감염관리를위한진단검사 관동의대진단검사의학교실 부교수이혁민
검사실의원내감염관리에서역할 ( 병원 ) 감염질환진단을위한검사 지속적인감염관리자료보고 보균자및병원환경의감시배양 역학검사
세균의분류및명칭 계 (kingdom) 문 (division) 강 (class) 목 (oder) 과 (family) 속 (genus) 종 (species) 균종 주 (strain) 균주 Staphylococcus aureus Escherichia coli Klebsiella pneumoniae Staphylococcus aureus Escherichia coli Klebsiella pneumoniae
포도알균 (Staphylococcus) 그람양성알균 ( 포도송이모양의균배열 ) Catalase 양성 ( 사슬알균및장알균음성 ) Coagulase 양성 S. aureus ( 강한병독성, 주요감염균 ) 가벼운피부감염 치명적인패혈증 정상인의 30 50% 에서비강에상재 Coagulase 음성 (Coagulase negative staphylococci) S. epidermidis S. haemolyticus S. hominis S. saprophyticus ( 가임기여성의요로감염 )
사슬알균 (Streptococcus) 그람양성알균 ( 사슬모양의균배열 ) Coagulase 음성, PYR 음성 사슬알균의분류 용혈 (Hemolysis) α, β, γ hemolysis C 항원 ( 세포벽탄수화물, Lancefield group) A, B, C, F 및 G S. pyogenes (β hemolysis, Group A) S. agalactiae (β hemolysis, Group B) S. pneumoniae (α hemolysis)
장알균 (Enterococci) 그람양성알균 ( 사슬모양의균배열 ) Catalase 음성, PYR 양성 사슬알균의아종으로분류되었으나독립 Lancefield group D 장내정상균무리 독성이약하며, 주로요로감염또는기회감염 E. faecalis, E. faecium, etc Vancomycin 내성장알균 vana, vanb, vanc, etc
장세균 (Enterobacteriaceae) 장내에존재하는정상균무리 Oxidase 음성, 포도당발효 매우다양한균속과균종 장세균의분류 정상균무리이나감염원으로작용하는균종 명백한병원균 : Salmonella, Shigella 기회감염균 : Klebsiella, Enterobacter Citrobacter E. coli 정상균무리이며감염을일으키는일은드문균종 생화학적반응및혈청학적동정
비발효그람음성간균 (Non fermentative Gram negative bacilli) 토양, 수중및사람의점막에존재하는다양한균종 Pseudomonadaceae Neisseriaceae (Moraxella, Acinetobacter) Others (Shewanella, Flacobacterium, Alcaligenes) 산소성, 그람음성막대균또는짧은막대균 Glucose non fermentative GNB Pseudomonas: 소독제나항균제에내성, 많은독소 Acinetobacter: 정착균 > 감염균 Stenotrophomonas maltophilia Burkholderia cepacia
Table 1. 주요포도당비발효그람음성간균의감염원과감염 균종감염원감염 A. baumannii P. aeruginosa 흙, 물, 가습기, 병원환경, 피부, 장내 흙, 건물바닥, 하수대, 욕탕, 비누, 소독제, 가습기, 호흡기, 꽃병, 주방기구, 피부, 장내 폐렴, 요로감염, 창상감염, 패혈증, 복막염, 심내막염, 골수염, 관절염 창상감염, 요로감염, 폐렴, 균혈증, 만성중이염 P. fluorescens 흙, 건물바닥, 욕실, 하수대, 호흡기, 비누, 혈액제제 드문기회감염 S. maltophilia B. cepacia 흙, 물, 하수, 생우유 흔한원내감염
인체의상재균 분포
감염의상호관계세숙균병원균 기회감염균 주환경 비병원균 X
병원균과기회감염균 병원균 : 분리되면대부분의경우감염균으로간주 비병원균 : 다수분리되어도병원균인경우는거의없음 기회감염균 : 미생물, 숙주, 환경의역학관계에따라감염 정상균무리 ( 상재균, Normal flora) 체표또는체내에서무리를이루어증식 ( 입속의사슬알균, 장속의대장균 ) 면역력과병독소가균형을이루는미생물 집락화 (Colonization) 정상균무리와유사 해부학적또는미생물학적으로관계없는부위에존재
세균질환의진단 병원균의감염진단 : 특정균의존재여부로진단가능 항원검사 항체검사 ( 최근 2-4주간의항체가상승 ) 배양검사 분자진단검사 기회감염균의감염진단 항체검사 ( 최근 2-4주간의항체가상승 ) 배양검사 상재균이없는부위감염 상재균이있는부위감염 ( 균의존재만으로진단불가 )
감염질환의진단
임상미생물검사의종류 검사종류 민감도 특이도 TAT 비용 직접검사법 L (>10 5 ) L H L or M Gram stain AFB stain Antigen test M H H M Antibody test M M L M 특수장비인력 X X X 배양법선택배지 / 비선택배지 (Plate) 증균배지 (Broth) H (>10 2 3 ) (<10 1 2 ) H L M O 분자유전학적검사법 PCR PCR Hybridization H (>10 1 2 ) H H H O Abbreviations: L, Low; M, Middle; H, High.
미생물검사별결과보고시간 검사종류 Minutes Hours Days Months 그람염색 10 AFB 염색 2 항원검사 60 세균배양 2 3 혈액배양 5 결핵배양 2 PCR 3 6
미생물감염질환의진단 검사종류세균결핵균 Mycoplasma Chlamydia 진균 바이러스 그람염색 O X X O X 특수염색 O O O X 항원검사 O O O 항체검사 O X O X O 일반배양 O X X O X 특수배양 O O X O O 분자진단 O O O O
그람염색 검체에서가장빨리세균확인 균종추정가능 : 그람양성및음성 염증반응판정 : 백혈구종류와수 검체의질평가 : 상피세포갯수 해석어려움 항균제, 증식이덜된또는오래된세균 그람양성이음성으로 간균이아주길어지거나공모양으로
세균의세포벽모형
그람염색 (Gram stain)
미생물모양
임상적으로중요한세균의분류 Aerobes Anaerobes Cocci Bacilli Cocci Bacilli Bacillus Propionibactrium Gram + Staphylococcus Streptococcus Enterococcus Corynebacterium Listeria Erysipelothrix Peptostreptococcus Peptococcus Eubacterium Lactobacillus Antinomyces Mycobacterium Clostrium Campylobacter Enterobacteriaceae Bacteroides Gram Neisseria Moraxella Pseudomonas Acinetobacter Veillonella (Porphyromonas, Prevotella) Vibrio Fusobacterium Hemophilus
직접검사에의한감염병진단 I 감염증및감염부위피부감염창상감염피부, 손발톱및모발감염 검사소견 그람양성구균 (GPC) 포도송이 (cluster) 사슬모양 (chain) 10% KOH 표본에서균사와포자관찰 (Hyphae, Spore) 추정미생물 Staphylococcus Streptococcus 피부사상균 위염, 위궤양 그람음성만곡된간균 (Gram negative curved rod) Helicobacter
직접검사에의한감염병진단 II 감염증및감염부위생식기감염 검사소견 백혈구내의그람음성쌍구균 (Gram negative diplococci) 추정미생물 임균 (gonococcus) 질염 Wet smear, 그람염색 : 가균사, 효모 (Pseuohyphae, yeast) Wet smear: 운동성있는편모충그람염색 : 작은그람음성간균으로덮힌상피세포 (Clue cell) Candida Trichomonas Gardenella
항원 / 항체검사 I
항원 / 항체검사 II
세균배양 세균배양시고려사항 검체접종배지의선택 배양조건의결정 : 온도, 시간, 환경 동정방법의결정 항균제감수성시험의필요성및방법 세균배양실패원인 모든세균이증식할수있는배지없음 원인균에적합한배지사용필요 항균제의사용
검체채취 검체접수 검체접종 1 일 결과보고 3-4 일 균종동정 감수성시험 집락관찰 2-3 일
배양결과의해석 상재균이없는검체 혈액, 뇌척수액, 관절액을포함한각종체액등 증식하는모든세균 : 채취시오염균배제 상재균이있는검체 객담, 요, 변및생식기검체등 상재균또는다른세균보다우세한세균의분리 동일세균의반복분리 병원균의분리
혈액배양 (Blood culture)
혈액배양의필요성 적절한항균제선택의지침제공 감염세균의종류를알고환자의예후예측 적절한감염관리지침의기초제공
채혈량 혈액배양양성율에가장중요한영향인자 균혈증환자의혈액에는소수의세균이존재 채혈량이많을수록양성율증가 2 ml 채혈과 20 ml채혈을비교 양성율이 20 50% 증가 성인 : 10 ml, 소아 : 1 5 ml를채혈하여혈액양의 10배이상되는액체배지에접종
채혈회수 3회채혈이원칙 간헐적균혈증에서 24시간내에 20 ml씩 3번배양 한검체의양성율 80% 두검체의양성율 90% 세검체의양성율 99% 연쇄구균성심내막염환자에서는두번의혈액배양을시행하면 98% 의환자가양성
채혈시기 항균제를사용하기전 간헐적균혈증 열이나기직전, 열이나기시작할때 5분간격또는서로다른부위에서동시에채혈 지속적균혈증 ( 감염성심내막염 ) 급성심내막염 : 병원성이강한세균, 즉시채혈 아급성심내막염 : 30분 1시간간격으로채혈
채혈방법 혈액배양에는다량의액체배지를사용 소량의오염세균이들어가도증식 철저한피부소독필요 (Betadine 2분 ) shunt나 catheter에서는채혈금지 체내에삽입된인공장치에는정착된세균 주사부위위쪽혈액은희석 아래쪽혈관채혈 혈액은채혈즉시배지에접종 : 호기성배양병, 혐기성배양병
혈액분리세균의임상적의의 Microorganism True Contaminant Unknown S. aureus 87 6 7 CNS 12 82 6 S. pneumoniae 100 0 0 Viridans Streptococcus 38 49 13 Enterococcus species 70 16 14 E. coli 99 0 1 K pneumoniae 100 0 0 E. cloacae 100 0 0 P. aeruginosa 96 2 2 C. albicans 90 0 10
S. epidermidis 의임상적의의 No. of sets % of positive obtained Significant Contaminant Unknown PPV (%) 1 1 0 97 3 55 1 2 5 95 3 20 2 2 60 3 37 98 1 3 0 100 0 5 2 3 75 0 25 3 3 100 0 0
호흡기검체배양 (Sputum culture)
폐렴감염의진단 감염의종류지역사회폐렴원내폐렴 연령 5 세미만 5-30 세 >60 세전연령전연령 병원체바이러스 Mycoplasma 검사종류 세균 (SPN, HIN, MCA) Chlamydia 결핵균세균 특수염색 X X O X O O 항체검사 O O O O X O 일반배양 X X O X X O 특수배양 O O O O O O (LG) 분자진단 O O O O O O
Normal flora in respiratory system Bacterial load in pneumonia 10 5 10 6 CFU/1mL of alveoli secretion Oral normal flora Total bacterial count: 10 10 10 12 CFU/mL of saliva Aerobe:Anaerobe=1:10 Aerobic bacterial load: 10 9 10 11 CFU/mL of saliva Lung secretion 1mL:Saliva 1mL =Pathogen 10 6 CFU/Normal flora 10 9 11 CFU =Pathogen 1 CFU/Normal flora 10 3 5 CFU
검체의채취 폐렴의원인균을찾기객담배양 : 폐렴진단 X 상재균이많은상부기도를통과한검체채취 상부기도오염최소화 ( 상피세포 ) 감염부위검체채취 ( 백혈구 ) 객담배양 : 낮은특이도 채취방법 침이섞이지않게깊은기침으로객담 1 3 ml를채취 여러번모은검체는부적절 ( 상재균의증식 )
객담의그람염색 객담의농부분을선택 그람염색후관찰
객담배양의해석원칙 상부기도상재균은무시 α/γ Streptococcus Enterococcus species Yeast Non pathogenic Neisseria species Diphtheroides (Gram positive rod) 상재균보다우세하게증식 / 반복분리세균 병원균 (M. tuberculosis)
객담배양의결과해석 I Gram stain WBC Many Epithelial cell Few Sputum group 5 Culture & ID Predominant Many Some Pseudomonas aeruginosa α Streptococcus Staphylococcus aureus
객담배양의결과해석 II Gram stain WBC Many Epithelial cell Few Sputum group 5 Culture & ID Predominant Many Some α Streptococcus Staphylococcus aureus Pseudomonas aeruginosa
객담배양의결과해석 III Gram stain WBC Many Epithelial cell Many Sputum group 3 Culture & ID Predominant Some Some α Streptococcus Pseudomonas aeruginosa Staphylococcus aureus
요배양 (Urine culture)
검체의채취 정상인의방광안에있는요는무균 채취할때요도의상재균에의해오염 Coagulase negative staphylococci Viridans streptococci Lactobacillus Diphtheroid 중간뇨채취 즉시검사, 2 시간이상지연되면 24 시간냉장보관
검체보관의기본원칙 가급적빠른시간안에미생물검사실접수 절대냉장금지 뇌척수액 (CSF), 혈액 (Blood) 실온보관 체액 (Body fluid) 냉장보관 상재균이있는부위 객담 (Sputum), 요 (Urine), 변 (Stool)
요채취의시기 가능하면아침첫요를채취 위음성감소 요를본후, 적어도 4 시간이지난후채취 과도한수분섭취주의 요를희석하여정량배양의해석이어려움
요채취방법 검체용기에직접채취 개인용소변기나공용변기채취금지 소아의경우기저귀에뭍은검체채취금지 검체의오염을최소화 방광안의요는무균검체 배뇨중오염 : 요도, 전립선, 피부등
Catheter urine Straight catheter (Nelaton) 무균적방법 (Aseptic technique) 으로시행 첫 15 30mL는버리고다음요를채취 Foley catheter 캘리등으로 catheter tube 차단 70% alcohol ball 등으로 catheter port 부위소독 주사기이용하여요채취 Catheter bag에들어있는요는배양금지
유치도뇨관에서요배양시검체를채취해야 하는곳은? 1 2 3 4
요배양의결과해석 요검체 환자 감염균가능성 (+) PP (CFU/mL) LE 감염균가능성 ( ) 감염균가능성추정소견 여자, 방광염 >10 2 + PP < PC 중간뇨 여자, 신우신염 >10 5 + PP < PC PP in neutrophils 남자, 요로감염 >10 5 + PC > PP >10 3 PP in neutrophils 무증상균뇨증 >10 5 PP <10 5 & PP < PC 새검체로재검 Straight 카테터모든환자 >10 2 +, Sx (+) PP <10 2, LE ( ) PP in neutrophils 유치카테터 모든환자 >10 3 ( 여러균종분리가능 ) Sx ( ) 증상없으면배양가치없음
분자진단 (Molecular diagnostics)
Polymerase Chain Reaction PCR 의용도 특정유전자의증폭 증폭효율 이론적 : 2 n (10 9,30 cycle) 실제적 : (1+e) n (10 6 ) PCR 의장점 미량의 DNA 요구 신속한결과 PCR 의문제점 매우큰 DNA는분석이어려움 알려진염기서열만가능 오염에민감 엄격한정도관리
감염질환의분자유전학적진단 임상검체에서세균의직접검출 중증감염질환 : 균혈증, 수막염 항균제투여후원인균의검출 배양이어렵거나불가능한세균의검출 성매개감염질환 : N. gonorrhoeae, C. trachomatis, T. pallidum, etc 폐렴 : L. pneumophila, C. pneumoniae, M. pneumoniae, etc 감시배양검체에서직접항균제내성균검출 단일유전자에의한내성기전검출에유용 MRSA (meca gene), VRE (vana gene)
분자진단결과의제한점 분자진단양성이모두감염질환은아님 죽은세균검출 ( 현재감염과과거의감염 ) C. trachomatis: 완치후 3 주뒤까지 PCR 양성 오염, 정착균의검출 위양성과위음성 위양성 : DNA/RNA 오염, 시발체의잘못된디자인 위음성 : 검체에존재하는억제제 내부정도관리물질필수
감염관리 (Infection Control)
원내감염의정의 입원당시에없었던혹은잠복하고있지않던감염 입원기간후 48시간이후 퇴원후 30일이내에발생하는것 퇴원후 1 개월신생아 모체수직감염을제외한분만과관련된모든감염
Table 1. 집단감염발생조사단계및검사실의역할 번호조사단계검사실의역할 1 문제인식 2 감염정의 (Definition) 감시및조기경보 ( 검사정보시스템 ) 드문내성형또는환자간전파 조사대상감염에대한정의를결정할때검사실진단에대한자문및조언 3 감염확진 조사대상감염의확인진단 4 사례발굴완료 5 감염률설정 6 집단감염특성조사 7 가설설정 원인파악및실험 대상균주특성조사 무균검체분리주및중요검체보관 사례발굴을위한검사정보시스템검색 Baseline 및의심되는 epidemic 구역별검체별감염률 역학적연관성조사 (Typing) 기존의감염균주와비교 추가적인실험또는배양시행 8 감염관리수행 필요한경우검사실수시변경 9 감염관리효과평가 지속적인감시및조기경보
원내감염의전파 매개체 =?
Table 3. Characteristics of epidemiological typing systems Typing system Proportions of strains typeable Reproducibility Discrimimatory power Ease of interpretation Ease of Performance Biotyping All Poor Poor Excellent Excellent Biotyping Antimicrobial susceptibility All Fair Poor Excellent Excellent Serotyping Most Good Fair Good Fair Bacteriophage typing Most Fair Fair Fair Poor MLEE All Excellent Good Excellent Good Plasmid resistriction digests Most Good Good Good Excellent REA All Good Good Poor Excellent Genotyping Ribotyping All Excellent Fair Good Good PFGE All Excellent Excellent Excellent Good PCR based on repeated sequences All Excellent Good Excellent Good AP PCR All Good Good Good Good Restriction digests of PCR products All Fair Good Fair Good Nucleotide sequence analysis All Excellent Excellent Excellent Fair
Biotyping and AST profile Biotyping 균종동정 : 세균의생화학적반응 동일균종내에서도일부반응다름 자동화장비 : 수십가지의생화학적반응사용 AST profile: 동일한항균제감수성양상 Disk diffusion Minor discrepancy: Intermediate S or R Microbroth dilution Minor discrepancy MIC: 1단계이내의차이는실험실오차범위이내
자동동정장비 (Vitek 2 & MicroScan) Panel 세균동정검사 (27) 세균동정검사 (27) 항균제감수성감사 (MIC 법 )
Molecular typing Molecular typing 세균의유전자를분석하여역학적연관성을규명 Molecular typing법의분류 : 분석대상유전자 Clonal spread Genome 또는특정유전자 Horizontal spread 내성유전자 Plasmid
병원균의원내전파 매개체 =?
Table 4. Commonly used epidemiological typing systems in VRE Typing system Target Interpretation Application PFGE Whole chromosome Bacterial isolates Clonal spread (Short term) MLST Multiple housekeeping genes Bacterial isolates Clonal spread (Long term) Tn1546 typing Tn1546 Resistant gene Horizontal spread Tn1546 analysis Tn1546 Resistant gene Horizontal spread PFGE: Pulsed field gel electrophoresis MLST: Multilocus sequence typing