대한임상검사학회지 : 37 권제 1 호, 27-34, 2005 임상검체에서분리된 Bacillus cereus 의성상, 장독소생성및항균제감수성 원광보건대학임상병리과 1, 순천대학교대학원생물학과 2, 전주대학교대학원생물학과 3 김신무 1 김은철 2 소향아 3 이규식 3 Bacillus cereus Clinical Isolates : Characteristics, Enterotoxin Production and Antimicrobial Susceptibility Shin-Moo Kim 1, Eun-Cheol Kim 2, Hyang-Ah So 3, and Gyu-Sik Lee 3 Department of Clinical Laboratory Science, Wonkwang Health College, Iksan 570-750, Korea 1 Department of Biology, Graduate School, Sunchon University, Sunchon 540-742, Korea 2 Department of Biology, Graduate School, Jeonju University, Jeonju 560-759, Korea 3 Biochemical characteristics, enterotoxin production and antimicrobial susceptibility were determined for 30 strains of Bacillus cereus isolated from stool specimens of diarrhea patients at an university hospital in Chulabuk-do province. Positive rate for VP reaction and citrate utilization were lower, (33 % and 40 % respectively) while the rates of acid production from mannitol, arabinose, and xylose were higher (17 %, 13 % and 3 % respectively) than those obtained by other investigators. The enterotoxin gene was detected in 18 of 30 isolates (60 %) by PCR, and the toxin was detected from all of the toxin gene-positive isolates by RPLA test. The agar dilution test showed that all isolates were resistant to penicillin G and 73 % were to cephalothin, but all were susceptible to ciprofloxacin, clindamycin, erythromycin, fusidic acid, gentamicin, rifampin, teracycline and vancomycin. We conclude that B. cereus isolates producing acid from mannitol, arabinose and xylose exist, that PCR can be used to detect enterotoxin genes rapidly and accurately, and that this organism is susceptible to various antimicrobial agents though not penicillin G and cephalothin. Key Words : Bacillus cereus, Enterotoxin, Antimicrobial susceptibility 1)I. 서 론 Bacillus cereus는그람양성간균으로토양, 물, 먼지또는동물과식물표면등자연계에널리분포하고있고, 교신저자 : 김신무, ( 우 )570-750 전북익산시신용동 344-2, 원광보건대학임상병리과 Tel : 063-840-1211 E-mail : smkim@wkhc.ac.kr 식품을오염시켜서식중독 (Lund, 1990) 뿐만아니라패혈증, 심내막염, 수막염및안염등을일으키는기회감염세균이다 (Drobniewski, 1993). B. cereus에의한식중독은 1950년 Hauge (1955) 가처음보고하였으며, 잠복기는 10 ~13시간으로, 복통, 물과같은설사가주증상이었다. Hauge 자신도환자에서분리한이세균을 ( 균수 9.2 10 7 /ml) 을먹고 13시간후에심한복통과설사를일으켰다고하였다. 그이후여러나라에서설사와복통이주증 27
상인이세균에의한설사형식중독이많이보고되었다. 이러한식중독의원인식품으로는육류, 야채, 주스등이알려지고있다. 한편 1971년영국에서설사와복통이거의없고, 잠복기가 1-5시간으로짧으며, 오심, 구토를주증상으로하는구토형식중독환자가보고되었고 (Public, 1972), 그후여러나라에서발생되었다. 구토형식중독의원인식품은거의볶은쌀요리 (fried rice) 등이다. 이와같이 B. cereus에의한식중독은구토형 (emetic type) 과설사형 (diarrheal type) 2가지가있다 (Kramer와 Gilbert, 1989). 여러양념이나우유제품및육류중의약 50 % 가 B. cereus에오염될수있으나버섯과같은식품은이세균에오염이안되는것으로알려졌다 (te Giffel 등, 1996; van Netten 등, 1990; Wong 등, 1988). B. cereus 균주의약반정도는설사형장독소 (diarrheal enterotoxin) 가생성되며, 이세균은 4-37 에서증식할수있다. 저온균인 B. cereus는장독소를생성할수있고 (Christiansson 등, 1989; Griffiths, 1990; Granum 등, 1993), 또한호기성과혐기성어느환경에서도생성된다 (Gramum 등, 1993). 더구나이세균의아포는지방이많이들어있는식품중에서열처리후에도살아남을수있고 (Kramer와 Gilbert, 1989), 우유나다른식품을부패시킬수있다 (Overcast와 Atmaram 등, 1974; Christiansson, 1993). B. cereus를검출하기위한몇가지선택배양법 (selective plating method) 이알려지고있는데 (Mossel 등, 1967; Kim과 Goepfert, 1971; Holbrook와 Andersson, 1980; Szabo 등, 1984; Meira de Vasconcellose 등, 1995), 그선택성은 polymyxin B에대한내성과 lecithinase 반응을이용한것이다 (Holbrook와 Andersson, 1980). B. cereus의대표적인선택배지로써는 Mossel 등 (1967) 이개발한 mannitol-egg polymyxin (MYP) 한천배지가있으며이외에도여러가지가있다. 이러한방법으로확인동정까지는 4일정도로긴시간이소요된다. 또한 B. cereus 의동정을위해서는 API 50 CHB 키트를이용할수있다 (Gilbert, 1989; te Giffel 등, 1996). 그러나이러한상품화된키트로도동정이안되는경우는전통적인생화학적방법으로확인할필요가있다. 그러나우리나라에서분리된 B. cereus의생화학적인성상이나항균제감수성이보고된바없다. 식중독환자에서 B. cereus가검출되면이균주는독소를생성함을시사한다. B. cereus 장독소에대한생화학적인성상은아직확실히규명되지않았고, 또한장독소의 분자생물학적인수준에서도잘확립되지않았으며 (Granum 등, 1993), 장분비액, Na + 및 Cl - 이온의흡수가반대이고, 포도당과아미노산역시흡수가안되어신경증과점막손상을일으킬수있다 (Kramer와 Gilbert, 1989). 장독소는토끼의 ileal loop에서분비액을축적시키고, 배양세포에세포독성을나타내며, 쥐에게혈관내주사할때치명적이다 (Thompson 등, 1984 ; Beecher와 Mac- Millan, 1990). 또한장내에서생성된장독소는 ph와장의단백분해효소에의해서소화후파괴된다. 그러므로설사형식중독은장내에서발육하는세균때문인것으로제안되고있다. 소화장애에서도살아있는이세균의아포는장내에서독소를생성한다 (Lund, 1990; Shinagawa 등, 1991; Drobniewski, 1993; Granum 등, 1993). 용혈소 BL (hbla) 이나타나는것은 B. cereus 장독소생성의지표가되고있다 (Heinrichs 등, 1993). Beecher와 MacMillan (1990) 에의하면용혈소 BL은 B성분과결합하여세포를변형시키며, L성분과함께세포를용해시킨다고하였다. 또한 bcet 유전자역시장독소출현의지표가되고있다. 세균균주나식품에서 hbla와 bcet 유전자의검출법은동물시험이나면역학적시험의 2가지가제안되었다. 장독소생성 B. cereus 균주의검출을위해서는상품화된면역학적검출키트가개발되었다. 흔히사용되는 2가지면역법은서로다른항원을검출하는것이다 (Christiansson, 1993; Buchanan과 Schultz, 1994; Day 등, 1994). Bacillus 설사형장독소의면역법 (BDE kit; Tecra, Japan) 은비독소단백질인 (Beecher와 Wong, 1994) 40과 41 kda을검출하는것이고, 다른한가지는 B. cereus 장독소시험 ( 설사형 ) 키트 (RPLA kit; Oxoid, UK) 로용혈소 BL복합체중 L성분과특이적으로반응하는것이다. 또다른한가지는 B. cereus를검출하기위해서특이적인 DNA를증폭시키는것이다. B. cereus는 penicillin과 cephalosporin에내성이며, vancomycin, ciprofloxacin 및 gentamicin에감수성으로알려져있다. 그러나우리나라장염환자에서분리되는 B. cereus 균주에대한항균제감수성성상에대한보고는드물다. 본연구에서는환자검체에서분리된 B. cereus 균주에대해서생화학적인성상과용혈소 hbla 유전자를이용하여신속하고정확하게장독소생성 B. cereus를검출할수있는지와이세균의항균제감수성을규명하고자하였다. 28
Ⅱ. 재료및방법 1. 사용균주및동정시험 2003년 9월부터 2004년 6월까지전북지역대학병원설사환자의변을 MacConkey agar, mannitol-egg yolk- polymyxin (MYP) agar에면봉으로 1구역만접종후 2구역부터는 loop로획선하여접종하고공기항온기환경에넣어 37 로하룻밤배양하였다. 분리된세균의생화학적동정을위해서는혈액한천배지에서용혈성, Mueller-Hinton agar (Difco, Mich., USA) 에서혐기성증식과 50 에서증식여부, 3 % H 2 O 2 로 catalase 시험, motility-indoleornithine 배지 (MIO, Difco, Mich., USA) 에서의운동성과 indole생성, MR-VP medium (Difco, Mich., USA) 에서 Voges-Proskauer (VP) 시험, penicillin 10 unit 디스크로 penicillin 감수성, egg yolk 배지에서 lecithinase, Simmon's citrate medium (Difco, Mich., USA) 에서 citrate 이용능, phenol red dextrose broth (Durham 관포함, Difco, Mich., USA) 에서가스생성, cystine tryptic agar (Difco, Mich., USA) 를기초배지로사용한탄수화물 (glucose, arabinose, mannitol, xylose) 에서의산생성시험의전통적방법과 API 50CH (Biomerieux, Lyon, France) 키트로시험하였다. 분리된균주는 15 % glycerol-brain heart infusion 배지에넣어 -70 냉동고에보관하면서사용하였다. 2. 장독소생성 B. cereus의동정장독소생성 B. cereus의동정은 hemolysin BL (hbla) 유전자를이용하여중합효소연쇄반응 (polymerase chain reaction, PCR) 과면역학적장독소검출법인 reversed passive latex agglutination (RPLA kit, Oxoid) 법으로시험하였다. hbla 유전자동정을위해이들의유전자부위만을특이하게증폭시킬수있는 primer (Mantynen과 Lindstrom, 1998) 를사용하였으며, 이 primer는제노텍회 사 (Genotek Co, Daejeon, Korea) 에의뢰하여합성하였다 (Table 1). 시험세균을 Mueller-Hinton agar (Difco) 에접종하여 37 에서하룻밤배양한집락을증류수 50 μl에부유시키고 98 에서 20분간가열하여 DNA를추출하였다. DNA 추출액 2 μl, 혼합 primer 2 μl, PCR 혼합액 (deoxynucleotide triphosphate, dntp; Taq polymerase, 10 x buffer) 4 μl, 8-methoxypsoralene (MOP) 12 μl즉, 총 20 μl를혼합하여반응혼합액 (premix) 를만들었다. 이를 GeneAmp PCR system 9600 (Perkin-Elmer Cetus Corp., Norwalk, CT, USA) 으로 HblA1 primer 쌍을사용한반응은 94 에서 5분간 predenaturation, 94 로 45초간 denaturation, 65 로 45초간 annealing, 72 에서 45초간 extension, 72 로 5분간마지막 extension하는 30 cycle 의 PCR을시행하였다. 한편 HblA2 primer쌍을사용한반응은 94 에서 5분간 predenaturation, 94 로 45초간 denaturation, 65 로 30초간 annealing, 72 에서 60초간 extension, 72 로 5분간마지막 extension하는 30 cycle 의 PCR을시행하였다. PCR에의한증폭산물 5 μl를 2 % agarose gel (Promega, Madision, WI, USA) 의홈에넣고 20분간전기영동하여 band가있는지를확인하였다. RPLA법은먼저 B. cereus 균주를 brain heart infusion broth에접종후 32 에서 6-18시간배양하여증균배양한후여과하여독소를추출하였다. 키트에들어있는각각의시약을세게흔든후 V형 microwell plate를준비하였다 8개의 well을한줄로하며, 각검체는 8 well 2줄이필요하다. 2줄의각 well에 25 μl의희석액을첨가하는데첫번째 well에는첨가하지않았다. 각줄의첫번째와두번째 well에 25 μl의검체를첨가하였다. 두번째 well에서 25 μl를취하고각각의줄에두배수희석을하였다. 7번째 well까지만희석하고, 8번째 well은희석액만첨가하였다. 첫번째줄의각 well에 sensitized latex 25 μl를첨가하고, 두번째줄의각 well에 control latex 25 μl를첨가하였다. 각 well의내용물이잘섞이도록 plate를손 Table 1. The oligonucleotide sequence of primer used in this study Gene Primer Oligonucleotide sequence HblA1-F 5'-CGG GCG TTC TAG GGC ATA TTG AG-3' hbla HblA1-R 5'-GCG AGT AGT TTA TTA GGG ATT TTT TTC A-3' HblA2-F 5'-GCT AAT GTA GTT TCA CCT GRA GCA AC-3' HblA2-R 5'-AAT CAT GCC ACT GCG TGG ACA TAT AA-3' Products size (bp) 586 29
이나 micromixer로흔들었다. Plate를덮고, 상온에서 20-24시간배양하여검은배경판에서각 well을관찰하였다. 3. 항균제감수성시험최소억제농도 (minimum inhibitory concentration, MIC) 항균제감수성시험은 NCCLS 한천희석법으로하였다 (NCCLS, 2002). 한천희석법에는 cephalothin, clindamycin, erythromycin, gentamicin, penicillin G, rifampin, tetracycline, vancomycin ( 이상 Sigma Chemical Co., St. Louis, Mo., USA), ciprofloxacin (Miles Pharmaceuticals West Haven, Conn., USA) 및 fusidic acid ( 동화약품, Anyang, Korea) 를사용하였다. 항균제를규정된용제로녹이고 Mueller-Hinton 한천배지에 0.25-128 μg /ml 농도로만들었다. 시험세균은 tryptic soy broth (TSB, Difco, Mich., USA) 에접종하여 35, 2시간배양후 densitometer로 McFarland 0.5관탁도에맞추고이어서식염수로 1:10이되도록희석하였다. 시험세균을 steers replicator를써서접종하였으며, 35 공기환경에서 18시간배양후에관찰하고, 세균의증식을완전히억제시킨최소의항균제농도를 MIC로판정하였다. 감수성시험의정도관리를하기위하여 E. coli ATCC 25922와 Staphylococcus aureus ATCC 33591을동시에대조균주시험을하였다. Ⅲ. 결과 1. 설사환자에서분리된 B. cereus의생화학적성상설사변에서분리된 B. cereus의 1일배양후생화학적 Table 2. Characteristics of B. cereus isolates from diarrheal patients Test B. cereus* % of positive isolates Growth at anaerobic 100 100 Growth at 5 % CO 2 100 100 Growth at 50 100 100 Catalase 100 100 Motility 97.9 100 Hemolysis 100 100 Penicillin susceptibility 0 0 Lecithinase 100 100 Indole 0 0 Voges-Proskauer 98.6 33 Citrate utilization 93.1 40 Gas from glucose 0 0 Acid from glucose 100 100 arabinose 0 13 mannitol 0 17 xylose 0 3 * From Gordon et al (1981). 성상의결과는 Table 2와같다. 1일배양후에모든균주가양성을보인시험은혐기성과 CO 2 환경및 50 에서증식, 운동성, 용혈, lecithinase, glucose에서산생성시험이었고, 모든균주가음성을보인시험은 penicillin 감수성및가스생성이었으며, arabinose와 mannitol에서산생성은각각 13 %, 17 % 의균주에서양성이었고, VP와 citrate 이용능은각각 33 % 와 40 % 가양성이었다. M 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 M 549 bp Fig. 1. PCR amplification of the Bacillus cereus hbla gene segments. Lane 1-13 : strains isolated from patients, lane 14 : enterotoxin-positive control, lane 15 : enterotoxin-negative control, M : molecular size marker. 30
Fig. 2. Proportion of isolates with enterotoxin gene-positive B. cereus strains detected by PCR. 2. 장독소생성 B. cereus의동정을위한 PCR법과 RPLA법의비교 PCR 법으로장독소생성 B. cereus 의동정을위해서 hemolysin BL (hbla) 유전자를검출한바 B. cereus 30균주중 18균주 (60 %) 가양성이었고, 12균주 (40 %) 는음성이었으며, RPLA법에의한장독소동정시험에서도동일한결과를보였다 (Fig. 1-2, Table 3). 3. B. cereus 의항균제감수성 NCCLS 한천희석법에의해서항균제감수성시험의결과는 Table 4와같으며, breakpoint를적용하여해석한바 ciprofloxacin, clindamycin, erythromycin, fusidic acid, gentamicin rifampin, tetracycline 및 vancomycin에는모든균주가감수성이었고, 이들항균제의 MIC50와 MIC90는 fusidic acid를제외하고모두 1 μg /ml이하였다. 한편 cephalothin의 MIC범위는 8-32 μg /ml로내성률은 73 % 이며, penicillin G의 MIC 범위는 8-128 μg /ml로모든균주가내성을보였다 (Table 3). Ⅳ. 고찰 B. cereus는그람양성인큰간균으로편모를가지고있고, 아포는중앙이나편재되어있는통성혐기성균으로증식온도는 10-48 ( 지적온도 28-35 ) 이며, 증식가능한 ph는 4.9-9.3이고, penicillin에내성이있으며, 가장흔한감염은식중독이나전신성감염을비롯하여드물게창상, 화상, 혈액투석, 수혈, 척수마취할때및면역이약한사 Table 3. Comparison of the PCR and RPLA methods for detecting enterotoxin-producing B. cereus Enterotoxin or the gene Strain detection by: PCR RPLA B. cereus ATCC 11778 - - B. cereus W1 + + B. cereus W2 + + B. cereus W3 + + B. cereus W4 + + B. cereus W5 + + B. cereus W6 + + B. cereus W7 + + B. cereus W8 + + B. cereus W9 + + B. cereus W10 + + B. cereus W11 + + B. cereus W12 + + B. cereus W13 + + B. cereus J14 + + B. cereus J15 + + B. cereus W16 - - B. cereus W17 - - B. cereus W18 - - B. cereus J19 + + B. cereus J20 + + B. cereus W21 + + B. cereus J22 - - B. cereus W23 - - B. cereus W24 - - B. cereus W25 - - B. cereus W26 - - B. cereus W27 - - B. cereus W28 - - B. cereus W29 - - B. cereus W30 - - 람에게감염을일으킬수도있다 (Lund, 1990; Drobniewski, 1993). B. cereus는많은단백분해효소를생성하여, 사람과동물에게독성을보이기때문에이세균의생화학적동정시험을비롯한독소생성등의진단적시험은매우중요하다. 본연구에서생화학적성상은 Gilbert 등 (1981) 과의결과와는일반적으로비슷하였으나 VP시험과 citrate 이용능시험은 Gilbert 등 (1981) 이각각 98.6 % 31
Table 4. In vitro activities of ten antimicrobial agents against Bacillus cereus strains isolated from patients Antimicrobial agent MIC ( μg /ml) % Range 50 % 90 % resistant Cephalothin 8-32 32 32 73 Ciprofloxacin 0.25 0.25 0.25 0 Clindamycin 0.25-1 1 1 0 Erythromycin 0.25 0.25 0.25 0 Fusidic acid 1-4 4 4 0 Gentamicin 0.25-2 0.5 1 0 Penicillin G 8-128 64 128 100 Rifampin 0.25-0.5 0.25 0.25 0 Tetracycline 0.25-2 1 1 0 Vancomycin 0.25-1 0.5 1 0 와 93.1 % 의양성률을보고한반면, 저자들의경우는각각 33 % 와 40 % 로매우낮았다. 한편, arabinose, mannitol 및 xylose 발효시산생성결과에서는 Gilbert 등 (1981) 은모두음성으로보고하였으나본연구에서는각각 13 %, 17 % 및 3% 가양성을보여설사환자에서분리되는균주중에는다소차이가있음을알수있었다. B. cereus가생성하는균체외독소로써는장독소 ( 설사형독소, 이열성 ), 용혈독소 Ⅰ(cereolysin Ⅰ, 이열성용혈소 ), 용혈독소 Ⅱ ( 내열성용혈소 ), 장독소 ( 구토형독소, 내열성 ), phospholipase C (lecithinase), 괴사독소 (necrotic toxin), 장관괴사독소등이알려졌다 (Turnbull, 1981; Drobniewski, 1993). B. cereus는자연계에널리분포되어있고각종식품에서흔히검출될뿐만아니라환자검체중구토물이나변에서도분리되기때문에식중독의원인균으로동정하기란쉽지않다. 식중독의원인균을검출하려면환자검체에서분리율이높아야하며, 또한추정식품에서 B. cereus균이 10 6 /g 이상검출되는것이필수조건이다. 환자발병초기에는구토물이나설사변에서 10 4-10 6 /g 이상의균이검출되는경우가많다. 그러나구토물중의세균은위산의작용으로사멸되기때문에검출이안되는경우도있다. 각검체에서분리되는 B. cereus 균이동일한 H혈청형이나, 생화학적성상을보이는것도중요하나확인동정하는시간이많이소요되기때문에독소유전자를이용한장독소생성 B. cereus의검출을위한신속하고검출하기 쉬운방법이필요하다. 본연구에서는용혈소 hbla DNA 를증폭하는 PCR과면역학적방법인 RPLA법을사용하여 B. cereus 30균주를시험하여 60 % 의양성률을보였으나, Mantynen과 Lindstrom (1998) 이보고한 PCR과 RPLA 키트법에의한장독소생성 B. cereus의양성률은 45 % 로, 저자들의결과가다소높았다. 장독소생성은 B. cereus 균주뿐만아니라, B. mycoides, B. pasteurii, B. smithii, B. thuringensis 및다른 Bacillus 균종에서도분리되고있다 (Mantynen와 Lindstrom, 1998). 이러한균종에서도설사를유발하는장독소가검출되는지를앞으로시도해야하겠다. 장독소를검출하기위한신속하고쉬운방법은식품의안전성을보증하기위해서매우중요하다. hbla sequence로장독소생성균주를검출하는 PCR법은신속하고감도가높은방법이다. 그러나 RPLA법은장독소생성 B. cereus를검출하는데 PCR법과큰차이가없고, 간단하고예민도가높은면역학적방법이나, 실험하는데 2일간이필요하여 PCR법보다많은시간을소요하는단점이있다. B. cereus에대한항균제감수성시험에서 Andrews와 Wise (2002) 는시험한 5균주가 ciprofloxacin에감수성, penicillin에내성, tetracycline에는 2균주는감수성, 1균주는내성, 2균주는방법에따라차이가있다고하였으며, Turnbull 등 (2004) 은 B. cereus 67균주에서 penicillin, ampicillin, cephalosporin 및 trimethoprim에 1균주 (1.5 %) 가내성을, clindamycin, ciprofloxacin, erythromycin, chloramphenicol, tetracycline, vancomycin 및 aminoglycoside에모두감수성을보고하였다. 한편 Kemmerly 와 Pankey (1993) 은 B. cereus에의한창상감염치료에 ciprofloxacin을성공적으로사용하였다고보고하였다. 본연구에서 B. cereus 30균주중 penicillin과 cephalothin에는각각 100 %, 73 % 가내성을보였으나, ciprofloxacin, clindamycin, erythromycin, fusidic acid, gentamicin, rifampin, teracycline 및 vancomycin에는감수성을보여외국의다른보고와는큰차이는없었다. V. 결론 전북지역대학병원설사환자에서분리된 B. cereus 30 균주에대한생화학적성상, 장독소생성및항균제감수성에관한연구에서다음과같은결과를얻었다. 1. 생화학적성상은 VP반응과 citrate 이용능이 33 %, 32
40 % 로양성율이낮았고, mannitol, arabinose 및 xylose는전형적인균주는모두음성이었으나, 본연구에서는각각 17 %, 13 % 및 3% 가양성을보였다. 2. PCR법에의한장독소유전자검출시험에서 B. cereus 30균주중 18균주 (60 %) 가양성을보였고, RPLA 법에의한장독소검출시험도동일한결과를보였다. 3. 항균제감수성시험에서 penicillin G와 cephalothin 은각각 100 %, 73 % 의균주가내성을보였으나, ciprofloxacin, clindamycin, erythromycin, fusidic acid, gentamicin, rifampin, teracycline 및 vancomycin에는모든균주가감수성이었다. 이상의결과를분석해보면설사환자에서분리되는 B. cereus 균주중에는 mannitol, arabinose 및 xylose 발효시산을생성하는균주도분리될수있었으며, PCR법으로신속하고정확하게장독소생성주를감별할수있으며, penicillin G와 cephalothin 이외의항균제에내성인균주는드물다는결론을얻었다. 참고문헌 1. Andrews JM, Wise R. Susceptibility testing of Bacillus species. J Antimicrob Chemother 49:1040-1042, 2002 2. Beecher DJ, MacMillan JD. A novel biocomponent hemolysin from Bacillus cereus. Infect Immun 58:2220-2227, 1990 3. Beecher DJ, Wong ACL. Identification and analysis of the antigens detected by two commercial Bacillus cereus diarrhoeal enterotoxin immunoassay kits. Appl Environ Microbiol 60:4614-4616, 1994 4. Buchanan RL, Schultz FJ. Comparison of the Tecra VIA kit, Oxoid BCET-RPLA kit and CHO cell culture assay for the detection of Bacillus cereus diarrhoeal enterotoxin. Lett Apl Microbiol 19:353-356, 1994 5. Christiansson A. Enterotoxin production in milk by Bacillus cereus a comparison of methods for toxin detection. Neth Milk Dairy J 47:79-87, 1993 6. Christiansson A, Naidu AS, Nilsson I, Wadstrom T, Pettersson HE. Toxin production by Bacillus cereus dairy isolates in milk at low temperatures. Appl Environ Microbiol 55:2295-2600, 1989 7. Day TL, Tatini SR, Notermans S, Bennett RW. A comparison of ELISA and RPLA for detection of Bacillus cereus diarrhoeal enterotoxin. J Appl Bacteriol 77:9-13, 1994 8. Drobniewski FA. Bacillus cereus and related species. Clin Microbiol Rev 6:324-338, 1993 9. te Giffel MC, Beumer RR, Leijendekkers S, Rombouts FM. Incidence of Bacillus cereus and Bacillus subtilis in foods in the Netherlands. Food Microbiol 13:53-58, 1996 10. Gilbert RJ et al. Bacillus cereus and other Bacillus species. Their part in food poisoning and other clinical infections. In Berkeley RCW, Goodfellow M (eds.). The aerobic endospore-forming bacteria classification and identification. p297, Academic Press London, 1981 11. Granum PE, Brynestad S, Kramer JM. Analysis of enterotoxin production by Bacillus cereus from dairy products, food poisoning incidents and nongastrointestinal infections. Int J Food Micorbiol 17:2669-2279, 1993 12. Granum PE, Brynestad S, O'Sullivan K, Nissen H. Enterotoxin from Bacillus cereus : production and biochemical characterization. Neth Milk Dairy J 47:63-70, 1993 13. Griffiths MW. Toxin production by psychrotrophic Bacillus spp present in milk. J Food Prot 53:790-792, 1990 14. Hauge S. Food poisoning caused by aerobic spore-forming bacilli. J Appl Bacteriol 18:591, 1955 15. Heinrichs JH, Beecher DJ, MacMillan JD, Zilinskas BA. Molecular cloning and haracterization of the hbla gene encoding the B component of hemolysin BL from Bacillus cereus. J Bacteriol 175:6760-6766, 1993 16. Holbrook R, Andersson JM. An improved selective and diagnostic medium for the isolation and enumeration of Bacillus cereus in foods. Can J Microbiol 26:753-759, 1980 17. Kramer JM, Gilbert RJ. Bacillus cereus and other Bacillus species. In Doyle MP (ed.). Foodborne bacterial pathogens. p796. Marcel Dekker Inc., New 33
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