The Korean Journal of Microbiology (2010) Vol. 46, No. 1, pp. 38-45 Copyright c 2010, The Microbiological Society of Korea 부산수영공공하수처리시설에서분리된광범위항균제베타락탐분해효소 (Extended-Spectrum β-lactamase, ESBL) 유형 김군도 이훈구 * 부경대학교자연과학대학미생물학과 The Types of Extended-Spectrum β-lactamases Isolated from Suyeong Sewage Disposal Plant, Busan Environmental Corporation Gun-Do Kim and Hun-Ku Lee * College of Natural Sciences, Department of Microbiology, Pukyong National University, Busan 608-737, Republic of Korea (Received March 4, 2010/Accepted March 18, 2010) The study performed to identify the type of ESBL against strains which are producing extendedspectrum β-lactamases and isolated from sewage in Suyeong sewage disposal plant, Busan Environmental Corporation. By the standard activated sludge method, Suyeong sewage disposal plant purify living and lavatory sewage gathering from the northeast Busan and the facility purify total 550,000 tons of living sewage disposal a day. 14 strains were isolated by double disk synergy test and the third generation cepha-antibiotics test. Indole, methyl-red, Voges-Proskauer, Simmon's citrate, decarboxylasedihydrolase and sugar-fermentation tests identified as Klebsiella pneumoniae (n=4) and Escherichia (n=10). Plasmid-mediated transmission test against isolated 14 strains proved 11 strains transmitted resistance to recipient J53 (sodium azide R, ceftazidime S ). 9 strains of conjugant were expressed ESBL genes transferred from parental strain but 2 conjugants did not expressed. The type of ESBL from each strain was determined by isoelectric focusing points, DNA and amino acids sequencing. The results indicated that the types of ESBL transmitted to recipient J53 were TEM-1, the parental TEM type and SHV-12 type. Keywords: extended-spectrum β-lactamase (ESBL),,, SHV-12, TEM-1 광범위 β-lactam 분해효소 (extended spectrum β-lactamase, ESBL, EC 3.5.2.6) 를생성하는세균들은 β-lactam ring을가진항균제의 amide 결합을분해시켜 (4, 5, 23) cefotaxime, ceftazidime, ceftriaxon과같은 oxyimino β-lactam류항균제와 monobactam, aztreonam 등을불활성화시킨다. 이효소는염색체를통하여전파되기도하지만 plasmid로매개되는 TEM 또는 SHV형의 β-lactamase가대부분이며이중에서특히 TEM 형이주도가되어쉽게다른세균으로전달된다 (8, 10). 이와같은 plasmid 매개성 ESBL은 1983년독일의한병원에서분리되었고 (9, 17), 이후전세계적으로급속하게확산되어치료에많은어려움을주고있다 (17, 21). 이들은크게 Bush의 DNA 분자구조차이와 Ambuler의 β- lactamase 구조에서아미노산서열을기준으로분류된다 (1). 일반적으로 Bush 분류가널리사용되어지고있는데 TEM이나 * For correspondence. E-mail: hunku@pknu.ac.kr; Tel: +82-51-629-5613; Fax: +82-51-629-5619 SHV β-lactamase 구조에서 1-4개의아미노산치환이일어난변이형으로서구조유전자의점돌연변이 (point mutation) 가일어난것이다 (6). Bush-Jacoby-Medeiros (5, 6) 의기능적인특성에중점을둔분류에따르면기질과억제제의성상에따라 β- lactamase는크게 4개의군으로나뉜다. 제 1군은 cephalosporin 을분해하는효소로 clavulanic acid에는저해가일어나지않으며, 제 2군은 β-lactamase 저해제에의해서저해가잘일어나며제 3군은 methallo-β-lactamase로서 EDTA와 p-chloromercuribenzoate를제외한알려진모든 β-lactamase에대하여저해되지않으며제 4군은 clavulanic acid에저해되지않는 penicillin 분해효소들을말한다 (8, 9, 16). 임상에서와자연환경에서빈번하게분리되고있는 ESBL 생성균종은장내세균과 (Enterobacteriaceae) 세균중 Klebsiella 속과 Escherichia 속세균이대부분이지만 Salmonella, Enterobacter 등여러종류의장내세균군에서도다양하게분리되고있으며이들에대한약제내성기작들이밝혀지고있다 (21).
부산수영하수처리장에서분리된 ESBL 유형 39 우리나라의경우, 1990년대부터 plasmid 매개성 ESBL 생성균주가환자의여러가검물로부터분리되고있고 ESBL 유형도다양하다 (11, 13, 21). 그리고도축장이나생활하수소하천등여러자연환경으로부터도분리되고있어이미 ESBL 생성균주는자연계로확산된것으로생각되고있다 (14, 15). 본연구에서는부산지역의광범위한지역의생활하수를처리하는하수종말처리장에서생활하수속의 ESBL 생성균주를분리하고 ESBL 유형을파악하기위하여이루어졌다. 앞서언급한바와같이 ESBL 생성균주는생활주변의여러환경으로부터분리되고있기때문에인간생활과매우밀접한관계가있는하수종말처리시설을연구지역으로선택하였다. 생활하수와수세식변기의오수는절대호기성환경부터절대혐기적인다양한조건을통하여하수종말처리장으로유입되며자연계환경으로부터획득된 ESBL 유형과생성균주를가장확실하게확보할수있는조건을가지고있다. 이러한이유로부산환경관리공단에소속된 10개의하수종말처리장중의하나인수영사업소 ( 부산광역시동래구안락 2동소재 ) 를검체분리장소로선정하였다. 수영사업소산하수영공공하수처리시설은동래구와연제구, 금정구전역과부산진구, 해운대구, 수영구일부등부산광역시의동북부생활하수와수세식변기의오수가처리되며 1단계와 2단계 2개계열로나뉘어져있다. 재료및방법균주분리 2009년 8월부산수영공공하수처리시설은제 1처리장 (1단계 ; 균주번호 a) 과제 2처리장 (2단계; 균주번호 b) 의유입하수를각각의멸균된 500 ml 플라스틱채수병에받아실험실로운반하였다. 채수병에서 0.1 ml을취하여곧바로제 3세대항균제인 ceftazidime (Young-Jin Pharm., Korea) 1 μl/ml을첨가한장내세균선택배지인 MacConkey agar (Difco laboratories, USA) 에고르게도말하여 37 C에서 17시간배양하여균집락을얻었다. 이를다시 ceftazidime 1 μl/ml이첨가된 Mac- Conkey agar상에재접종하여생존여부를재확인한다음 brain heart infusion (BHIA, Difco laboratory) 평판배지에서순수분리하였다. 이후 Kligler iron agar (KIA), indole, methyl-red, Simmon's citrate, lysine arginine ornithine decarboxylase dihydrolase 시험과 10여종의당발효능검사등여러생화학검사를실시하여종수준까지최종동정하였다. 배지제조는 Difco manual (Difco Laboratories) 을따랐고균주의동정은 Ewing (7) 을따랐다. 항균제시험이중디스크확산시험 (double disk synergy test) 은 McFarland No. 0.5 농도에맞춘신선한대수기의균부유액을멸균된면봉으로적셔미리만든 3 mm 두께의 Mueller-Hinton (MHA, Difco Laboratory, USA) 평판배지에고르게도말하였다. 평판의중앙에 ticarcillin/clavulanate (75/10 μg) disk를놓고이디스크중앙으로부터각각 25 mm 떨어진곳에 cefotaxime (30 μg), ceftazidime (30 μg) 및 ceftriaxone (30 μg) 디스크를올려놓아 37 C에서 18시간배양한후 ticarcillin/ clavulanate 와해당항균제사이에투명대형성유무를확인하여상승효과를판정하였다 (13, 14). 사용된항균제는모두 BBL (Becton Dickinson, Microbiology System, USA) 제품의디스크였다. 비세파계열항균제감수성검사는 amikacin (30 μg), chloramphenicol (30 μg), erythromycin (15 μg), gentamicin (10 μg), imipenem (10 μg), kanamycin (30 μg), nalidixic acid (30 μg) 와 tetracycline (30 μg) 등 8종디스크였고이중디스크확산시험에서와같이 MHA 평판배지에균을도말하고 15분정도건조시킨다음해당항균제디스크를올려놓고 37 C에서 17시간배양후 BBL 사의판독기준에따랐다. 제 3세대항균제의최소억제농도시험은제 3세대세파계열항균제인 ceftazidime (Young-Jin Pharm, Korea), ceftriaxone (Young-Jin Pharm), cefotaxime (Young-Jin Pharm), cefuroxime (SK Chemical, Korea), amoxicillin (Sigma, Sigma-Aldrich, Korea) 과제 1세대세파계인 cephalothin (Sigma, Sigma- Aldrich) 과 penicillin계열인 ampicillin (Sigma, Sigma-Aldrich) 및 sodium azide (Shinyo Pure Chemicals Co., Japan) 였다. Amoxicillin은 1 M의 NH 4OH 용액에녹인다음증류수로희석하였고나머지항균제는증류수에녹였다. 항균제농도는 Mueller-Hinton 평판배지 1 ml 당 1/8부터 256 μg이되도록 1:1 단계희석을시켰다. 항균제효능검정기준으로사용된균주는 ATCC 25922이었고판독기준은 National Committee for Clinical Laboratory Standards (NCCLS) (18) 를따랐다. 등전점 (Isoelectric focusing, IEF) 등전점측정을위한 crude β-lactamase 추출은균을 BHI 액체배지 30 ml에접종하여 37 C에서 24시간진탕배양한후 5,000 g에서 10분간원심분리하여침전된세균을모아 3차증류수 1 ml에재부유시켰다. 이를초음파파쇄기 (Ultrasonic homogenizer 4710. Cole-Palmer Instrument Co., USA) 로 30 초간 6회분쇄하고고속원심분리기 (Hanil, Korea) 14,000 rpm 로 3분간원심분리하여상층액을새로운 eppendorf tube로옮겨 -20 C에보관하였다 (14, 15). 유리판위에 pipette을이용하여증류수몇방울을떨어뜨리고 gel support film의소수성부분을유리판에기포가생기지않도록하여부착시켰다. Polyacrylaimde gel을제조하여 (14) 적당량 (3-4 ml) 을분주하고, 분주된 gel 위에 gel support film 의친수성부분을기포가생기지않도록주의하면서부착시키고 30 cm 떨어진형광등아래에서 1시간중합시켰다. 중합이끝난후유리 gel판위에 sample template를놓고 2 μl를 loding 한후 5분간상온에서방치한다음 sample template를제거하였다. Isoelectrofocusing Chamber (Mine IEF Cell 111., Bio-Rad Co., USA) 의흑연전극에증류수로적당히습윤한상태를유지시키고유리 gel판의 gel이흑연전극에닿도록하여 100 V에 30분, 200 V에 30분, 450 V에서 60분간전기영동시켰다 (14). 전기영동이끝난유리 gel판으로부터 gel support film을분
40 Gun-Do Kim and Hun-Ku Lee 리하여 phosphate buffer (ph 7.0) 에녹인 nitrocefin (500 μl/ml, Glaxo, USA) 을 1-2 ml 정도를 gel 표면위에뿌려준후적색 band가나타나면 Wattman No. 2 여과지를 gel 위에덮어착색시키고 IEF marker 3-10 (Serva liqid mix, Germany) 로등전점 (isoelectric focusing point, IEF) 을판독하였다 (13). Marker 단백질염색과탈색은 Sambrook (24) 를따랐다. Plasmid 분리및 Polymer Chain Reaction (PCR) 를이용한 ESBL 유전자의형별분류전보에서와같이 (14, 15) BHI에서배양된균주 1 ml을 3,000 g로원심분리하여얻은침전된세균을같은양의생리식염수로재차부유시켜 3회세척하였다. 이를 plasmid의분리 kit인 Plasmid Minipreps DNA Purification kit (Injae Science Co., Korea) 를사용하여분리하였다. ESBL 균주의형별확인을위하여사용된 primer는각각 TEM-1형과 SHV-1형및 CMY-1형의보존적염기서열을이용하여 Cosmogenetech (Korea) 에서제작하였다. TEM형 primer는 Forward: 5 -ATA AAA TTC TTG AAG ACG AAA-3 Reverse: 5 -GAC AGT TAC CAA TGC TTA ATC-3 SHV형 primer는 Foward: 5 -TGG TTAT TGC GTT ATA TTC GCC-3 Reverse: 5 -GGT TAG CGT TGC CAG TGC T-3 CMY-1형 primer는 Foward: 5 -ATG CAA CAA CGA CAA TCC ATC-3 Reverse: 5 -GTT GGG GTA GTT GCG ATT GG-3 PCR은 pre-mix (Biosesang, Korea) 에해당 primer (10 pmol) 를각각 1 μl, template를 1 μl 씩넣고증류수 7 μl를넣어전체양이 20 μl이되게하였다. TEM형확인을위한 PCR 조건은 denaturation은 94 C에서 30초, annealing은 50 C에서 90초, extension은 72 C에서 60 초로하여 30 cycle을반복하였고, SHV형확인을위해서는 denaturation은 96 C에서 30초, annealing은 50 C에서 15초, extension 72 C에서 120초로하여 24 cycle을반복하였다. CMY형의확인을위해서는 denaturation 94 C 30초, annealing 60 C 60초, extention 72 C 90초로 30 cycle 중합하였다. PCR 기기는 GeneAmp PCR system 2400 (Perkin Elmer Cetus, Norwalk, USA) 를사용하였다. 얻어진 PCR 생성물을 DNA 염색제인 DMF gel stain (Komabio-Technology, Korea) 용액을 1/100로희석하여 3 μl 첨가하고 1.0% agarose gel에 loading TBE buffer 속에서 50 V로 30분간전기영동하여해당유형의 band가생성되는지를 UV 형광등아래에서확인하였다 (13, 14). 교차접합시험 (Transconjugation) 에의한내성전달 ESBL 생성이확인된균주를전달균주로하고 sodium azide 에내성인 J53 균주를피전달균주로하여교차접합시험을실시하였다 (13, 14). BHI에서배양된대수증식기중반의전달균주 0.1 ml과피전달균주 1 ml을새로운 BHI에 10 ml에접종한다음 37 C에서진탕시키지않고 18시간배양하였다. 이배양액을 0.1 ml 취하여 ceftazidime (16 μg/ml)+sodium azide (100 μg/ml) 가첨가된 MacConkey agar에고르게도말하고 37 C에서 18시간배양하여균집락생성유무를조사하였고생화학검사를실시하여피전달균주인 J53과생화학성상의일치여부를재확인하였다. 이후이균주들에대한 PCR, 전기영동등전점시험으로 plasmid에의한내성이전달되었음을확인한다음 gel extraction kit (Cosmogenotech, Korea) 로정제하여전기영동으로해당생성물을확인하고 Cosmo-genetech (Korea) 에의뢰하여염기서열을분석하였다. 염기서열분석기기는 ABI 3730 XL (Applied Biosystems, USA) 로 BigDye R Terminator v3.1 Cycle Sequencing kit를이용하여 kit의자동 DNA 서열분석순서 (automatic DNA sequencing protocol) 를따라서이루어졌다. Cycle sequencing 방법으로염기서열을해독한다음염기서열분석반응에참여하지않은형광물질로표지된 ddntp를에탄올침전방법으로제거하였다. 정제가끝난후멸균증류수나 HDF (Hi-Di Formamide) 에녹여기기에장착하여전기영동하였다 (14). 염기서열결정후, NCBI (http://www.ncbi.nlm.nih.gov) 와 BCM Search Launcher (http://searcherlaumcher.bcm.tmc.edu/) 를이용하여 Multiple Sequence Alignment, Sequence Utility 에서개시코돈을확인하고해당아미노산결정과유사도등을비교하고 ESBL 유형을분류하였다. 형별분류동정기준은 Bush와 Jacoby에의해서운영되고있는 lahey clinical study (http://www.lahey.org/temtable.asp) 를따랐다. 이와병행하여최종적인유형결정은아미노산서열분석을따랐다. 결과 ESBL 생성장내세균의분리동정 Ceftazidime (1 μg/ml) 이첨가된 MacConkey 평판배지에서균집락을형성한균주들을선택하여 BHI 평판배지에순수배양을하였고이들중이중디스크 (Double disk synergy) 확산시험결과중앙에놓여진 ticarcillin/clavulanic acid와주변에놓인제 3세대항균제사이에간섭현상을나타내투명대를형성하고전기영동결과 TEM이나 SHV 생성물을형성하는 14균주를최종실험모균주로선택하였다 (Figs. 1 and 3). 이들에대한생화학검사로균을동정한결과장내세균인 (10균주) 와 (4균주) 를얻었다. 그람염색및 oxidase 시험결과 2종모두음성을나타내었고, catalase 시험은양성을나타내었다. 의생화학적성상은다음과같았다. KIA 배지상에서 slant 부분과 butt 부분에서산을생성 (A/A) 하였고, 0.4% 한천이첨가된 nutrient 반고체배지에서운동성을나타내었다. Indole 양성, methyl-red 양성, Voges-Proskauer 음성, Simmon's citrate agar 배지상에서단독탄소원으로 citrate를이용하지
부산수영하수처리장에서분리된 ESBL 유형 41 1.5 kb 1.0 0.8 M a10 a21 a24 a26 a35 a42 a43 a44 a45 a47 b21 b31 b41 b46 Fig. 1. TEM-type of parental strains. Each lane shown the TEM-type of ESBL products produced by PCR. M, Marker; a and b, Two different collection sites. 못하였다. Lysine decarboxylase 시험양성, arginine dihydrolase 음성, ornithine decarboxylase 양성반응을나타내었다. 당발효시험은당종류에따라다양하였지만대부분의당을발효시켰다. 분리된장소는제 1단계지에서 6균주 (a21, a26, a35, a42, a43, a44) 제 2단계지에서 4균주 (b21, b31, b41, b46) 가분리되었다 (Table 1). 는 MacConkey 평판배지에서전균주가중앙이선명한적색, 주변부가투명한동심원으로집락표면에점성을띄는매끄러운 convex 형태였다. KIA 배지상에서 slant 부분과 butt 부분에서산을생성 (A/A) 하였다. Indole 음성 methyl-red 음성, Voges-Proskauer 양성, Simmon's citrate 음성, lysine decarboxylase 양성, arginine dihydrolase 음성, ornithine decarboxylase 음성이었다. 시험된대부분의당을발효시켰고 0.4% 한천이첨가된 nutrient 반고체배지에서운동성이없었다. 제 1단계지에서만 4균주 (a10, a24, a45, a47) 가분리되었다 (Table 1). 모균주의 PCR 및등전점결과 Plasmid를추출하여 PCR 생성물을확인한결과 1,080 bp 부근에서 TEM형의생성물을형성한균주는 전균주 (10 균주 ), 에서 3균주 (a10, a45, a47) 였다. SHV형의생성물 (880 bp) 을형성한균주는 에서 1균주 (a43) 였고 에서 4 균주 (a10, a24, a45, a47) 였다. 이중균주번호 a24는 SHV 단일형태였고나머지 4균주는 TEM+ SHV형이었다 (Figs. 1 and 3). CMY형의생성물은형성되지않았다. 등전점결과는다음과같았다. 10균주중 1균주 (a43) 는 pi 5.4와 pi 8.4 2곳에서생성물을형성하였고그외 9 균주는 pi 5.4에서단일한생성물을형성하였다 (Fig. 5). K. pneumoniae 4균주중 1균주 (a 24) 만 pi 8.4에서단일한생성물을형성하였고, 나머지 3균주는 pi 5.4와 pi 8.4 2곳에서생성물을형성하였다 (Fig. 5). Table 1. Boichemical properties of the strains isolated from Suyeong sewerage disposal plant Test Strain No. a10 a21 a24 a26 a35 a42 a43 a44 a45 a47 b21 b31 b41 b46 KIA A/A A/A A/A A/A A/A A/A A/A A/A A/A A/A A/A A/A A/A A/A Indole production - + - + + + + + - - + + + + Methyl-Red - + - + + + + + - - + + + + Voges-Proskauer - - - - - - - - - + - - - - Citrate, Simmons + - + - - - - - + + - - - - Lysine, Moeller's + + + + + + - + + + + + + + Arginine, Moeller's - + - - - + - - + - - - - - Ornithine, Moeller's - + - + + + + + + - + + + + Motility - + - - - + - + - - + - + - Gas from glucose + + + + + + + + + + + + + + Acid production from: Glucose + + + + + + + + + + + + + + Lactose + + + + + + + + + + + + + + Sucrose + + + + + + - + + + + + + + Mannitol + + + - + - + + + + + + + + Dulcitol + + - + - + - - - - + + + + Salicin + + + - - - - - + + + + - + Adonitol + - - - - - - - - + - - - - Inositol + - + - - + + + + + - - - - Sorbitol + + + + + + + + + + + + + + Arabinose + + + + + + + + + + + + + + Raffinose + + + + + + - + + + + + + + Rhamnose + + + + + + + + + + + + + + Species
42 Gun-Do Kim and Hun-Ku Lee M ca21 ca35 ca42 ca43 ca44 ca45 ca47 cb21 cb31 cb41 cb46 1.5 kb 1.0 0.8 Fig. 2. PCR products of transconjugant TEM-type. c designated conjugant strain, transmitted by ESBL plasmid of parental strains. 항균제감수성검사모균주에대한 3세대 cephalosporin계열과 sodium azide 항균제에대한최소억제농도 (minimal inhibitory concentration, MIC) 검사및비 cephalosporin 계열에대한디스크감수성시험을실시한결과는아래와같았다. 비 cephalosporin 계열에대한디스크감수성시험결과 는 amikacin, chloramphenicol, imipenem 등 3종의항균제에대하여전균주가감수성을나타내었고 erythromycin에는전균주가내성을나타내었다. 다약제내성유형은 1종의항균제에내성을가지는균주 4 균주 (a43, a44, b21, b46), 3종내성 2균주 (a21, a26), 4종내성 1균주 (b31), 5종 2균주 (a35, a42) 이었고 1균주 (b41) 는 3종의항균제에내성을 1종의항균제에는중등도내성을나타내었다. 는 imipenem에전균주가감수성을나타내었다. 1균주 (a47) 가 2종의항균제에내성을, nalidixic acid에중등도내성을나타내었다. 나머지 3균주는 5종의항균제에내성을나타내었고, 1종류의항균제에중등도내성을나타냈지만중등도내성을나타내는항균제는균주에따라다르게나타났다 (Table 2). 교차접합시험 (Transconjugation) 에의한내성전달검사 MIC 시험결과를토대로 (Table 2) ceftazidime (16 μg/ml) 과 sodium azide (100 μg/ml) 가첨가된 MacConkey agar 배지에서교차접합시험을실시한결과 에서 1균주 (a26), K. pneumoniae에서 2균주 (a10, a24) 등 3균주가접합자를형성하지못하였고, 에서 9균주와 에서 2균주가접합자를형성하였다. 접합자에서 plasmid를추출하여 PCR로유전자전달을확인한결과는 Fig. 2, Fig. 4와같다. 접합자를형성하기는하였지만 TEM 또는 SHV 유전자를접합자에게넘겨주지못한것은균주는 2균주로서 에서 1균주 (b21) 와 에서 1균주 (a47) 였다. 접합자를형성한 9균주 (ca21, ca35, ca42, ca43, ca44, ca45, cb31, cb41, cb46) 중 8 균주는부모가가진 ESBL 유전자를모두전달받았다. 나머지 1균주 ( ca43) 는부모가가진 ESBL 두개의유전자중한쪽 (TEM) 만 plasmid 매개에의하여전달받았다 (Figs. 1, 2, 3, and 4). 접합자 β-lactamase 등전점접합자를형성한 11균주중적어도부모의한쪽 ESBL을넘 Table 2. Antibiotics test and IEF of β-lactamase of parental strains Strain MIC test Disk test pi(s) No. AM AmC CAZ CF CRO CTX CXM SA AN C E GM IPM K NA Te a21 >256 >256 64 >256 >256 >256 >256 64 5.4 S S R S S S R R a26 >256 >256 64 >256 >256 >256 >256 32 5.4 S S R S S S R R a35 >256 >256 256 >256 >256 >256 >256 64 5.4 S S R R S R R R a42 >256 >256 64 >256 >256 >256 >256 64 5.4 S S R R S R R R a43 256 >256 64 >256 >256 >256 >256 64 5.4, 8.4 S S R S S S S S a44 256 >256 64 >256 >256 >256 >256 64 5.4 S S R S S S S S b21 >256 >256 32 >256 >256 >256 >256 64 5.4 S S R S S S S S b31 >256 >256 256 >256 >256 >256 >256 64 5.4 S S R S S R R R b41 >256 >256 256 >256 >256 >256 >256 64 5.4 S S R R S I R S b46 >256 >256 64 >256 256 >256 >256 64 5.4 S S R S S S S S ATCC 25922 4 16 1/4 16 1/4 1/4 4 - - - - - - - - - - J53 1 >256 1/4 8 1/4 1/4 16 256 - - - - - - - - - a10 >256 >256 256 >256 >256 >256 >256 64 5.4, 8.4 S R R R S I R R a24 >256 >256 256 >256 >256 >256 >256 64 8.4 S R R R S I R R a45 >256 >256 >256 >256 256 256 >256 32 5.4, 8.4 I S R R S R R R a47 256 >256 >256 >256 256 256 >256 64 5.4, 8.4 S S R S S R I S Abbreviations: AM, ampicillin; AmC, amoxicillin; CAZ, ceftazidime; CF, cephalothin; CRO, ceftriaxone; CTX, cefotaxime; CXM, cefuroxime SA, sodium azide; AN, amikacin (30 μg); C, chloramphenicol (30 μg); E, erythromycin (15 μg); GM, gentamicin (10 μg); IPM, imipenem (10 μg); K, kanamycin (30 μg); NA, nalidixic acid (30 μg); Te, tetracycline (30 μg); R, resistant; I, intermediate; S, susceptible; -, not tested
부산수영하수처리장에서분리된 ESBL 유형 43 M a10 a21 a24 a26 a35 a42 a43 a44 a45 a47 b21 b31 b41 b46 1.5 kb 1.0 0.8 Fig. 3. SHV-type of parental strains. 겨받은 9균주 ( 8균주, 1균주 ) 에대한등전점은 ca45 1균주만 pi 5.4와 pi 8.4 부근에서 2개의생성물을형성하였고나머지전균주는 pi 5.4 부근에서단일한생성물을만들었다 (Fig. 6). ESBL 유전자의염기서열분석 PCR 생성물과등전점분석결과접합자를형성한 는어미균주와접합자 9균주모두 TEM형 pi 5.4였고, K. pneumoniae는 TEM+SHV형의특성을가졌기때문에 2균주 (a21, ca21, b41, cb41) 와 (a45, ca45) 1 균주를선택하여해당 ESBL 염기서열을분석하였고그결과, TEM형의경우이들의부모효소인 TEM-1과완전히일치되었고 SHV형은 SHV-12와완전히일치되었다. 고찰 Extended-spectrum β-lactamase를생성하는장내세균은국내외를막론하고대부분임상가검물로부터얻어진것들이며 (20) 그외의환경검체등에서는자주보고되지않고있다 (2, 26). 그러나우리나라의경우부산지역의도축장이나하천수등생활환경에서이미 plasmid 매개성 ESBL 생성균들이분리되었고이들의 ESBL 유형도조사된바가있다 (14, 15). 부산지역의하수종말처리시설은부산환경공단산하수영, 강변, 남부, 녹산, 신호, 해운대, 서부, 중앙, 기장, 정관등 10 곳이있고, 본연구의검채채취지역인수영사업소산하수영공공하수처리시설은 1단계와 2단계로계열화되어있다. 1단계는주로수영과해운대라인으로일최대처리량은 286,000 톤으로 A, B, C 3개의계열로구성되어있고각계열당 12개의지로구성되어 36개의지를형성하고있다. 2단계는 A-G까지 7 개계열로구성되고각계열마다 4개지가이루어져총 28개로이루어진복층구조를가지고있으며주요처리지역이범어사- 온천천라인으로일최대처리량은 264,000톤이며일부하수는제 1단계로넘겨진다. 따라서이두곳의일생활하수처리량은총 550,000톤이다. 하수처리는표준활성슬러지공법이었다. 처리후방류수는수영강으로방류되었다. 수영사업소의원수유입구조를감안하여채수도제 1단계 ( 균주번호 a) 와제 2 단계 ( 균주번호 b) 로나누었고, 일단지로들어온하수는원수에서섞여각계열지로인위적으로나뉘어지기때문에계열별 1곳씩채수하였다. Plasmid 매개성 ESBL 생성균주는 와 가가장대표적인세균이며이두종의세균은기회감염균과원내감염균으로매우중요하다 (9, 10, 25). 우리나라에서는 TEM형의경우, 임상가검물에서 TEM-52 형이우점종으로분리되는것으로보고되었고 (10, 20), SHV는 SHV-12가우점종으로분리되고있다 (12). 도축장이나수계등인간의생활환경에서분리된 TEM 유형은 TEM 유형의모효소인 TEM-1이가장많이분리되고있다 (14, 15). 환경에서분리된 SHV형은제한된자료이지만 SHV-12가가장빈도가높게단일유형으로분리되며 (14, 15), 본연구에서도이결과와일치되었다. 환경에서분리된 SHV 유형의자료가아직많이축적되지않았기때문에 SHV-12를우점종으로말하기는어렵겠지만 SHV-12가우리나라에서분리되는 SHV 유형의우점종일가능성이높다고생각된다 (14). SHV-12는 SHV-1에서 35Leu Gln, 238Gly Ser, 240Glu Lys로치환된것으로 pi 8.2로 SHV-5a로분류되던것이었다 (19). 입원환자들에게원내감염을일으켜집단적인발병을일으키기도한다 (10). 본연구에서얻어진결과들을고찰하면다음과같다. 분리된장내세균은 와 2균종이었다. 이들두균종의생화학적성상의차이는 indole, methyl-red, Voges-Proskauer, 및 Simmon's citrate 배지에서 citrate를단독탄소원으로이용여부로쉽게구분이되며, 특히 는운동성이없는것이균의중요한생화학적특성이다 (7). 항균제 M ca21 ca35 ca42 ca43 ca44 ca45 ca47 cb21 cb31 cb41 cb46 1.5 kb 1.0 0.8 Fig 4. PCR product of transconjugant SHV-type.
44 Gun-Do Kim and Hun-Ku Lee pl 8.3 M a10 a21 a24 a26 a35 a42 a43 a44 a45 a47 b21 b31 b41 b46 M pl 8.3 SHV 5.3 5.3 TEM Fig. 5. IEF points of ESBL produced by parental strains. 감수성시험결과수영사업소산하수영공공하수처리시설에서분리된 14균주들은대부분 ampicillin이나 amoxicillin과같은 β-lactam 구조를가진 penicillin류항균제들과제 1세대 cephalosporin인 cephalothin 뿐아니라 oxyimino β-lactam류제 3세대 cephalosporin류항균제에강력한내성 (>256 μg/ml) 을획득한상태였다 (Table 2)(18). 비 oxyimino β-lactam류항균제디스크시험결과는약제에따라다양한내성을나타내었지만 kanamycin에서유래된반합성 aminoglycoside 항균제인 amikacin에서감수성을나타내었고 thienamycin에서유래된광범위 β-lactam 항균제인 imipenem에는전균주가감수성을나타내었다 (3). 어미균주의등전점 (IEF) 결과는분리된균종에관계없이 TEM의경우 pi. 5.4에서단일한생성물을형성하였다 (Fig. 1). 항균제감수성시험을토대로접합자형성확인을위한 ceftazidime 농도를 16 μg/ml, sodium azide 100 μg/ml이되도록하였다. Plasmid 매개로 ESBL 유전자가피전달체인 J53에전달되지못한 3균주를제외한 11균주가접합자를형성하였고 ( 9균주, 2균주 ), 접합자들에대한생화학검사모두피전달균주와동일한 를확인하였다. TEM형의모균주와접합자들에대한 PCR 생성물에대하여직접염기서열분석 (direct sequencing) 결과와아미노산서열분석결과이들이생성하는광범위 β-lactam 분해효소는모두 TEM-1형으로, 이 TEM-1형은 TEM-2형 SHV-1형과함께점돌연변이를일으켜수많은종류의광범위 β-lactam 분해효소를만들어내는부모효소이다 (22). 본시험결과수영공공하수처리시설에서분리된광범위 β- lactam분해효소 (ESBL) 는부모형인 TEM-1형과 SHV-1에서 3개의아미노산이치환된 SHV-12형이었고특히 SHV-12는부 산지역의여러생활환경에서가장많이분리되는단일형이다 (14, 15). 적요본연구는부산환경관리공단수영사업소산하수영공공하수종말처리장하수로부터광범위베타락탐분해효소 (ESBL, extended-spectrum β-lactamase) 의유형을파악하기위하여이루어졌다. 수영공공하수처리시설은부산광역시의동북부생활하수와수세식변기의오수가표준활성슬러지공법으로처리되며일생활하수처리량은총 550,000톤이다. 이중디스크확산검사, 제 3세대세파계열항균제에대한최소억제농도시험을통하여 14균주를선별하였다. Indole, methyl-red, Voges-Proskauer, Simmon's citrate, decarboxylase-dihydrolase 시험과당발효시험등생화학검사를통하여동정한결과 Escherichia (10균주), Klebsiella pneumoniae (4균주) 가동정되었다. 이를전달균주로, sodium azide에내성을가진피전달균주인 J53에교차접합을시켜 11균주 ( 9균주, K. pneumoniae 2균주 ) 가접합이이루어졌다. 접합자중 2균주는 ESBL 유전자를전달받지못하였고 9균주는부모로부터 ESBL 유전자를전달받았다. 등전점, 유전자서열과단백질서열분석등을통하여피전달균주인 J53에전달된유전자유형은 TEM형의모형인 TEM-1과 SHV-12형으로규명되었다. 감사의말본논문은 2007 (No. 001200200708100) 년부경대학교학술연구비지원으로수행되었습니다. pl M ca21 ca35 ca42 ca43 ca44 ca45 cb31 cb41 cb46 M pl 8.3 8.3 SHV 5.3 5.3 TEM Fig. 6. IEF points of ESBL produced by transconjugants.
부산수영하수처리장에서분리된 ESBL 유형 45 참고문헌 1. Ambuler, R.P., A.F.W. Coulson, N.M. Frere, J.M. Ghuysen, B. Joris, M. Forsman, R.C. Lebversque, G. Tiraby, and S.G. Waley. 1991. A standard numbering scheme for class A β-lactamases. Biochem. J. 276, 269-272. 2. Brinas, L., M. Zarazaga, Y. Saenz, F. Ruiz-Larrea, and C. Torres. 2002. β-lactamases in ampicillin-resistant Escherichia isolates from foods, humans, and haelthy animals. Antimicrob. Agents Chemother. 46, 3156-3163. 3. Budavari, S., M.J. O'Neil, A. Smith, P. Heckelman, and J.F. Kinneary. 1996. The Merck Index. Merck & Co., Inc., USA. 4. Bush, K. 1989. Characterization of β-lactamases. Antimicrob. Agents Chemother. 33, 259-263. 5. Bush, K., G.A. Jacoby, and A.A. Medeiros. 1995. A functional classification scheme for β-lactamases and its correlation with molecular structure. Antimicrob. Agents Chemother. 39, 1211-1233. 6. Bush, K. and G. Jacoby. 1997. Nomenclature of TEM β-lactamases. Antimicrob. Chemother. 39, 1-3. 7. Ewing, W.H. 1986. 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