한국어병학회지제27권제1호 (2014) www.ksfp.org pissn 1226-0819, eissn 2233-5412 J. Fish Pathol., 27(1) : 17~24 http://dx.doi.org/10.7847/jfp.2014.27.1.017 어류병원세균, Listonella anguillarum 에대한 Pseudomonas aeruginosa MB Ⅰ-3 의항균효과 이수정 * 윤이나 김진도 ** 이정식 김은희 전남대학교수산생명의학과 부산광역시수산자원연구소 국립수산과학원병리연구과 Antibacterial Effects of Pseudomonas aeruginosa MB -3 against Listonella anguillarum Su-Jung Lee, I Na Youn, Jin-Do Kim, Jung Sick Lee and Eunheui Kim Department of Aqualife Medicine, Chonnam National University, Yeosu 550-749, Korea * Busan Marine Resources Research Institute, Busan 618-814, Korea ** Pathology division, National Fisheries Research and Development Institute, Busan 619-705, Korea To study the possible use of probiotics in fish farming, The in vitro and in vivo antibacterial effects of Pseudomonas aeruginosa MBⅠ-3 (MBⅠ-3) against the fish pathogenic bacterium Listonella anguillarum were evaluated. The inhibitory effects of MBⅠ-3 against vibrios were investigated by the double layer method and the co-culture. The results showed that MBⅠ-3 inhibited the growth of pathogenic vibrios including Listonella anguillarum, Vibrio alginolyticus, Vibrio cholerae, Vibrio fluvialis, Vibrio furnissii, Vibrio harveyi, Vibrio parahaemolyticus and Vibrio vulnificus. Extracellular substances obtained from the cultural supernatant of MBⅠ-3 by ethyl acetate extraction showed inhibitory effects on L. anguillarum. The antibacterial substance of MBⅠ-3 was evaluated to destroy the cell membrane of L. anguillarum in electron micrographs. The probiotic effects of MBⅠ-3 was tested by exposing olive flounder (Paralichthys olivaceus) fry to L. anguillarum with or without MB Ⅰ-3. The cumulative mortality of olive flounder fry infected with L. anguillarum was 24% in the group with MBⅠ-3, while it was 46% in the control group without MBⅠ-3. These results indicate that MBⅠ-3 has potential applications as a probiotic for the control of fish pathogenic vibrios in fish rearing system. Key words: Pseudomonas aeruginosa MB -3, Listonella anguillarum, Probiotics, Extraction, Antibacterial effect 양식어류에발생하는질병은양식생산력의심 각한저하를가져온다. 질병치료를위하여사용되 는항균제는치료에효과적이고사용이편리한장 Corresponding author: Eunheui Kim Tel: +82-61-659-7171, Fax: +82-61-659-7179 E-mail: ehkim@chonnam.ac.kr 점이있지만, 내성균발생이나항균물질의체내잔류와같은문제점들을안고있다. 따라서양식어류에있어서질병원인균의과다발생을억제하고어체의건강을유지시키기위한 probiotics 개발에관심이집중되어많은연구들이진행되어왔다 (Irianto and Austin, 2002; Kesarcodi-Watson et al., 2008; Nwachi, 2013: Tuan et al., 2013). 특히많은
18 이수정 윤이나 김진도 이정식 김은희 연구자들은항세균성, 항곰팡이성, 항바이러스성물질을생산하는비병원성의세균을탐색하여양식장에적용하고자노력해왔다. 방등 (1999) 은 Lactobacillus plantarum, Bacillus coagulans 및 lactoferrin 을이용하여넙치연쇄구균증에대한정균효과를조사한결과 L. plantarum은 in vitro 상에서 Streptococcus sp. 의증식을억제하는동시에어체에성공적으로정착된다고보고하였다. Yang et al. (2003) 은발효식품으로부터 3종의어류병원세균에대하여항균력을갖는유산균을분리하여 probiotic 균주로의사용가능성을제기하였고, Cha et al. (2012) 은 probiotic으로 Bacillus sp. 를첨가한사료를공급하였을때넙치치어의성장이향상되었고질병에대한저항성이증가되었다고보고하였다. Myouga et al. (1995) 은저질에서분리한 Alteromonas sp. 가항바이러스성물질을생산하여 IHNV에대한저해능력이있음을입증한바있으며, Harikrishnan et al. (2010) 은 probiotics를첨가한사료가넙치의 lymphocystis disease virus(lcdv) 질병에대한저항성을증가시켰다고보고하였다. Listonella anguillarum은 1893년뱀장어 red-pest 의원인균으로최초보고된이래로다양한어종에서질병을유발하는것으로알려져왔다. 특히감염어의혈액과내부장기에병원균이다량존재하는전형적인출혈성패혈증을일으켜양식장에막대한경제적손실을가져온다 (Austin and Austin, 2012). L. anguillarum에대한 probiotics를탐색하기위하여 Balcázar et al. (2008) 과 Chabrillón et al. (2006) 은어류의장으로부터 lactic acid bacteria (LAB) 를분리하여항균효과를확인하였고, 분리균주가 in vitro에서어류의장점막에정착하여병원균의부착을억제하므로어류양식을위한 probiotics로이용가능성이있음을밝힌바있다. 해산어종묘생산장에서발생하는세균성질병은폐사율이높은반면, 사육수의환수부족, 약제투여방법의한계성등으로항생제투여에의한치료효과를기대하기어렵다 (Olafsen, 2001). 특히사육수조내에서나타나는다양한종류의비브리오균들은양식어류의초기발생단계에서생산력감소의한원인이되고있다 (Eddy and Jones, 2002). Hansen and Olafsen (1999) 은어류의난이나 자어를 probiotic 균주와함께사육하였을때난이나자어표면의세균총이조절되어질병예방이가능하다고보고한바있다. 따라서본연구는이전연구에서 L. anguillarum 에대하여생장억제효과가있는것으로밝혀진 Pseudomonas aeruginosa MBⅠ-3를이용하여넙치의비브리오병에대한생물학적방제효과를검토하고자하였다. 재료및방법 실험균주및배양배지항비브리오세균으로이전연구에서분리된 P. aeruginosa MBⅠ-3 (MBⅠ-3) 를사용하였다 (Byon and Kim, 2000). 병원성비브리오균주로는 L. anguillarum, Vibrio alginolyticus, Vibrio cholerae, Vibrio fluvialis, Vibrio furnissii, Vibrio harveyi, Vibrio parahaemolyticus, Vibrio vulnificus 등 8종을균주센타 (Korean Collection for Type Culture) 로부터분양받아사용하였다. 일반증균배지로 trypton soy broth (TSB, BD) 와 trypton soy agar (TSA, BD) 를사용하였고, 비브리오를선택배양하기위하여 thiosulfate citrate bile salt sucrose (TCBS, BD) 배지를사용하였다. In vitro 항균활성 1) Plate assay 병원성비브리오에대한 MBⅠ-3 균주의항균범위와항균력을알아보기위하여 double layer법 (Sugita et al., 1996) 을실시하였다. TSB에서 25 로 24시간배양한 MB I-3 균액을 1% NaCl이첨가된 TSA 배지중앙에 5 μl씩접종하였다. 25 에서 3 일간배양한후, chloroform gas에 20분간노출시켜 MBⅠ-3 균주를사균화하였다. Vibrio spp. 를 10 7 CFU/ml 함유한 0.7% soft agar를 MB Ⅰ-3 plate에중층시켜 25 에서 2일간배양하면서생겨난생장저지대의크기를비교하였다. 2) Broth assay 해수내에서두균주의생장을알아보기위하여, 두균주를혼합으로접종하여배양시간에따른생균수변화를조사하였다. MBⅠ-3 와 L. anguilla-
어류병원세균, Listonella anguillarum 에대한 Pseudomonas aeruginosa MB Ⅰ-3 의항균효과 19 rum을각각 2% NaCl이첨가된 TSB에서 25 로 24시간배양하여, 12,000 rpm으로 10분간원심분리한후 0.8% 멸균생리식염수로 3회세척한후희석하여 1.2 10 9 CFU/ml 농도의세균현탁액을준비하였다. 20 ml 멸균해수에두균주를 1:1로접종한후 25 에서진탕배양하면서 0, 3, 12, 24, 36, 48, 72, 96시간에시료를채취하여단계희석한후 TSA와 TCBS에배양하여생균수를조사하였다. 생장억제된 L. anguillarum 의전자현미경관찰 MB Ⅰ-3의항균기작을알아보기위하여투과전자현미경 (JOEL 12,000 EXⅡ) 으로생장이억제된 L. anguillarum 의형태변화를관찰하였다. 시료는 MB I-3균주와 L. anguillarum을 TSB에서 25, 24시간혼합배양후원심분리로집균한것과평판배지에서항균물질의확산으로생장이저지된 L. anguillarum을모아서사용하였다. 대조구는균주를 TSB에서단독배양한것을사용하였다. MBⅠ-3 배양액으로부터항균물질추출 MBⅠ-3의배양액으로부터항균물질을추출하기위하여 Lategan et al. (2006) 의방법에따라실험하였다. MBⅠ-3를 TSB 1,000 ml에접종하여 25 에서 24시간배양한뒤 1시간동안 70 에서열처리한후 4 에서 6,000 rpm으로 15분간원심분리하여얻은상층액을 0.45 μm membrane filter (Adventec) 로여과하였다. 여과한배양액과 ethyl acetate (Junsei) 를 1:0.5, 1:0.3, 1:0.2 비율로 3회분획하였으며얻어진 ethyl acetate 용해성물질은회전식진공농축기 (Buchi) 를이용하여농축하였다. 농축한물질은 dimethyl sulfoxide (DMSO, Junsei) 200 μl에녹였다. L. anguillarum 을도말한 TSA에 15 μl의 MBⅠ-3 추출물을흡수시킨 disk를올려, 25 에서 24시간배양한후형성된성장저지대의크기를측정하였다. MB Ⅰ-3의 in vivo 항균효과시험어는종묘생산장에서 1~2 cm (30 일령 ) 크기의넙치치어를구입하여사용하였다. 공격실험을위하여 MB 1-3와 L. anguillarum 두균주를각각 TSB에서 25 로 24시간동안배양한후원심분리하고, 집균된것을 0.65% 멸균생리식염수로세척및희석하여현탁액을준비하였다. 30 l의사각수조에넙치를 100마리씩 3개그룹 (2반복) 으로수용한후 2개그룹에 L. anguillarum을최종농도 10 5 CFU/ml 되도록투여하고, 그중한실험구에는 MB Ⅰ-3 균주를같은농도로투여하였다. 나머지한그룹은아무처리도하지않고대조구로사용하였다. 실험기간중수온은 18 20 로유지하였으며분말사료를 1일 3회 ( 어체중의 5%) 투여하였다. 환수는거의하지않았으며자연증발된수량의물만추가해주면서 2주간폐사를관찰하였다. MB Ⅰ-3 접종에따른사육해수내세균총의변화를알아보기위하여실험 0, 7, 14일째사육수조의여러곳에서해수를채취하여혼합한후시료로사용하였다. 사육수시료는단계희석한후 TSA와 TCBS에접종하여 25 에서 24시간배양하여성장한집락을계수하였으며총균수및비브리오균과 MB Ⅰ-3 의균수변화를조사하였다. 결과 In vitro 항균효과 P. aeruginosa MBⅠ-3 (MBⅠ-3) 는다양한비브리오속세균에대하여항균력을보였으며 L. anguillarum, V. alginolyticus, V. furnissii, V. parahaemolyticus > V. cholerae, V. vulnificus > V. fluvialis, V. harveyi 순으로저지대의크기가크게나타났다. 특히 L. anguillarum에대하여는성장저지대가 25 mm 이상으로높은항균력을보였다 (Table 1, Fig. 1). MBⅠ-3 균주와 L. anguillarum 을멸균해수에혼합접종한후시간경과에따른생균수변화를조사하였다 (Fig. 2). 96시간동안두균주모두 10 4 10 6 CFU/ml 농도를유지하였으나, 배양 9시간부터 L. anguillarum은다소생장감소를보이는반면 MB I-3는그수가일정하거나다소증가하는경향을보였다. 전자현미경관찰생장이억제된 L. anguillarum을전자현미경 ( 12,000, 25,000) 으로관찰한결과를정상상태
20 이수정 윤이나 김진도 이정식 김은희 (A) (B) (C) (D) (E) (F) (G) (H) Fig. 1. Vibriostatic activity of Pseudomonas aeruginosa MBⅠ-3 by the double layer method : (A) Listonella anguillarum, (B) Vibrio alginolyticus, (C) Vibrio furnissii, (D) Vibrio parahaemolyticus, (E) Vibrio cholerae, (F) Vibrio vulnificus, (G) Vibrio fluvialis, (H) Vibrio harveyi. Table 1. Inhibitory effects of MBⅠ-3 on the growth of pathogenic Vibrio strains. The activity was estimated as a size of clear zone after incubation on TSA plate at 25 for 24 hrs. Pathogen Activity a) Listonella anguillarum Vibrio alginolyticus Vibrio furnissii Vibrio parahaemolyticus Vibrio cholerae Vibrio vulnificus Vibrio fluvialis Vibrio harveyi a) +++ ( > 25 mm), strong inhibition ++ (16-25 mm), medium inhibition + ( < 15 mm), weak inhibition +++ +++ +++ +++ ++ ++ + + 의균주와비교하였다. 대조구의 L. anguillarum 에 비해생장이억제된 L. anguillarum 은세포막이심 하게변형되거나파괴되어세포내물질이외부로 유출된것을볼수있었다 (Fig. 3). 이러한현상은 broth 에서보다 plate 에형성된생장저지대경계부 세포에서더욱심하게나타났다. Bacteria (Log) 00000 10 9 8 7 6 5 4 3 2 1 0 3 6 9 12 24 36 48 72 96 Time (h) Fig. 2. Growth of MBⅠ-3( ) and Listonella anguillarum( ) in sterilized marine water by mixed shake bottle culture. MBⅠ-3 배양액에서추출한물질의항균력 MB Ⅰ-3 배양여액을 ethyl acetate 로추출한추 출물에서도 L. anguillarum 에대한생장억제대가 25 mm 정도형성되었다 (Fig. 4) 넙치치어에대한 MB Ⅰ-3 의 in vivo 항균효과 넙치치어사육수에 L. anguillarum 과 MBⅠ-3 를
어류 병원세균, Listonella anguillarum에 대한 Pseudomonas aeruginosa MB Ⅰ-3의 항균 효과 21 (A) (B) 0000000 Fig. 4. Inhibitory effect on Listonella anguillarum of the extra cellular substance obtained from the cultural supernatant of Pseudomonas aeruginosa MB I-3 by ethyl acetate extraction. 60 (C) Cumulative mortality (%) 50 40 30 20 10 0 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 Day s after infection Fig. 5. Cumulative mortality of the flounder larvae in fected with Listonella anguillarum with and without Pseudomonas aeruginosa MB I-3., L. anguillarum infection with 105 CFU/ml of MBⅠ-3;, L. anguillarum alone;, Control (no inoculation) Fig. 3. Transmission electron micrographs of Listonella anguillarum in control (A) and the irregular cell membrane of L. anguillarum (arrows) after co-cultivation with MBⅠ-3 at 25 for 24 hrs in broth (B) or on agar plate (C). ( 12,000, 25,000) 이 24%였다. 그러나 아무 처리도 하지 않은 대조구 에서도 누적폐사율이 49%로, L. anguillarum 단독 투여구와 비슷하게 나타났다. L. anguillarum 감염 전 후, 사육수내 총 세균수와 비브리오균 수를 조사한 결과 (Table 2), 실험 전 접종한 후 누적폐사율을 조사한 결과 (Fig. 5), L. 사육수에는 비브리오균 수가 총 세균의 53.3%인 anguillarum 감염구는 실험 3일째부터 폐사어가 나 160 CFU/ml이었고, 어류의 장에서도 평균 1.6 타났고, 2주 후에는 46%의 누적 폐사율을 보인 반 면, MBⅠ-3를 동량 투여한 실험구는 누적 폐사율 103 CFU/fish 검출되었다. 사육수내의 총 세균수는 계속 증가하여 실험 2주째, L. anguillarum 단독 접
22 이수정 윤이나 김진도 이정식 김은희 Table 2. Total bacteria and vibrios in the tanks before and after the infection of Listonella anguillarum. The values given are colony forming units per ml determined by the spread plate method on TSA and TCBS Tank L. anguillarum alone L. anguillarum + MBⅠ-3 Control Before infection 1 week after infection 300 a) (160) b) 7,700 (2,730) 300 (160) 300 (160) a) Total bacteria, b) Vibrios 6,200 (370) 5,300 (960) 2 weeks after infection 38,100 (1,230) 35,000 (180) 81,000 (790) 종구와 MBⅠ-3 균주투여구에서각각 38,100 CFU/ ml, 35,000 CFU/ml 로유사한수치를나타내 었다. 비브리오균수는 L. anguillarum 단독투여구 에비해 MBⅠ-3 를함께접종한실험구에서상당 한감소를보였는데, 접종 2 주후에는 L. anguillarum 단독투여구에비해 14.6% (180 CFU/ml) 에불 과했다. 한편아무처리하지않은대조구에서는 L. anguillarum 단독투여구에비해비브리오균이 1 주 째 35%, 2 주째 64% 를나타내었다. 고 찰 미생물은어류의표피, 아가미, 장관등과접해 있으면서질병을일으키는한편, 양식생물의영양 공급및수질과질병의 control 에관여하는등어류 양식장에서중요한역할을하고있다 (Moriarty, 1997; Ringo and Birkbeck, 1999; Eddy and Jones, 2002). 어류의발생초기단계에형성되는세균총 은환경의미생물총에서비롯되며이후치어의발 달에영향을줄수있다고보고되어있다 (Hansen and Olafsen, 1999; Olafsen, 2001: Eddy and Jones, 2002). Probiotics 는개발초기에숙주장내세균의 균형을조절함으로써숙주에유익한영향을주는 살아있는미생물먹이로정의하였으므로이들유 용세균의숙주장내정착에관한많은연구가진행 되어있다 (Vine et al., 2004; Balcázar et al., 2006; Tuan et al., 2013). 그러나 probiotics 는장내에정착 하지않더라도사육수의미생물총을조절함으로써어류의표피, 아가미등에접해있는병원균의수를감소시켜질병을예방할수있다 (Kesarcodi- Watson et al., 2008; Tuan et al., 2013). Riquelme et al. (2000) 은 scallop (Argopecten purpuratus) 유생부화장에 probiotics를첨가하여유생의미생물총을조절함으로써질병예방이가능함을입증하였고, Nakamura et al. (1999) 은참굴 (Crassostrea gigas) 유생에 V. alginolyticus 감염시사육수에서분리한 probiotics를첨가할경우대조구 (8.4%) 에비해생존율이 78% 로증가한다고보고하였다. 본연구에서사용한 MB I-3도다양한병원성비브리오에대하여항균력을보였고 (Table 1 and Fig. 1), 해수에함께있을때 L. anguillarum 의생장을억제하는효과가인정됨으로써 (Fig. 2) 어류사육수내바브리오균의수를제어하기위한목적으로사용가능할것으로보였다. 한편 probiotic 균주가분비하는항균물질에대한연구도다양하게이루어져있는데, Lategan et al. (2006) 은 Aeromonas media A199가생산하는항균성물질이 indole임을밝힌바있고, Castillo et al. (2008) 은해수에서분리한 Pseudoalteromonas sp. A1-J11로부터 AVS-03a라고명명한항비브리오물질을추출하여정제하였다. MB Ⅰ-3 배양여액을 ethyl acetate로분획하여얻어진추출물도 L. anguillarum에대한생장억제효과를나타냄으로써 (Fig. 4) MB Ⅰ-3의항균물질은세포내에서생산되어외부로분비되며 ethyl acetate로추출가능함을알수있었다. 한편생장이억제된 L. anguillarum 의전자현미경사진을통해볼때 (Fig. 3), MB I-3가분비하는항균물질은세포막을파괴시킴으로써살균효과를나타내는것으로추정된다. Probiotic 세균은일반적으로 siderophores, antibiotics, bacteriocins, lysozymes 등을단독또는복합적으로생산하거나, 유기산에의한 ph 변화로병원균의생장을억제하거나, 다른균과의영양경쟁, 소화효소분비, 수질개선및면역력증강등을통하여병원균에대한숙주의저항력을높이는것으로알려져있다 (Balcázar et al., 2006: Crab et al., 2012; Tuan et al., 2013). 따라서 MB Ⅰ-3 균주는 1차적으로영양경쟁보다는항균물질을생산함으
어류병원세균, Listonella anguillarum 에대한 Pseudomonas aeruginosa MB Ⅰ-3 의항균효과 23 로써 L. anguillarum의성장을억제하는것이라사료되지만다른효과에대한추가연구도필요하다. 넙치치어사육수에 L. anguillarum 과 MB Ⅰ-3를접종한후누적폐사율을조사한결과 (Fig. 5), L. anguillarum 감염구에비해 MB Ⅰ-3를동량투여한실험구는 20% 감소된누적폐사율을보였다. 그러나아무처리도하지않은대조구에서도누적폐사율이 49% 로, L. anguillarum 단독투여구와비슷하게나타났는데, 이는사육수와어류에상재하고있던비브리오균 (160 CFU/ml, 1.6 10 3 CFU/ fish) 이폐사율에영향을미친것으로생각된다. L. anguillarum 감염전후, 사육수의총세균수와비브리오균수를조사한결과 (Table 2), 감염전에는사육수내에비브리오균수가총세균의 53.3% 였다. 접종 2주째, 비브리오단독접종구와 MB Ⅰ-3 균주투여구에서총세균은각각 38,100 CFU/ml, 35,000 CFU/ml 로나타났으나비브리오균수는 MBⅠ-3 균주를함께접종한실험구에서 L. anguillarum 단독투여구에비해 14.6% 를나타내었다. 한편아무처리하지않은대조구에서는비브리오균이 L. anguillarum 단독투여구에비해 2주째 64% 를나타내었다. 이와같은결과는 MB Ⅰ-3가사육수내의세균총을조절하였으며, 간접적으로넙치치어의누적폐사율을감소시킨것으로보인다. 따라서 MB I-3는사육수내에서병원성세균의수를조절함으로써치어의생존율을높이기위한생물학적방제제의개발가능성을시사하였다. 요약 질병치료를위하여사용되는항균제는효과적이고사용이편리한장점이있지만, 내성균발생이나항균물질잔류와같은문제점들을안고있다. 따라서어류질병치료및예방을위해어류와인체에안전한생약제개발과함께어류질병원인균의과다발생을억제하며어체의건강을유지시키기위하여유용균주를이용하고자하는연구가다양하게진행되고있다. 본연구는이전연구에서분리되어 Listonella anguillarum에대하여생장억제효과가있는것으로밝혀진 Pseudomonas aeruginosa MB I 3 (MB I-3) 를이용하여넙치의비브리 오병에대한생물학적방제효과를검토하였다. Double layered plate assay 와 co-culture 을통하여 MB I-3 의 L. anguillarum 에대한생장억제능력을 조사하였고, MBⅠ-3 균주배양액을 ethyl acetate 로 추출하여 disk 확산법으로추출물의항균효과를 확인하였다. 액체및고체배양에서생장이억제된 L. anguillarum 을전자현미경으로관찰하였으며, 넙치치어사육수조에 L. anguillarum 과 MBⅠ-3 균주를동시에첨가하여폐사율을비교하였다. MB I-3 는 8 종의병원성비브리오균에대하여항균 력을나타내었으며, 96 시간동안실시한 co-culture 에서 L. anguillarum 은배양후 9 시간까지생장증 가를보였으나, 그후감소하는경향을보였다. 한 편 MB I-3 배양액추출물또한 L. anguillarum 에 항균활성을보여항균물질이 ethyl acetate 로추출 됨을알수있었다. 전자현미경관찰에서 L. anguillarum 은세포질의밀도감소및세포막의 swelling 에의한세포용해현상을보였다. 한편 MB I-3 를 L. anguillarum 과함께투여한넙치치어는대조군 에비해누적폐사율이약 20% 감소되는결과를 보였으므로, MB I-3 를이용한수산용 probiotics 개 발가능성을시사하였다. References Austin, B. and Austin, D.A.: Bacterial fish pathogens, pp357-411, 5th ed., Springer Dordrecht Heiderberg, London UK, 2012. Balcázar, J.L., de Blas, I., Ruiz-Zarzuela, I., Cunningham, D., Vendrell, D. and Múzquiz, J.L.: The role of probiotics in aquaculture. Veterinary Microbiology, 114: 173-186, 2006. Balcázar, J.L., Vendrell, D., de Blas, I., Ruiz-Zarzuela, I., Muzquiz, J.L. and Girones, O.: Characterization of probiotic properties of lactic acid bacteria isolated from intestinal microbiota of fish. Aquaculture, 278: 188-191, 2008. Byon, J. and Kim, E. : Inhibitory activity of marine bacterium on the growth of Vibrio anguillarum. J. Fish Pathol., 13: 1-6, 2000. Castillo, C.S., Wahid, M.I., Yoshikawa, T. and Sakata, T.; Isolation and inhibitory effect of anti-vibrio substances from Pseudoalteromonas sp.a1-j11 isolated from the coastal sea water of Kagoshima bay. Fish-
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