pslia 백터에삽입하여재조합 pslia-tsf와 pslia-tshn를제조하였고 Lipofectamine plus (GIBCO BRL, USA) 를사용하여 COS-7 세포에 transfection 하고발현된 F와 HN 단백을 monoclonal antibody를사용하여면역형광항체법으로확인하였다. 그결과, 재조합 psliatsf와 pslia-tshn는 F와 HN 단백을효과적으로발현한다는사실을확인할수있었다. 재조합 DNA에서발현되는항원의농도와성상은사용한플라스미드백터에내장된 promotor와 poly(a) signal의구조등에의해영향을받는다 (10). 조류의 DNA 백신제작에활용될수있는 promoter와 transcription termination signals를지닌플라스미드를확보하기위한연구들이수행된바있었고 (15,21), 그결과 cytomegalovirus promoter와 bovine growth hormone termination signal 을지닌 expression vectors가조류의 DNA 백신에서효능이높다는것이인정되었다. 본연구에서는 CMV promoter와 BGH poly(a) signal을지닌플라스미드를공시하였으며, 연구결과공시한 pslia 백터가적합하게작용됨을알수있었다. 얻어진면역형광항체반응패턴은 Fang and Liang (10), Murakami et al (18), 및 Wu et al (33) 의면역학적연구결과와유사하였다. 발현단백의성상을조사하기위해 SDS-PAGE를수행하고, monoclonal antibody를이용하여 Western blot를수행한결과, F 단백에대하여 55 kda의밴드를확인할수있었다. F 단백의위치는 gel의농도에따라다르며, F 1 단백은 15% polyacrylamide gel에서 51 kda, 그리고 10% polyacrylamide gel에서는 56.5 kda이고, F 2 는분자량이적어측정하기어려웠다고보고된바있다 (1,19). 또한 F 1 은 54.7 kda 그리고 F 2 는 10.3 kda으로관찰되었고, F 0 에해당하는 66~67 kda의단백은검출되지않았다고기술된바있다 (10,18). 본시험에서관찰된 55 kda 밴드는 F 1 에해당되며, F 2 단백은관찰되지않은것으로추정된다. Fang and Liang (10) 이 NDV F48E9주의 F 유전자를 RhCMV (human cytomegalovirus) immediate early enhancer와 promoter를지닌 pcdna3에삽입시켜재조합플라스미드 pcdna3-f를제조하여 electroporation 에의해 vero cell에 transfection하여 F 단백발현을간접형광항체법으로확인하고 SDS-PAGE와 Western blot을실시하여 55 kda의 F 단백을관찰하였다고보고하였다. 이결과를유 추해보면본연구에서관찰된 55 kda의밴드는 F 1 단백질로인정할수있었다. 한편본시험에서 HN 단백에대한분석에서는 74 kda의밴드를관찰할수있었다. 이결과는 B1 주의 HN 유전자를 baculovirus expression vector에삽입하여제조된재조합바이러스를 Sf 곤충세포에접종하여재조합 HN 단백을발현시키고, 이것을 Western blot으로분석하여 74 kda의재조합 HN 단백이검출되었다는 Nagy et al (19) 과재조합바이러스에감염된 DF1 세포에서 74 kda의 HN 단백을검출한 Panda et al (22) 과 NDV B1주와 AB주에감염된 COS-7 세포에서 74 kda의 HN 단백을검출한 Stone- Hulsander and Morrison (27) 의결과와유사하였다. 현재사용되고있는 ND 백신의단점을보완할수있는제 3세대백신으로 NDV 유전자백신에대한연구는많은연구자들에의해수행되고있다. 그중재조합 DNA 백신은제조하기쉽고안전하며, 집단사육계군에사용하기쉽고, neonatal tolerance와모체이행항체 (maternal antibody) 에의한백신효능차단현상을극복할수있으며, 체액성면역과세포성면역의두면역계를모두자극하는장점이있다 (2,3,9,21). DNA 백신의이런장점은세포면역이중요한요소로작용하는조류질병예방에는더욱중요하다고지적되고있다 (3,9,21,31). 생체내에주입된 DNA 백신의작용기전에대해서는아직불명한점이많지만 DNA 백신을근육내로주입시에는근육세포나단핵세포에서항원물질을발현하고면역증강기능을하며 (2,3), 피내접종시에는피부조직에산재해있는성상세포들이항원발현에동원되고면역반응유발에중요한기능을하는것으로추정하고있다 (2,3,4,9). 본시험에서제조한재조합 pslia-tsf와 pslia-tshn의면역반응을마우스생체내에서측정하기위해 C57B/6 마우스의근육에 100 µg씩 3차접종하고, 피내에 10 µg씩 3차접종하여 NDV ELISA kit를이용하여항체생성상태를측정하였던바, 접종군에서음성대조군보다유의하게높은항체가가관찰되었고, pslia-tsf를접종한군이 pslia-tshn을접종한군보다더높은항체가를나타내었으며, 근육접종이피내접종보다높은항체가를나타냄을알수있었다. 또한근육접종군은 1차접종후부터대조군에비해높은항체가를나타내었고, 피내접종군은 2차접종후부터유의한 ELISA vlaues가관찰되었다. 이런결과는 DNA 백신접종시험에서대개근육접종이피내접종보다면역효능이높게나타났다는다른결과들과유사하였다 (11,21,24). 또한본시험과정중재조합 DNA를 1차접종한후 1주째일부마우스를채혈하여 ELISA를시행한바대조군에비해유의한항체가증가가관찰되었다. 따라서재조합 DNA 의농도와접종회수그리고경시적인면역형성과정에대
106 김지영, 초가기, 박종현, 서상희, 박창식, 김명철, 전무형 한체계적인시험이요구된다. 확립된 pslia-tsf와 psliatshn의면역효능과작용기전을규명하고, 닭에대한응용성을평가하기위해이재조합백신을부화계란내접종 (in ovo vaccination) 하여계태아내에서면역원성과, 아울러기존백신과의면역학적상호관련성에대해추가적인연구가필요하다고생각된다. 감사의글본연구는 2001년도농림부농림기술개발사업의지원 (201109-3) 에의해이루어진것이며, 또한일부는한국과학재단우수연구센터 (R11-2002-100-0000-0) 지원으로수행되었다. 저자들은이에대하여감사드리는바이다. 참고문헌 1) Alexander DJ: Newcastle disease. Br Poult Sci 42: 5-22, 2001. 2) Babiuk LA, van Drunen Littel-van den Hurk S, Babiuk SL: Immunization of animals: from DNA to the dinner plate. Vet Immunol Immunopathol 72: 189-202, 1999. 3) Babiuk LA, Babiuk SL, Loehr BI, van Drunnen Littel-van den Hurk S: Nucleic acid vaccines: research tool or commercial reality. Vet Immunol Immunopathol 76: 1-23, 2000. 4) Bos JD: The skin as an organ of immunity. Clin Exp Immunol 107: 3-5, 1997. 5) Bruckner L, Stauber N, Brechtbuhl K, Hofmann MA: Detection of extraneous agents in vaccines using the polymerase chain reaction of Newcastle disease virus in poultry biologicals. Dev Biol Stand 86: 175-182, 1996. 6) Chang KS, Kim JY, Kim S, Kim, TY, Song HJ, Jun MH: Expression of F protein gene of a thermostable isolate of Newcastle disease virus using Baculovirus expression system. Journal of Bacteriology and Virology 31(2): 163-174, 2001. 7) Chang KS, Kwak KH, Jand SI, Kim JY, Kim TY, Song YH, Song HJ, Jun MH: Molecular cloning and nucleotide sequence of the gene encoding hemagglutinin-neuraminidase (HN) of Newcastle disease virus isolated from a diseased pheasant in Korea. Korean J Vet Serv 25: 245-257, 2002. 8) Colman PM, Hoyne PA, Lawrence MC: Sequence and structure alignment of paramyxovirus hemagglutinin-neuraminidase with influenza virus neuraminidase. J Virol 67: 2972-2980, 1993. 9) Dufour V: DNA vaccines: new applications for veterinary medicine. Vet Sci Tomorrow 1: 1-19, 2001. 10) Fang WH, Liang XY: Expression of the Newcastle disease virus fusion glycoprotein in vero cells using attenuated Salmonella typhimurium as transgenic carrier. Sheng Wu Hua Xue Yu Sheng Wu Wu Li Xue Bao 34: 488-493, 2002. 11) Fodor I, Horvath E, Fodor N, Nagy E, Rencendorsh A, Vakharia VN, Dube SK: Induction of protective immunity in chickens immunized with plasmid DNA encoding infectious bursal disease virus antigens. Acta Vet Hung 47: 481-492, 1999. 12) Homhuan A, Prakongpan S, Poomvises P, Maas RA, Crommelin DJA, Kersten GFA, Jiskoot W: Virosome and ISCOM vaccines against Newcastle disease; preparation, characterization and immunogenicity. Eur J Phamacol Sci 22: 459-468, 2004. 13) Kamiya N, Niitura M, Ono M, Kai C, Matsuura Y, Mikami T: Protective effect of individual glycoproteins of Newcastle disease virus expressed in insect cells; the fusion protein derived from an avirulent strain had lower protective efficacy. Virus Res 32: 373-379, 1994. 14) Karaca K, Sharma JM, Winslow BJ, Junker DE, Reddy S, Cochran M, McMillen J: Recombinant fowl pox viruses coexpressing chicken type I IFM and Newcastle disease virus HN and F genes ; influence of IFN on protective efficacy and humoral responses of chickens following in ovo or post-hatch administration of recombinant viruses. Vaccine 16 (16): 1496-1503, 1998. 15) Kodihalli S, Haynes JR, Robinson HL, Webster RG: Crossprotection among lethal H5N2 influenza viruses induced by DNA vaccine to the hemagglutinin. J Virol 71: 3391-3396, 1997. 16) Mayo MA: Virus Taxonomy-Houston 2002. Arch Virol 147: 5, 2002a. 17) Mayo MA: A summary of taxonomic changes recently approved by ICTV. Arch Virol 147: 8, 2002b. 18) Murakami Y, Kagino T, Niikura M, Mikami T, Ishii K, Matsuura Y: Characterization of Newcastle disease virus envelope glycoproteins expressed in insect cells. Virus Res 33: 123-137, 1994. 19) Nagy E, Huber P, Krell PJ, Derbyshire JB: Synthesis of Newcastle disease virus-like envelopes in insect cells infected with a recombinant baculovirus expressing the hemagglutininneuraminidase of NDV. J Gen Virol 72: 753-756, 1991. 20) Nishino Y, Niikura M, Suwa T, Onuma M, Gotoh B, Nagai Y, Mikami T: Analysis of the protective effect of the
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