Aug 2011 Vol. 19 No. 3 Ser. No. 74 Quarterly ISSN 1226-1734 www.whonetkorea.org Antimicrobial resistance of bacteria isolated during April to June in 2011 at a KONSAR program participating hospital Antimicrobial susceptibilities tested by CLSI disk diffusion method or Vitek AST system are shown in Tables 1 to 3. The resistance rates did not include intermediate categories. Multiple isolates were excluded in the calculation of resistance rates. There has been no significant difference between the present resistance rates of staphylococci, enterococci, and gram-negative bacilli excluding Klebsiella spp., Enterobacter spp., P. mirabilis, and Acinetobacter spp. and those of the previous quarter. Observed increases in resistance rate were: 5-11% in K. pneumoniae, K. oxytoca and P. mirabilis to extended-spectrum -lactams, 8-9% in K. pneumoniae to tobramycin, cotrimoxazole and levofloxcin. In contrast, decreases in resistance rate were observed in E. cloacae and E. aerogenes to extended-spectrum -lactams by 6-12%, and A.baumannii to -lactams, aminoglycosides, cotrimoxazole, and levofloxacin by 3-10%, 8-9%, 8%, and 6%, respectively. Proportions of prevalent organism-antimicrobial agent combinations respectively were: ESBL-producing K. pneumoniae, 42%; cefoxitinresistant K. pneumoniae, 17%; imipenem-resistant A. baumannii and P. aeruginosa, 65% and 28%. Fluoroquinolone resistance rates of E. coli, Acinetobacter spp., and P. aeruginosa were 36%, 65%, and 33%, respectively. The proportion of methicillin-resistant S. aureus was 65%, and that of vancomycin-resistant E. faecium was 32%. Antimicrobial agents Table 1. Antimicrobial resistance rates (%) of frequently isolated gram-negative bacilli a ECO KPN KOX CFR ECL EAE SMA PMI PVU MMO ACI SMP (1113/881) b (543/359) (63/51) (52/44) (176/135) (111/82) (85/60) (80/54) (12/11) (41/36) (635/256) (214/143) Ampicillin 69/67 100/100 100/100 94/95 99/99 98/98 100/100 43/44 100/100 100/100 - - A/S or A/C d 14/13 36/29 21/14 94/95 99/99 98/98 100/100 10/11 0/0 100/100 79/61 - Piperacillin 68/65 100/100 100/100 58/55 48/45 37/37 46/37 37/34 8/9 44/42 85/68 - Piperacillin-Tazobactam 5/5 31/23 19/12 40/39 35/31 30/27 13/12 1/0 0/0 5/6 85/68 - Cephalothin 38/36 67/60 35/29 98/100 99/99 100/100 100/100 20/20 100/100 100/100 - - Cefotaxime 24/21 48/41 10/12 27/27 33/31 13/11 26/22 19/20 0/0 15/80 85/69 - Ceftazidime 24/21 49/42 10/12 35/36 37/34 23/20 5/5 19/20 0/0 10/80 84/68 - Aztreonam 24/21 49/42 14/14 27/27 34/30 13/12 9/8 23/20 0/0 15/14 - - Cefepime 24/21 47/40 10/12 2/2 7/7 3/1 2/3 19/20 0/0 2/0 84/67 - Cefoxitin 12/11 26/17 6/8 94/95 99/99 99/99 28/25 10/90 0/0 5/6 - - Imipenem 0/0 2/1 0/0 0/0 0/0 4/1 0/0 1/0 0/0 17/19 82/65 - Amikacin 2/1 11/80 5/6 0/0 2/1 1/1 19/15 8/6 0/0 2/3 68/53 - Gentamicin 32/30 15/15 3/4 10/70 16/15 3/4 32/27 30/31 0/0 17/17 82/64 - Tobramycin 14/12 41/33 08/10 8/7 14/15 3/2 35/30 11/11 0/0 10/60 65/48 - Cotrimoxazole 40/38 33/29 08/10 19/18 25/23 10/12 29/25 58/50 8/9 22/22 83/66 9/8 Levofloxacin 39/36 38/30 2/2 12/90 9/9 1/1 8/5 4/6 0/0 2/3 82/65 6/5 Colistin - - - - - - - - - - 2/1 - Minocycline - - - - - - - - - - - 0/0 a a Abbreviations: ECO, E. coli; KPN, K. pneumoniae; KOX, K. oxytoca; CFR, C. freundii; ECL, E. cloacae; EAE, E. aerogenes; SMA, S. marcescens; PMI, P. mirabilis; PVU, P. vulgaris; MMO, M. morganii; ACI, Acinetobacter spp.; SMP, S. Maltophilia; -, Not tested. b All isolates/excluding multiple isolates. c Natural resistances are green shaded. d Ampicillin-sulbactam or amoxicillin clavulanic acid. c
Table 2. Antimicrobial susceptibility (%) of P. aeruginosa a Antimicrobial agents Resistant Intermediate Susceptible Piperacillin 49/35 b 0/0 51/65 Piperacillin-Tazobactam 39/27 0/0 61/73 Ceftazidime 28/21 11/8 60/71 Cefepime 36/25 11/9 53/66 Aztreonam 39/31 20/17 41/52 Imipenem 47/28 9/7 44/65 Amikacin 16/11 10/8 74/81 Gentamicin 35/24 22/16 43/60 Tobramycin 32/21 1/1 67/78 Ciprofloxacin 49/33 6/7 44/60 Colistin <1/1 0/0 100/99 a Total no. of isolates were 1,070 and total no. of isolates excluding multiple isolates were 399. b All isolates/excluding multiple isolates. Table 3. Antimicrobial resistance rates (%) of Staphylococcus and Enterococcus a Antimicrobial agents SAU (875/534) CNS (616/510) EFA (410/352) EFM (723/397) Ampicillin - - 0/0 96/95 Penicillin G 96/95 b 95/94 38/36 96/95 Oxacillin 75/65 80/78 - - Clindamycin 66/57 46/44 - - Erythromycin 67/58 58/56 70/70 89/88 Tetracycline 57/47 26/27 83/84 24/26 Cotrimoxazole 4/3 37/36 - - Ciprofloxacin 58/47 51/47 29/25 96/95 Teicoplanin 0/0 0/0 5/3 44/30 Vancomycin 0/0 0/0 4/3 47/32 Arbekacin 0/0 0/0 - - Linezolid 0/0 0/0 1/1 <1/<1 Quinupristin-dalfopristin 0/0 0/0 - <1/<1 a Abbreviations: SAU, S. aureus; CNS, coagulasenegative Staphylococcus; EFA, E. faecalis; EFM, E. faecium; -, not tested. b All isolates/excluding multiple isolates. 항균제감수성시험용 expert system 의평가 항균제내성기전이다양해지고, 여러기전을 가진세균이많아져서내성의정확한검출과, 그 기전을추정이어려워졌다. 자동화방법은소위 expert system 을써서검사자가간과하기쉬운 결과의해석에도움을준다. 같은회사의자동화 제품이라도지속적인개선으로과거의평가는가치 가적다. 또한평가에사용된균주, 참조방법등에 따라서연구결과가달라짐으로여러연구결과를 비교하기어렵다. Expert system 에관한종설 (1) 중그람음성간균에관한부분만요약한다. 이종설 에는 ESBL 검출에관한것이많다. 주된감수성 시험지침인미국의 Clinical and laboratory standards institute (CLSI) 최근판에서는 ESBL 검사가 통상시험에서제외되었으나 ESBL 역학연구에는 계속해서필요하다. AmpC 음성그람음성간균에서의 ESBL 검출 ESBL 생성 Enterobacteriaceae 를확인하는가장 좋은방법은 bla 유전자검출이지만통상검사로 사용할수는없다. ESBL Etest 는분자방법에비해 정확도가약 94% 이었다. Enterobacteriaceae 에서 자동화방법으로 ESBL 검출평가의대부분은 AmpC 음성이거나 AmpC 생성수준이낮은 E. coli 및 K. pneumoniae 를대상으로하였다. 임상분리 Enterobacteriaceae 300 주에대한시험 에서 (Vedel 등, 1996) 디스크확산법과 Vitek법은 91.7% 가같은결과이었다. 두방법은대부분의획득성내성균주를검출하였다. 그러나 25균주 (8.3%) 에대한결과는달랐다. 즉, 5주에대한 expert system의추정은잘못되었고, 17주를여러표현형으로추정하였으며, 1주는추정이없었다. 선천성내성인 2주는자동화방법으로검출되지않았으나, 균종을근거로 expert system은선천성내성으로추정하였다. 자동화방법은 4-5시간에판독이가능하지만, 시험에포함되는항균제의종류를잘선택해야함을보였다. 즉, cefpodoxime, ceftazidime (CAZ) 및 cefotaxime (CTX), cefoxitin, cefepime ( 혹은 cefpirome) 의단독및 -lactamase 저해제복합등의적절한선택이필요함을보였다. Spanu 등 (2006) 은 1129주의 Enterobacteriaceae (218주는 -lactamase 양성균주이고, 21 가지 ESBL 보유 ; Enterobacter는 144주, C. freundii는 36주 ) 를대상으로 Vitek 2 ESBL test (N045 card, cefepime 1.0, CTX 0.5 및 CAZ 0.5 μg/ml 각단독및 clavulanate 복합의 6 가지보유 ) 를평가하였는데, 99.3% 의균주에대해서분자방법과결과가같았다. ESBL 생성균은 312주이었는데 Vitek 2 ESBL 시험의검출민감도는 98.1%, 양성예측도는 99.3% 이었다. ESBL 음성 817주중 2주는위양성이었고, 특이도는 99.7%, 음성예측도는 99.3% 이었다. Vitek 2 ESBL 시험에는 6-13시간 ( 평균 7.5 시간 ) 이걸렸다. Pitout 등 (2008) 은 CTX-M 생성 E. coli를대상
으로 MIC는 BMD과 Vitek법으로, -lactamase 유전자는분자방법으로시험하였다. ESBL 생성 E. coli 202주중유전자형별균주수는 VEB-1이 2주, TEM-52이 12주, SHV가 32주, CTX-M이 156주이었다. Piperacillin-tazobactam (TZP) 내성인 ESBL 생성균 101주의시험에서, Vitek Legacy 로는 91주 (90%), Vitek 2로는 75주 (74%) 의 TZP 내성이검출되지않았다. 특히 CTX-M-15와 OXA-1을함께가진균주에서의검출율이낮았다. Vitek을쓰는검사실은 ESBL 생성 E. coli의 TZP 감수성을다른방법으로시험하도록권장하였다. Carroll 등 (2006) 은 Enterobacteriaceae 251주를써서 CLSI 한천희석법을기준으로 Phoenix (NMIC/ID-26) 를평가하였다. 두방법의감수성해석일치율은 98% 이었다. ESBL 생성 6주모두는 Phoenix의 expert rule로검출되었다 ( 주 : ESBL 생성균주수가적어서평가의정확성은의문임 ). Thomson 등 (2007) 은 ESBL 양성 ( 적어도 38 가지 ) 및음성인 E. coli, K. pneumoniae 및 K. oxytoca 102주 (CLSI ESBL 확인시험이위양성이거나위음성인균주도포함 ) 를써서 Vitek 2와 Phoenix ESBL 시험을평가하였다. Phoenix ESBL confirmatory test와 unmodified expert system은 ESBL 검출의민감도가 96%, 특이도가 81% 이었다. 두가지추가규칙을쓰면그민감도는 99% 로높아졌으나, 특이도는 58% 로낮아졌다. Vitek 2 AST- GN13 card와 WSVT2-R04.01 software를쓸때, Vitek 2 ESBL confirmatory 시험은민감도가 91% 이었으나 expert system을적용하면 89% 로낮아졌다. 특이도는 85% 이었다. Trevino 등 (2009) 은표현형시험으로 ESBL 생성이확인된 E. coli 174주와 K. pneumoniae 19주를써서 Vitek 2와 Phoenix의 ESBL 확인정확성을비교하였다. Double disk synergy (DDS) 와 Etest를기준으로판단할때, 임상분리주에서의 ESBL 검출민감도는 Vitek 2 (AST-N058 card) 가 99.5% 로 Phoenix (UNMIC/ID-62) 의 95.3% 보다높았다. Expert system의사용으로 Phoenix의민감도는 100% 로높아졌다. 유전자시험으로규명된 ESBL 양성및음성 12주에서의검출율은비슷하였다. Snyder 등 (2008) 은 Enterobacteriaceae 150주를 Phoenix (NMIC/ID-108 combo) 와 MicroScan (Neg BP combo panel type 30) 으로감수성을시험한바 97% 가같은결과를보였다. MicroScan이 ESBL 생성균으로추정한 K. pneumoniae 7주와 E. coli 2주중 1주만이 ESBL 양성으로판명되었는데, Phoenix로는 1주가위양성이었다. MicroScan 으로는 ESBL 양성인대조균주 10주모두가검출되었으나, Phoenix로는 6주만이검출하였다. AmpC 생성그람음성간균에서의 ESBL 검출 Enterobacter spp. 등염색체성 AmpC 생성균에서 ESBL을자동화방법으로검출하기가더욱어려운것은 AmpC가 clavulanate에의해저해되지않을뿐아니라 clavulanate의유도로 AmpC 생성이많아지기도하기때문이다. AmpC 생성균에서 ESBL을검출하는것이임상적으로는중요하지않을수있지만, ESBL 검출은그역학적연구에필요하다. Song W 등은 (2006) AmpC (DHA-1) 와 ESBL (SHV-2a) 동시생성 K. pneumoniae 16주에대한시험에서 DDS 시험과디스크법 CLSI ESBL 확인시험으로는 16주모두가양성이었으나, CLSI BMD 시험으로는 3주만이양성이었고, Vitek 으로는모두가음성이었다. Chen 등 (2009) 은 K. pneumoniae 317주와 E. coli 291주를대상으로 Vitek 2 (AST-GN13) 의 ESBL 검출을평가하였는데, 민감도는 99%, 특이도는 98.5% 이었다. 시험균주중 90주는 AmpC (CMY-2, CMY-8 또는 DHA-1) 와 ESBL (SHV 및 / 혹은 CTX-M) 동시생성균이었는데, 이들중 74주 (82%) 를 ESBL 양성으로판단하여서, AmpC 와 ESBL을함께가진 K. pneumoniae와 E. coli 에서 ESBL을검출하기에 Vitek 2가상당히정확함을보였다. 위음성인세균은대부분이 CMY-8와 CTX-M-3 생성균 (6주), 또는 DHA-1양과 SHV-5 양생성균 (6주) 이었다. CTX-M과 DHA-1 생성 30주중 1주는 Vitek으로 ESBL이검출되지않았다. Vitek 2 ESBL 시험 card에는 CAZ와 CTX 이외에 cefepime도들어있는데 cefepime은 AmpC에의해서가수분해되지않고 ESBL에의해서는분해되므로 AmpC 생성균에서 ESBL을검출하기에유용하다. ( 주 : Song W 등, 2006이사용한 Vitek에는 cefepime이들어있지않아서성적이좋지않았다고추정됨 ). AmpC 생성세균에서 Phoenix의 ESBL 검출정확성은연구자에따라서현저히다르다. Sanguinetti 등 (2003) 이대상으로한 E. coli, K. pneumoniae, K. oxytoca, P. mirabilis, P. stuartii, M. morganii, E. aerogenes, E. cloacae, S. marcescens, C. freundii 및 C. koseri 510주중에서는표현형시험으로 319주가 ESBL 생성균이었고, 분자방법으로 288주가 bla TEM-1 양및 / 혹은 bla SHV-1 양유전자양성이었고, 28주는 bla CTX-M 양성이었다. Phoenix ESBL 시험으로는 ESBL 생성
319주모두가검출되어서표현형에의한검출과비교할때, 민감도는 100%, 특이도는 99% 이었다. Park YJ 등 (2007) 은염색체성 AmpC를가진 E. cloacae, E. aerogenes, C. freundii 및 S. marcescens 균주중 ESBL 양성인 72 주 (CTX-M형 46주, TEM형 21주, SHV형 31주 ) 를대상으로 Phoenix ESBL 시험을평가하였는데, 15주만 ESBL 양성이었고, ESBL 음성인 77주중 3주는위양성이었다. Phoenix의특이성은 99% 로높지만민감도는 21% 로낮았다. Lee KK 등 (2008) 은 224주의 E. coli, K. pneumoniae, K. oxytoca 및 P. mirabilis를대상으로 Phoenix (NMIC/ID-108 Combo) 의 ESBL 검출정확성을평가하였다. 디스크법 CLSI ESBL 확인시험으로는 75주가, Phoenix 시험으로는 79주가 ESBL 양성이어서그민감도는 100%, 특이도는 97% 이었다. Phoenix로위양성인 4주중 3주는 AmpC 생성균이었다. Fisher 등 (2009) 은디스크법 CLSI ESBL 확인시험과, AmpC 검출을위한 double-disk boronic acid inhibitor 시험을기준으로 Phoenix (version 5.15A과 software 5.10A/V4.31A) 의 ESBL 검출을평가하였다. 시험된 E. coli와 K. pneumoniae는 200주중, Phoenix로는 ESBL 양성인 48주중 46주가, ESBL과 AmpC 동시생성 10주중 8주가, AmpC 생성 14주중 11주가, ESBL과 AmpC 음성 128주중 35주가양성을보였다. 즉, Phoenix로양성을보인균주의거의반은위양성이었다. Hope 등 (2007) 은 ESBL 선별방법의정확성을영국 16개병원성적을근거로평가하였다. 각 ESBL 선별방법을사용한병원수는 cefpodoxime 디스크만 (1 병원 ), cefpodoxime, CTX 및 CAZ 디스크 (9 병원 ), 한천희석법 (1 병원 ), Phoenix (2병원), Vitek 1 (1 병원 ) 및 Vitek 2 (2 병원 ) 이었다. Cefpodoxime, CAZ, CTX의한가지이상에내성인 Enterobacteriaceae 1,195 주를수집하였고, 여러 cephalosporin제와 clavulanate 복합시험및 PCR에의한 bla CTX-M 와 bla AmpC 검출로 ESBL 생성을확인하였다. 각병원이내성으로판단하여제출된균주중재시험결과 cephalosporin에감수성이었던균주의비율은디스크법사용의경우 8%, 자동화법 3%, 한천희석법 0% 이었다. Cefpodoxime 내성만시험하여내성으로제출된 372주중 256주 (69%) 는 cephalosporin에감수성또는중간이었다. 위양성비율은 CAZ 내성으로제출된 160주중 28주 (18%), CTX 내성으로제출된 122주중 18주 (15%), CTX와 CAZ 모두에내성으로제출된 496주 중 26주 (5%) 이었다. Phoenix로 ESBL 양성인 125주중 97주 (77%) 가참조방법으로양성이었고, Vitek 2로는 111주중 102주 (91%) 가양성이었다. 참조방법과비교할때위양성률은 Vitek 2가가장낮아서 111주중 9주, Phoenix는 125주중 28주이었다. AmpC 다량생성을 ESBL 생성으로잘못추정한균주수가 Vitek 2로는 10주중 4주, Phoenix로는 13주중 7주이었다. 평가대상자동화방법모두는 cephalosporin에내성이고 ESBL 양성인균주의일부를 ESBL 음성으로잘못판단하였는데, 이들균주의대부분은 CTX-M 생성균이었다. 이연구에서 cefpodoxime 디스크법은 ESBL 선별위양성결과를흔히보이지만, 한가지디스크만을사용할수밖에없을때는선별시험으로서유용하며, CTX와 CAZ 디스크를동시에쓰는방법과자동화방법은특이도가높다고하였다. Wiegand 등 (2007) 은세병원에서 Enterobacteriaceae ( 대부분이 E. coli, K. pneumoniae, K. oxytoca 및 E. cloacae) 를 50주씩모으고, 이를합하여 150주씩을다시세병원에나누어주고 3가지자동화방법의 ESBL 검출정확성을평가하였다. 균주중에는 ESBL 생성 85주와 AmpC, K1 혹은 SHV 다량생성및 -lactamase 음성 62주가있었다. 이들은또한재래식방법인 disc approximation법, DDS 시험및 Etest ESBL도평가하였다. 참조방법으로는 -lactamases의생화학적및분자특성을사용하였다. ESBL 검출의민감도는 Phoenix (version 4.05W; GN Combo 448541) 가가장높아서 99% 이었고, 이어서 Vitek 2가 86%, MicroScan이 84% 이었다. Phoenix ESBL 시험의민감도가높은것은 cefpodoxime, CAZ, Ceftriaxone 및 CTX가들어있기때문이었다. 특이도는 Phoenix가 52% Vitek 2 (clavulanate가없는 AST N020, software 3.02) 가 78% 이었다. 재래식방법중에서는 DDS 시험의특이도와양성예측도가가장높아서각각 97% 와 98% 이었다. 이연구자들은반자동화방법은특이도가낮으므로 ESBL 양성을보이면재래식방법으로확인할것을권장하였다. MicroScan (Neg/BP/Combo 30-B1017-306E combination) 의 ESBL 검출민감도는 84% 이었다. Lab-Pro system, version 1.12에는 CLSI가권장하는 ESBL 선별용농도인 cefpodoxime 4 μg/ml과 CAZ 1 μg/ml가들어있다. MicroScan expert system은 CAZ 감수성수준을근거로 K1 다량생성균과 ESBL 생성균을구별한다. 이연구에서 MicroScan은 ESBL 생성 K. oxytoca 모두를
정확히검출하였으나, K1 다량생성균주 8주중 7주를 ESBL 양성으로잘못판단하였고, K1일가능성을지적하지않았다. Carbapenem 내성검출 Anderson 등 (2007) 은 KPC 생성 Enterobacteriaceae 31주와 KPC 음성인 45주 (carbapenem 비감수성 5주포함. ESBL 등생성 ) 를써서 BMD ( 자가제조 cation 조절 Mueller-Hinton broth 사용 ), 디스크확산법, Etest, MicroScan NM32 및 Vitek 2 AST GN14의 meropenem (MEM), imipenem (IPM) 및 ertapenem (ETM) 내성검출성적을비교하였다. KPC를생성하여 carbapenem의 MIC가 >1 μg/ml인균주검출민감도는 ETM, IPM, MEM의순으로높았다. IPM을쓸때의민감도와특이도는각각 BMD가 100% 와 93%, Etest가 90% 와 89%, Vitek 2가 94% 와 89%, MicroScan이 100% 와 93% 이었다. Carbapenem에내성을보인세균이 carbapenemase를생성하는지확인하려면 modified Hodge 시험을쓸수있다고하였다. Bulik 등 (2010) 은 modified Hodge 시험에의해 bla KPC 양성으로판단된 K. pneumoniae 46주를써서 4 가지방법에의한 MEM의 MIC 시험정확성을비교하였다. CLSI BMD법으로 MEM에감수성인균주는 0%, 중간은 2.2%, 내성은 98% 이었다. BMD의 MEM MIC와비교할때일치율은 MicroScan이 96% 로가장높았고, Etest는 83%, Vitek 2는 30%, Sensititre는 26% 이었다. KPC 생성 K. pneumoniae에대한 MEM의 MIC는시험방법에따라서다를수있으므로정확한 MIC를알아야할때는확인시험을권장하였다. Woodford 등 (2010) 은 carbapenem 내성이면서 carbapenemase 생성 39주와 carbapenemase 음성 16주의 Enterobacteriaceae를써서 3가지방법의 carbapenemase 생성경고 (warning) 정확성을평가하였다. Carbapenemase 생성경고민감도는 Phoenix NMIC/id-76 ( 시험범위 : ETM 0.25-1, IPM과 MEM 1-8 μg/ml) 가 100%, MicroScan NM36 ( 시험범위 : ETM 0.5-4와 IPM 및 MEM 1-8 μg/ml) 가 85%, MicroScan NBC39 ( 시험범위 : ETM 2-4와 IPM 및 MEM 2-8 μg/ml) 가 82%, Vitek 2 AST N-054 ( 시험범위 : ETM 0.5-8과 MEM 0.25-16 μg/ml) 가 74% 이었다. Carbapenemase 생성경고의특이도는 Phoenix 가 0%, MicroScan NM36가 6%, MicroScan NBC39이 19%, Vitek 2가 38% 로모두낮았다. ( 주 : Carbapenem 내성은 carbapenemase 생성이외의기전때문이므로특이성이낮은것은당연하다.) OXA-48 생성균의검출율은높지않았으나모든방법이 KPC 생성균을검출하였고, MBL 생성균대부분을검출하였다 ( 표 1). 이들방법으로는 carbapenem에비감수성인 Enterobacteriaceae 균주의 >90% 를검출할수있으나, 그성적은 Phoenix > Vitek 2 = MicroScan NMC36> Micro- Scan NBC39의순이었다. Carbapenemase 생성추정의정확성은 Phoenix > MicroScan NM36 > MicroScan NBC39 > Vitek 2의순이었다. ESBL 양성이고 porin 소실인 E. coli/klebsiella spp. 10주와 AmpC/ESBL 양성이고 porin 소실인 Enterobacter spp. 6주모두가 Phoenix로는양성이었고, Vitek 2로는각각 8주와 2주만이양성이었다. 맺음말 : 자동화방법의정확성은기기와 software의종류, expert system의특성, 시험항균제의가지수, 특이한 ESBL 시험의유무, 중요항균제포함여부 ( 예, ESBL 시험시 cefpodoxime과 cefepime), 시험대상균주에따라서달라진다. 여러가지문제점이있지만 expert system이딸린자동화방법을쓰는것은검사의질을높이고, 결과해석을개선하며, 검사자에게교육이된다. [ 참고문헌 (1) Winstanley T, Courvalin P: Expert systems in clinical microbiology. Clin Microbiol Rev. 2011;24:515 56] 표 1. 상품화방법에따른 Enterobacteriaceae의 carbapenemase 생성추정 Phoenix MicroScan NM36 MicroScan NBC39 Vitek 2 기전 ( 균주수 ) 양성 음성 양성 음성 양성 음성 양성 음성 KPC (8) 8 0 8 0 8 0 8 0 MBL (IMP, VIM 또는 NDM) (20) 20 0 19 1 20 0 16 4 OXA-48 (11) 11 0 6 5 4 7 5 6 E. coli/klebsiella spp., ESBL, porin 소실 (10) 10 0 10 0 8 2 8 2 Enterobacter spp., AmpC/ESBL, porin 소실 (6) 6 0 5 1 5 1 2 4
Carbapenemase 생성 Enterobacteriaceae 검출방법의평가 Carbapenemase 생성세균의검출이특히다른 내성기전을함께가진세균에서는어렵다. Seah 등 (1) 은 Enterobacteriaceae 균주에서 carbapenemase 검출을위한 modified Hodge test (MHT), chromogenic agar (Colorex KPC) 및 -lactamase 저해제를쓰는방법 ( 저해제방법 ) 의정확성을 평가하였다. 평가에는 -lactam 제내성의기전이 다양한 77 주를사용하였다. Enterobacter spp. 는 염색체성 AmpC 다량생성과세포막불투과성 (AmpC + imp) 으로인해 carbapenem 내성을보일 수있으므로여러가지 Enterobacter spp. 27 주를포함시켰다. -lactam 제내성기전인 MHT 는 meropenem (MEM) 과 ertapenem 디스 크를써서시험하였다. 저해제방법은 MEM + dipicolinic acid (M-DPA), MEM + aminophenylboronic acid (M-BA), MEM + cloxacillin (M-CLX) 디스크를사용하였다 (Giske 등, CMI 2010;17:552). 그해석은 MEM 의억제대보다 M-BA 억제대가 4 mm, M-CLX 나 M-DPA 억제대가 5 mm 크면 양성으로판독하였다. M-BA 시험만양성이면 serine (class A) carbapenemase 생성으로, M- DPA 양성은 metallo- -lactamase (MBL) 생성으로, M-BA 와 M-CLX 양성이면 AmpC 다량생성과 투과성감소로해석하였다. MHT 로는 class A carbapenemase 생성균모두 가검출되었으나, AmpC + imp 인균주도양성을 보여서그특이성이낮았다. Enterobacter spp. 26 주모두는 Colorex KPC plate 시험이양성이 었다. 저해제방법으로는 class A carbapenemase 생성 E. cloacae 4 주모두가검출되었고, IMP, VIM, NDM 생성이외의새로운 MBL 을 2 균주에서 검출할수있었다 AmpC + imp 가 8 주중 4 주 에서만검출된것은염색체성 AMP-C 의발현수준 이균주에따라서달랐기때문으로추정되었다. E. coli 는 13 주가시험되었는데 MHT 와 Colorex KPC plate 법으로는 carbapenemase 양성주 4 주가 검출되었다. 그러나 plasmid 성 AmpC 생성 2 주가 chromogenic agar 에증식하였다. MBL 인 VIM-1 생성 2 주와 NDM-1 생성 1 주가 M- DPA 에서분명한양성이었으나, OXA carbapenemase 인 OXA-48 생성균은양성반응을보이지않았다. 여러 -lactam제내성기전을가진 K. oxytoca 1주와 K. pneumoniae 26주가시험되었는데, MHT 로는 carbapenemase 생성균만양성이었으나, Colorex KPC로는다른기전인균주도양성을보여서 그특이도가낮았다 ( 표 1). 저해제방법으로는 KPC와 GES-5 생성균모두가검출되었고, 또한 NDM-1 생성 1주가 검출되었으나 OXA-48 생성균은검출되지않았다 K. pneumoniae 1주는 M-CLX에양성반응을 보여서 plasmid성 AmpC 생성이추정되었다. 다른 1주는 M-DPA 양성이었고, MBL 생성이 Etest로 확인되었다. 시험된나머지균종 ( 총 11주 ) 은 P. stuartii, P. rettgeri, Salmonella sp. 각 1주, C. freundii와 M. morganii 각 2주및 S. marcescens 4주이었다. MHT로 class A carbapenemase 생성균모두가 검출되었으나, NDM-1 생성 M. morganii는검출 되지않았다. Colorex KPC agar에서는 11주모두가 증식되어그해석이어려웠다. 저해제방법은 carbapenemase 검출결과가모두정확하였다. 이연구결과를요약하면다음과같다. MHT는 CLSI가현재권장하는 KPC carbapenemase 검출 방법인데, 이연구에서 MHT는 K. pneumoniae와 E. coli에서 carbapenemase을 검출하기에 민감한 방법이었다. 다른연구자는 CTX-M 생성과함께 투과성감소인세균이위양성을보임을보고한바 있는데, 본 연구에는 이러한 균주가 시험되지 않았다. 적어도 1가지이상의 carbapenem에대해 감수성이 Enterobacter spp. 는여러균주가 MHT 시험에위양성을보였다. 더욱중요한것은 NDM-1 생성 M. morganii 1주가위음성을보인것이다. 표 1. 유전형과비교할때의시험된방법의정확성 균주 방법 민감도 특이도 양성음성예측치예측치 Enterobacter MHT 1 0.73 0.33 1 Colorex 1 0.50 0.15 1 spp. IM 1 1 1 1 E. coli MHT 1 1 1 1 Colorex 1 0.82 0.67 1 IM 0.80 1 1 0.90 Klebsiella MHT 1 1 1 1 Colorex 1 0.54 0.56 1 spp. IM 0.93 1 1 0.93 Other MHT 0.88 1 1 0.80 MHT Colorex 1 0.50 0.64 1 IM 1 1 1 1 MHT, modified Hodge test; Colorex, Colorex KPC selective agar; IM, inhibitor method.
Colorex KPC는 carbapenem 내성그람음성간균의검출과예비동정을위한배지이다. 시험된 carbapenemase 생성균 29주와비생성균 39주모두가 Colorex KPC에증식하였다. 이균주들은저하되었거나내성이었다. 저해제방법은 KPC-2, KPC-3, GES-5, IMI-1, NMC-A, NDM-1 및 VIM-1 생성균을검출하고, AmpC + imp 균주와감별하였다. 따라서이방법은모든 class A와 MBL을검출할수있는가장정확 한방법이지만, class D (OXA) carbapenemase 저해제는아직없어서정확한검출이어렵다. [ 참고문헌 : (1) Seah C, Low DL, Patel SN, Melano RG: Comparative evaluation of a Chromogenic Agar Medium, the modified Hodge test, and a battery of meropenem-inhibitor discs for detection of carbapenemase activity in Enterobacteriaceae. J Clin Microbiol 2011;49:1965-9] 세균유전체연구는빠른데새항균제발견은왜어려운가? 놀랍도록넓어지는분자생물학적지식에도불구하고새로운항균제개발이왜어려운지에대한종설 (1) 을요약하여소개한다. 항균제내성세균에대한대책중에서가장중요한것은현존내성기전에영향을받지않고항균력을발휘하는새로운항균제를개발하는것이다. 항균제를적절히사용하고위생상태를개선해도내성세균의출현과확산을완전히예방할수는없다. 위중한병원내감염환자나면역부전환자는감수성인세균에감염되어도사망할수있다. 세균유전체전체의염기서열이밝혀진것은현재 1000 이상이고, 이자료가항균제발견에이용될수있다. 표현형에의존해새로운항균제를찾아내기보다는세균의표적에작용하는새로운항균제후보물질을찾아낼수있다고생각했었다. 이러한생각을하게된것은아직알려지지않은많은항균제의표적을세균유전체에서밝힐수있을것으로믿었기때문이다. 그러나새로운표적을찾으려고상당한노력을하였으나새로운항균제의후보물질을찾아내는큰성과는없었다. 예를들면 GlaxoSmithKline 회사는 1995 2001 년에 S. aureus, S. pneumoniae 및 H. influenzae의유전체에서중요하다고생각하는 350가지의유전자를선택했는데, 이중 127가지는이들세균에필수적인것이었다. 이중 67가지에대해서 260,000-530,000 가지화합물의항균력을시험하였으나, 1가지화합물의개발만이진행되고있다. 이화합물은 fatty acid 생합성저해제인데, 그표적은 FabI (enoyl-acyl carrier protein [ACP] reductase) 이다. 그러나여러중요병원성세균은 FabI 이외의효소가 enoyl-acp reductase 기능을하므로 ( 예, S. pneumoniae의 FabK, P. aeruginosa의 FabV) 그항균범위가좁다. 그후보물질인 AFN-1252는 S. aureus 감염치료용경구제로제1상연구가진행중이다. Cubist 회사는 aminoacyl-trna synthetase 17 가지에대한 50,000 가지의화합물의작용을시험하였으나성공하지못하였다. 다른회사들도 target-related high throughput screening (HTS) 방법으로유사한결과를얻었으며, 따라서이러한방법에의한표적선별이과학적으로나경제적으로나효과가적다는결론을내렸다. 표적을근거로한 HTS approach가예상과달리성공하지못한까닭을알게되었다. 그까닭은표적자체때문이기도하고, 표적의선택방법때문이기도하고, 선별방법때문이기도하고, 저해제로사용한화합물때문이기도하였다. 즉, 전에는생각하기를새로운아직모르는 broad-spectrum 표적이많을것으로생각했으나, 그렇지않았다. HTS 법이항균제개발연구에유효하지않음을알게되자, 회사들은다른방법에관심을갖게되었다. 큰회사몇곳은항균제개발에서손을떼었고, 대신에중소회사들이이일에참여하게되었다. 합성으로는새로운항균제후보물질을얻기어려움을알게되자. 천연물질에대한관심이높아졌다. 이는현재사용되는항균제 class의 3/4이천연산물에서유래된것임을생각하면이상한일이아니다. 천연산물은합성산물보다구조가다양하고, 기능이복잡하며, 분자구조가훨씬다양하다. 대부분의천연항균물질의항균활성이합성물질보다강한까닭은항균제생성세균의진화는수백만년에걸쳐서다른미생물과경쟁하면서
이루어졌으므로이상한일이아니다. 전문가들의추정에의하면미생물의서식처는다양하므로, 미생물이생성하는항균제중의극히일부만을사람이발견하였다. 현재알려진항균제의대부분은배양하기쉬운 Streptomyces 균종이생성하는것이고, 또한 Streptomyces 균종이생성하는아직발견안된다수의항균제가있을것으로 추정된다. 따라서이치에맞는새로운항균제발견방법은새로운기술을이용해서천연항균제후보물질을찾는일일것이다. [ 참고문헌 (1) Brötz- Oesterhelt H, Sass P: Postgenomic strategies in antibacterial drug discovery. Future Microbiol 2010;5: 1553 79] Macroevolution 과 microevolution Macroevolution은종 (species) 이달라지게하는큰유전적변화를뜻하고, microevolution은한종에서생기는작은유전적변화를뜻한다고요약할수있다. Sokurenko의비유를겻들인친절한설명 (1) 을요약한다. 애완견인치와와와 Great Dane은그모양이아주다르지만모두 Canis lupus 한종에속한다. 또한개와늑대는아종 (subspecies) 이다를뿐모두한종에속한다. 개는사람이수천년간인위적으로선택했기때문에그외모나습성이판이한것이생겼다. 이결과는돌연변이가한세대에서다음세대로전달됨을, 즉유전됨을뜻한다. 다윈은한개체중에변이가생기고, 이변이가유전될수있다고하였다. 한종의생물에서크기나모양, 또는습성이다른개체가출현 (emergence) 하는것을 microevolution이라고한다. 한종에서일어나는변이가자연적으로선택되어서원래의종과는동계교배 (interbreeding) 가안될정도로달라지면새로운종으로분류되고이를 macroevolution이라고한다. 진화론을인정않는사람은자연적인선택으로새로운종이생긴다는것에의문을갖는다. 그러나 microevolution에대해서는반대의견이적다. Microevolution으로병원성세균이달라짐을볼수있다. 한균종의세균에있어서도병을일으키는능력은많이다르다. 가장잘알려진 E. coli를예로들면, 이세균은사람의대장에많이있지만아무런해도끼치지않는다. 심지어건강을위해 E. coli 캡슐을먹도록권하기도한다. 그러나 E. coli는설사, sepsis, 요로감염등여러감염을일으키기도한다. Shigella는 E. coli에분류해야함이인정되고있으나이세균 10개만먹어도설사를일으킨다. 사람의몸은조단위 (trillion) 의세포로이루어졌고, 생리학적성상과습성이단세포생물인세균보다대단히복잡하다. 그러나사람과세균에는비슷한두가지점이있다. 그중한가지는사람이나세균은새로운서식처를집요하게탐색하여새로운다른환경에빠르게적응한다. 세균이주변에퍼질수있는것은그크기가작아서흐르는물과함께, 바람에날려서, 동물의발이나새의날개에묻어서, 사람의손이나입술에붙어서이동하기때문이다. 세균은사람몸의미세한구멍을통해서도들어갈수있고, 백혈구등세포에들어가서다른부위로이동할수도있다. 사람과세균의또다른유사점은적응성 (adaptability) 이다. 사람은여러도구를만들어서새로운환경에서살아남아인구를늘린다. 따듯한의복과신발은사람이추운지방에서살수있게하였다. 세균은도구를만들어서적응하지못하므로유전적방법으로적응한다. 세균의유전적적응방법에는두가지주된기전, 즉유전자수평전이 (horizontal gene transfer) 와돌연변이 (mutation) 가있다. 세균은유전자수평전이로새로운유전자를다른세균으로부터얻는다. 사람으로치면도구를만들지않고만들어진도구를얻는격이다. 유전자수평전이는세균에서흔히볼수있는적응기전이지만, 다른생물에서는흔히볼수없다. 세균은 bacteriophage, plasmid 혹은 chromosomal island 로부터수평전이에의해서새유전자를얻는다. 유전자의수평전이로인해같은종의세균중에성상이다른균주가나타나게되며, 유해한세균이생기기도한다. 즉, 수평전이로얻은유전자는사람세포를침습, 면역세포의방어작용에저항, 조직부착, 혹은독소생성으로사람세포손상등을일으킬수있게한다. 두번째기전인적응, 즉돌연변이는이미가지고있는유전자가달라짐을뜻한다. 유전자의수평전이는세균에서흔하지만, 돌연변이는바이러스에서사람에이르는모든생물에서관찰된다. 일부돌연변이는규모가커서, 한번에한개이상의유전
자가중복 (duplication) 되거나소실 (deletion) 된다. 그러나대부분의돌연변이는규모가작아서한개의 nucleotide가변한다. 돌연변이는새로운변화를일으키는주된원인이고, microevolution과 macroevolution의기본이된다. 예를들면유인원에서사람으로의진화는많은돌연변이가장기간에걸쳐선택되었기때문일것이다. 돌연변이로인한변화는한종에도축적된다. 대부분의돌연변이는개체에게아무영향을안주지만일부돌연변이는개체에게유익하거나해가된다. 사람에있어서는돌연변이로인한해로운결과, 예를들면유전병이생기거나. 감염병에걸리기쉽게되는것이관심의대상이다. 반대로병원성세균에있어서는세균에게유리한돌연변이가우리의관심이다. 세균의작은돌연변이가항균제에내성을나타내게한다. Adaptive mutation이 microevolution에있어서중요하다. 고등생물에서는 adaptive mutation으로인한변화가관찰되기어렵지만, 세균은증식이빨라서돌연변이가일어나기쉽고, 또한돌연변이가관찰되기쉽다. 병원성세균의돌연변이는감염을일으킨환자안에서도일어날수있다. 즉, 돌연변이로세균은독소를더많이만들거나, 항균제내성을나타내게된다. 장내세포부착에필요한 E. coli 단백질의구조가달라지면요로세포부착능이 10배로높아져서요로에서제거되기어려워지고, 방광과신장에감염을일으키기쉬어진다. 이 adaptive mutation은세균의 DNA가조금바뀜으로써서식환경이장에서요로로달라지는예이다. 새환경침입에성공하면세균은그곳에적응하게된다. 예를들면소의병원균이고사람에게는병원성이약한 Mycobacterium이, 적응에의하여완전히다른균종인사람의병원균인 M. tuberculosis가생겼다고추정된다. 다시말하면한균종안에서일어나는 microevolution으로서식처가달라지고, 이것이균종이달라지는 macroevolution의기초가된다. [ 참고문헌 : (1) Sokurenko E. Microbes and microevolution. Microbe 2011;6:127-30] Macroepidemiology 와 microepidemiology 역학 (epidemiology) 의좁은뜻은감염병의발생 빈도와그원인을규명하여예방하려는과학의한 분야이다. 역학을 macroepidemiology 와 microepidemiology 로구별한다. 일반적으로 macroepidemiology 는장기간과, 넓은지역에걸친역학 연구를뜻하고, microepidemiology 는단기간에걸 친역학연구를뜻한다. 이해에돕기위한예를든다. 어느지역에서장기 간에생긴모든나병에관한역학연구를 macroepidemiology 라고하였고, 나균의형을시험하는 것을 microepidemiololgy 라고하였다 (1). 임균 감염연구에있어서장기간에걸친전세계적인 macroepidemilogy 연구하려면보존도가높은 염색체성 housekeeping gene 들의염기서열분석이 중요하고, 따라서 multilocus sequence typing (MLST) 이적절한방법이다 (2). 임균감염의 microepidemiology 연구를위해서는쉽게변이 하는유전자를대상으로하는 N. gonorrhoeae multiantigen sequence typing (NG-MAST) 이나 porb ( 외막 porin 유전자 ) 의염기서열분석등이 적절하다. 그러나 pulsed-field gel electrophoresis (PFGE) 나 Opatyping 이유용한경우가있다. 임균 에는 11 개의 outer membrane opacity protein 유전자 (opa) 가있는데, 이를 PCR 로증폭하고, 제한효소로절단하여형을정하는방법이 Opatyping 이다. [ 참고문헌 : (1) The Leonard Wood Memorial Research Centre in Cebu, Philippines, Rechearch into macro- and micro-epidemiology of leprosy 2011-2013; (2) Unemo M, Dillon JAR. Review and international recommendation of methods for typing Neisseria gonorrhoeae isolates and their implications for improved knowledge of gonococcal epidemiology, treatment, and biology. Clin Microbiol Rev 2011;24:447-58] NDM-1 등 9 가지 -lactamase 를가진 Citrobacter freundii Yong D 등 (AAC 2009;53:5046) 이새로운 MBL 인 NDM-1을보고한것은 2009년인데, 그후 NDM-1을가진다른균종도여러나라에확산되고있다. Poirel 등 (1) 은요검체에서분리된 C. freundii에서 NDM-1을검출하였는데, 이균주는 fosfomycin과 colistin에는감수성이었으나, VIM-4, OXA-181, CTX-M-15, OXA-1,
OXA-9, OXA-10, TEM-1 및선천성 CMY의 8가지유전자도가지고있었으며, 또한모든 aminoglycoside에내성을나타나게하는 16S RNA methylase 유전자 arma도가지고있었다. 이환자는인도에서수술을받은후프랑스병원에전원되었었다. [ 참고문헌 : (1) Poirel L, Ros A, Carricajo A, Berthelot P, Pozzetto B, Bernabeu S, et al.: Extremely drug-resistant Citrobacter freundii isolate producing NDM-1 and other carbapenemases identified in a patient returning from India. Antimicrob Agents Chemother 2011;55:447-8] 인도병원에확산된 NDM-1 NDM-1가처음발견된인도에이유전자를가진세균이얼마나흔한지궁금하다. 북부인도의한병원에서 2010년에분리된일련의 780주중 54주 (6.9%) 에서 NDM-1이검출되었다. 균종별로는 E. coli 528주중 30주, K. pneumoniae 126주중 12주, Citrobacter spp. 84주중 12주가 NDM-1 양성이었다. E. aerogenes 22주, P. mirabilis 11주및 M. morganii 9주는음성이었다. NDM-1 생성균주의 35.1% 는 ICU 환자에서분리되었다. NDM-1 양성균주중 27주 (50%) 는 ertapenem에, 26주 (48.1%) 는 imipenem에 16주 (29.6%) 는 meropenem에감수성을보여서그검출이어려움을보였다. [ 참고문헌 : (1) Seema K, Sen MR, Upadhyay S, Bhattacharjee A: Dissemination of the New Delhi metallo-β-lactamase-1 (NDM-1) among Enterobacteriaceae in a tertiary referral hospital in north India. J Antimicrob Chemother 2011;66:1646-7] 아시아국가지역사회와병원에 MRSA 확산 세계여러나라의지역사회에서 MRSA 감염이보고 되고있다. Song JH 등 (1) 은아시아 8 개국병원에서 2004-2006 년에분리된 S. aureus 를써서그역학을 규명하였다. 전체 S. aureus 중 MRSA 의비율은지역사회연관 (community-associated, CA) 감염분리주의 25.5% ( 최저태국 2.5%, 최고스리랑카 38.8%) 와의료연관 (healthcare-associated, HA) 감염분리주의 67.4% ( 최저인도 22.6%, 최고스리랑카 86.5%) 이었다. 우리나라결과만을볼때, CA MRSA 의 47.8% 가 SCCmec II 와 III 형 ( 전형적인 HA MRSA) 이었고, HA MRSA 의 18.8% 가 SCCmec IV 형 ( 전형적인 CA MRSA) 이었다. 이연구는아시아여러나라의지역사회 에서 MRSA 감염이생기고있으며, CA-MRSA clone 이 병원에퍼지고, HA-MRSA clone 이지역사회에퍼지고 있음을시사한다고하였다. [ 참고문헌 : (1) Song JH, Hsueh PR, Chung DR, Ko KS, Kang CI, Peck KR et al.: Spread of methicillin-resistant Staphylococcus aureus between the community and the hospitals in Asian countries: an ANSORP study. J Antimicrob Chemother 2011;66:1061-9] Ceftriaxone 내성임균일본에서최근에분리된임균의 ceftriaxone 내성수준은전세계에서가장높았음이보고되었는데 (1), 그균주의 serovar는 Bpyust, MLST sequence type (ST) 은 ST7363, N. gonorrhoeae multiantigen sequence type (NG-MAST) 은새로운 ST4220이었습니다. 임균감염의역학적연구를위한 serovar 등형에대해물은분께다음회신을드립니다. 다른세균의경우와마찬가지로임균을구별하는형은여러가지가있습니다. 표현형에의한형에는항균제감수성양상, auxotype, serovar가있습니다. 표현형은대부분유전형보다유용하지않지만 serovar는유용하다고합니다. 임균의 serovar는 protein I이라는막단백질에따라서 protein IA는 serogroup WI, protein IB는 serogroup WII/III로분류하고, 각군은각각 6 가지와 9 가지 serovar로구별됩니다. Serovar는 Phadebact GC serovar 시약을써서응집반응으로알아냅니다. 일본분리 ceftriaxone 내성균주의 serovar는 Bpyust 이었는데, 그이름의 B는혈청군 WII/III에속함을뜻하고, pyust는 p, y, u, s 및 t 항원을검출하는단클론항체시약과반응이양성이었음을뜻합니다 (2). 표현형시험보다 DNA를근거로한유전형시험이유용하여근래주로쓰이는데, plasmid 분석, RFLP, PFGE, riibotype, Opatype, porb 염기서열분석, NG-Mast, MLST 등이있습니다. 세균의형시험으로유용한것은 macroepidemilogy 및진화에관한정보를얻을수있는것들입니다. Evolution과 epidemiology에대한설명은미니사전을참조바랍니다. [ 참고문헌 : (1) Ohnishi M, Golparian D, Shimuta K, Saika T, Hoshina S, Iwasaku K, et al.: Is Neisseria gonorrhoeae Initiating a future era of untreatable gonorrhea?: detailed characterization of the first strain with highlevel resistance to ceftriaxone. Antimicrob Agents Chemother 2011;55:3538-45; (2) Coghill DV, Young H: Serological classification of Neisseria gonorrhoeae with monoclonal antibody coagglutination reagents. Genitourin Med 1987;63:225-32]