PCR FlashGel System 2013. 04. 24
PCR 2013. 04. 24
순서 1. PCR 이란 2. PCR 실험의기본조건 3. PCR 효소선택가이드 4. Hot Start PCR의원리 5. PCR 실험시 Troubleshooting 6. PCR 장비 _TP350 소개
PCR(Polymerase Chain Reaction) PCR 이란? - Polymerase Chain Reaction 의약자 - DNA Polymerase 를이용하여 DNA 의양을증폭시키는기술
PCR(Polymerase Chain Reaction)
PCR(Polymerase Chain Reaction)
PCR(Polymerase Chain Reaction) PCR 에필요한 4 가지 1. Template DNA : ( 증폭대상이되는 DNA) 2. 한쌍의 primer : ( 증폭할부분의출발점을인식시키는 oligonucleotide) 3. Taq polymerase : ( 열에강한 DNA 중합효소 ) 4. dntp(datp, dctp, dgtp, dttp) : ( 유전자합성재료 nucleotide)
Taq 이란? 일본의미생물학자사이키란사람이온천물에생존하는세균을알아냈고이세균의 DNA polymerase를분리해내는데성공 뜨거운온천에살고있다는뜻으로 Thermus aquaticus 라고말함. 내열성중합효소이다보니 끓는물에서도아무문제없이 DNA 를 합성할수있게됨.
PCR 실험에필요한재료들 필요한재료 Template DNA Primer set(forward, Reverse) dntp Taq polymerase D.W. 설명 증폭하고자하는샘플 DNA Template DNA 의증폭에필요한아주작은인공 DNA 조각 Template DNA 의증폭에필요한 ATP, GTP, CTP, TTP 등의재료 Template DNA 가증폭될때 dntp 가잘합성될수있도록해주는접착제역할 깨끗한물
PCR 효소의선택가이드 단순증폭 : Colony PCR, 단순확인용 PCR 막 Taq?, PCR master mix 추천 Genomic DNA 등복잡한구조를가진 DNA 에서특정유전자증폭할때 (Long PCR 포함 ) 증폭효율, priming 효율이뛰어난효소적합 증폭한단편으로 expression( 발현 ) 실험을하고자할때 High Fidelity polymerase 적합 Crude 샘플을 template 로사용해야할때 Direct PCR 을하고자할때 PCR 저해물질에영향받지않는강력한 polymerase 필요
PCR 효소의선택가이드 단순증폭 : Colony PCR, 단순확인용 PCR 막 Taq?, PCR master mix 추천 * RR300 vs RR310 R001 TaKaRa Taq RR300 EmeraldAmp PCR Master Mix RR310 EmeraldAmp GT PCR Master Mix 항목 Emerald GT 비고 증폭효율 RR300 RR310 Specificity RR300 RR310 Hot Start antibody 포함 Fidelity RR300 > RR310 Proofreading 기능 가격경쟁력 RR300 < RR310 160,000 원 vs 80,000 원 * Proofreading : DNA 복제과정에서 error 를교정하는능력
PCR 효소의선택가이드 Genomic DNA 등복잡한구조를가진 DNA 에서특정유전자증폭할때 증폭효율, priming 효율이뛰어난효소적합 * RR001 vs RR002 RR001 TaKaRa Ex Taq RR006 TaKaRa Ex Taq Hot Start version RR002 TaKaRa LA Taq RR002AG TaKaRa LA Taq w/ GC Buffer RR002M TaKaRa LA Taq (Mg Plus) RR042 TaKaRa LA Taq Hot Start Version 항목 Ex Taq LA Taq 비고 증폭효율 RR001 RR002 Fidelity RR001 < RR002
PCR 효소의선택가이드 증폭한단편으로 expression( 발현 ) 실험을하고자할때 High Fidelity polymerase 적합 R010 R040 R044 R050 R045 PrimeSTAR HS DNA Polymerase PrimeSTAR HS (Premix) PrimeSTAR HS DNA Polymerase w/ GC Buffer PrimeSTAR GXL DNA Polymerase PrimeSTAR Max DNA Polymerase 정확도 GC or AT rich 스피드 넓은범위의 template 양 타겟길이 (human genome) 말단모양 (Blunt 또는 3'A end) PrimeSTAR HS 8.5 kb Blunt PrimeSTAR Max ( )* 6 kb Blunt PrimeSTAR GXL 30 kb Blunt
PCR 효소의선택가이드 Crude 샘플을 template 로사용해야할때 Direct PCR 을하고자할때 PCR 저해물질에영향받지않는강력한 polymerase 필요 639269 Terra PCR Direct Polymerase Mix 639284 Terra PCR Direct FFPE Kit 639285 Terra PCR Direct Genotyping Kit 639286 Terra PCR Direct Red Dye Premix 639287 Terra PCR Direct Card Kit R071 MightyAmp DNA Polymerase Ver.2 Card : 혈액, 구강점막액을도포할수있는 card (FTA 인증 : GE Healthcare) FFPE : Formalin - Fixed Paraffin Embedded
Hot Start PCR 의원리 *Hot Start PCR ; mispriming 이나 primer dimer 유래의비특이적증폭을방지. 목적단편의증폭효율을높이는데효과적 Antibody 사용 (5-10 sec. at 98 또는 20-30 sec. at 94 )
PCR 실험시 Troubleshooting 증상 PCR 을 Cloning 이나 sequencing 용도로사용하려고하는데추천제품은? PCR 증폭시 non-specific band( 불필요한밴드 ) 가나타난다 PrimeSTAR 를이용하여 PCR 증폭을하였는데, 증폭량이적은것같다 점검및해결방안 Taq polymerase 를사용할경우 error(mutation) 가나타날확률이높기때문에 High Fidelity polymerase 인 PrimeSTAR 제품군을추천 PCR program 변경 (3 단계 2 단계 ) Annealing time 줄임 Annealing temp 높임 (58-65 ) 오염유무판단 (DNA, Primer, DW 등 ) Denature temp/time 은적당한가?(98, 10sec)? Annealing temp/time 은적당한가?(55, 5sec or 15sec, primer 길이가 25mer 이상일경우 -5sec)
PCR 기기 _TP350 Code TP350 Description TaKaRa PCR Thermal Cycler Dice Touch 7 인치컬러터치패널을채용 마법사모드의편리한프로그램입력방식 Gradient 기본탑재 ( 최대 24 의온도구배 ) Touch-down, Long-PCR 등다양한 PCR application 고성능 peltier 소자로높은균일성과재현성실현 USB 를이용한자유로운프로그램이동 5.0 kg 의초소형디자인
PCR 실험의예 Denaturation : DNA 사슬분리를위한열변성단계 Annealing : DNA 와 Primer 가결합하는단계 Extension(Polymerization) : DNA 합성단계
FlashGel System 2013. 04. 24
전기영동 EtBr loading Agarose Running Buffer 가열 굳히기 Gel 완성 (1 시간 ) 전기영동 +Band 확인 (30~40 분 ) loading FlashGel Cassettes (0 분 ) 실시간확인 (5 분 )
FlashGel System DNA, RNA 전기영동및 DNA recovery 를위한시스템 빠르다 : 5 분안에핵산분리및이미지획득가능 편리하다 핵산이동을실시간으로확인가능 Gel & buffer prep, stain, UV light 불필요 DNA recovery를위해 Gel을조각내거나정제할필요없음 안전하다 : EtBr, UV light 불필요
FlashGel Dock Transilluminator를포함한전기영동장치 고압전기영동 (225V for RNA, 275V for DNA) 보호장비없이 band 관찰가능 별도의전원공급장치필요
FlashGel Camera & Cassettes 실시간관찰및데이터화 ( 이미지캡쳐 ) 컴퓨터나노트북에연결하여사용 간단한 interface 고해상도의깔끔한이미지획득가능 Premade 제품으로 Gel 과 buffer 가포함되어있음 EtBr 보다 5~20 배민감 실온보관 (~5 개월 )
10 분이내에 gel 에서 DNA 회수가능 FlashGel System for recovery FlashGel 회수방법과스핀컬럼정제방법비교 FlashGel Recovery System FalshGel System 에서 DNA 단편분리 3-5 분 스핀컬럼정제방법 Agarose gel 에서 DNA 단편분리 30-60 분 Well 에서곧바로 DNA 회수 1-5 분 총소요시간 4 10 분 Agarose gel 에서타켓 band 절단 5-10 분 스핀컬럼을사용하여 DNA 회수 25-30 분 총소요시간 1 시간이상 * 10 분내에 gel 에서 DNA 회수가능 회수한 DNA 는 gel extraction 으로추출시포함될수있는저해물질이나 UV 에의한 DNA 손상없이 PCR template, ligation, 제한효소처리반응가능
FlashGel System for RNA 30 분이내로빠르게 RNA 전기영동가능 10ng 이하까지검출가능 RNase contamination 의 위험최소화 깔끔하고재현성있는결과 Loading buffer 에따라 Native form, denatured form 의 RNA 전기영동선택가능
FlashGel System 의타겟 교육기관 교육용 (ex. 과학고등학교 ) 기업체연구소 비용보다편리성을우선시 RNA system 의경우 ; 모든연구소 RNA 전기영동 gel 을만들기가까다로움 (~3 시간 ) 그에비해 FlashGel system 을이용하면 30 분안에전기영동확인까지가능
FlashGel System 의구성 반영구적으로사용할수있는 FlashGel Dock 은모든시스템에필요하다. Code 제품명 용량 가격 57025 FlashGel Dock 1 대 798,000 초기세팅시에는별도단품을구매하는것보다 kit 제품이유리하다. FlashGel DNA Starter Kit (Code FlashGel RNA Starter Kit (code Flashgel Recovery Kit (Code 57050) 57026) 57024) 금액 972,000 원 535,000 원 778,000 원 구성품 FlashGel Dock FlashGel RNA cassettes 1.2% FlashGel Recovery Cassettes; 1.2% agarose(12+1 well) 1 set agarose, 8 + 1 doubletier (18-well) (57051) FlashGel DNA Cassettes 1.2% Formaldehyde Sample Buffer FlashGel Recovery Buffer (57060) agarose(12 + 1 well) 1 set 1 ml FlashGel Loading Dye FlashGel RNA Marker FlashGel Loading Dye (50462) 150 μl FlashGel DNA Marker 100 bp AccuGENE Molecular Biology Water FlashGel QuantLadder (50475) 4 kb Visualization Glasses* Control Fragment 제품명 소비자가 규격 FlashGel cassettes 1 set 197,000 9 ea/box FlashGel Recovery Buffer 251,000 2x500μl FlashGel Camera 1,111,000 1대
FlashGel System DNA, RNA 전기영동및 DNA recovery 를위한시스템 빠르다 : 5 분안에핵산분리및이미지획득가능 편리하다 핵산이동을실시간으로확인가능 Gel & buffer prep, stain, UV light 불필요 DNA 회수할때 Gel을조각내거나정제할필요없음 안전하다 : EtBr, UV light 불필요