실험 Set Up Guide 실험주제 Real Time PCR 실험원리 Quantitative Real-Time PCR (qrt-pcr) 은 1992년에도입되어생명공학에응용되기시작하였이기술은잘알려져있는 PCR기법을개량한것이다. PCR은핵산의효소증폭을이용하며, 극히적은양

실험 Set Up Guide 실험주제 Real Time PCR 실험원리 Quantitative Real-Time PCR (qrt-pcr) 은 1992년에도입되어생명공학에응용되기시작하였이기술은잘알려져있는 PCR기법을개량한것이다. PCR은핵산의효소증폭을이용하며, 극히적은양의시료를대량으로증폭할수있다는장점과그과정이간단하여 Cloning, Sequencing 등의기본기술로응용되었다. 그러나분석도구로서의 PCR은증폭된산물의정량화가불가능하다는한계점을갖고있다. 이한계를극복할수있는실험기법이 Real Time PCR 이다. 이기법은증폭되는핵산물질에형광을붙이고이형광을지속적으로검출하는방식으로이루어진다. Real time PCR에서는 PCR 증폭산물을 Real time으로모니터링하여증폭이지수적으로일어나는영역에서정량한다. PCR에서는 1 cycle마다 DNA가지수적으로증폭하다가 plateau에도달한다. 이증폭의모습을 Real time으로모니터링한그림이증폭곡선이다. 아래의모식도는 DNA 농도 ( 실제의증폭산물량 ) 를청색으로나타내고그것을형광으로검출한 signal 강도를적색으로나타내었다. PCR 증폭산물량이형광으로검출가능한양에도달하면증폭곡선이일어나기시작해지수적으로 signal이상승하다가 plateau에도달한다.

초기 DNA량이많을수록증폭산물량이검출가능한양에달하는 cycle 수가적어지므로증폭곡선이빨리나타난다. 따라서단계적으로희석한표준시료를사용하여 Real time PCR 반응을하면초기 DNA량이많은순서로같은간격으로늘어선증폭곡선이얻어진다. 여기서적당한지점에 threshold를설정하면 threshold와증폭곡선이교차하는지점 : Ct값 (Threshold Cycle) 이산출된다. Ct값과초기주형량간에는직선적인관계가있어아래그림과같은검량선을만들수있다. 미지의시료에대해서도표준시료와마찬가지로 Ct값을산출하여이검량선과대조하면초기 template량을구할수있다. 초기 DNA 양을모르는시료 전형적인 qrt-pcr 기술의응용은병원균의검출, 유전자발현의분석, Single Nucleotide Polymerase (SNP) 분석, 염색체이상의분석, Real-Time Immuno PCR 에도응용되고있다. 실험을위한준비 Real Time PCR 전용기기및전용 Tube Real Time PCR 용 primer Real Time PCR 용시약 Template Total RNA 및 cdna합성 Micropipette 및 tip

실험 Protocol [ 본 Protocol 은 2 Step Real Time PCR 을기본으로작성되었습니다.] Step1] Template Total RNA 준비및 cdna합성 Step2] qpcr A. 장치 B. 검출방법선택 C. Primer 제작 D. Real Time PCR 반응 E. DATA 분석 Step1] Template Total RNA 준비및 cdna 합성 Template Total RNA 준비 RT-qPCR 검출의민감도와정확성은 cdna의품질과양에따라달라지며, 이는분리된 RNA의 quality와 purity에따라결정된다. RNA는 DNA처럼안정한상태가아닌 single strand의불안정한상태이기때문에degradation이쉽게일어난다. 이를방지하기위한주의사항이있다. prep 전 RNA prep에사용되는모든공간, 기기, pipette 등을 70% EtOH을이용해닦아 RNase 를최대한제거. Tubes and pipette tips 등 RNA prep에사용되는모든제품은 Nuclease-free lab ware 를사용 RNA나관련시약을다룰때에는반드시 latex glove 착용 RNase-free reagents RNase inhibitor 사용 관련제품 Method Product Name Brand Cat No Solution Trisure Bioline BIO-38032 Column ISOLATE II RNA Mini Kit Bioline BIO-52072 Column ISOLATE II RNA Plant Kit Bioline BIO-52077

cdna 합성 분리된 RNA는실험 handling이어렵기때문에 Reverse transcriptase를이용해모두 DNA로바꿔사용한다. -Template RNA (total RNA 또는 mrna) -Primer (OligodT, Random, SS Primer) -RT 전용효소 -dntp -RNase Inhibitor -RT Buffer @ Primer 선택 @ -Random primer Random hexamer는 cdna 합성효율이좋고, PCR 증폭위치, mrna의 2차구조, mrna 분해등의영향을덜받기때문에 mrna 전체길이에걸쳐서효율적으로역전사반응을할수있다. -Oligo-dT primer RNA 의 3 poly(a) tail 부분부터역전사반응을실시하고자하는경우에는 oligo-dt primer 를 사용한다. - Gene specific primer 특정유전자만을검출하는경우에는유전자특이적 primer 를역전사반응에사용할수있다. 저희프리케어진과직접상의하세요. RT KIT 선택시고려사항 반응온도 : 42 ~60 까지제품별로다양하다. : mrna 2차구조는촘촘해서 RT 효소가사이에들어가합성진행하는것이어려우며고온에서합성이필요 합성길이 : -7kb~ 20Kb 까지제품별로다양함 반응시간 : 샘플량이많거나빠른실험진행을원할경우반응시간이짧은제품을선택 [ 반응시간 15 분 ~ 60 분으로다양한다.] 민감도

: Prep 이어려울수록, RNA 발현양이작을수록민감도가좋은제품을선택해야함 구성형태 : Premix Type / 별도 Vial Type RNase H : cdna 합성후 RNA 가제거되지않을경우다시 cdna 에붙어 primer annealing 저해. 관련제품 Product Name Brand Cat No SensiFAST cdna synthesis kit Bioline BIO-65053 Tetro cdna Synthesis Kit Bioline BIO-65043 M-MLV ReverseTranscriptase (200U/ul) M-biotech 19500 Step3] 검출방법선택및 Assay qpcr Process Targe Gene Selection Primer Probe Design qpcr DATA 분석 A. 장치 Realtime PCR 을하기위해서는 thermocycler 와분광형광강도계가일체화된 Realtime PCR 전용장치 가필요하다. Thermocycler 로 DNA 를증폭시키면서분광형광광도계로그증폭산물을측정해나간다. 고속으로 PCR 반응을진행할수있는기기와 96 well 을진행할수있는기기등다양하다. B. 검출방법선택및 Assay

Interchelating 방식 (SYBR GREEN) SYBR GREEN은 Double strand DNA에결합하여형광을나타내는 Interchelator임. PCR 반응으로합성된 dsdna에결합하여형광을나타냄. 모두검출하기때문에유전자별로 probe를준비할필요가없음. 저렴한비용 Sequence non-specific binding을하기때문에미세정량분석부적합함. 분석방법 : 단편이증폭되면 Melting point (Tm) 에서는급격한형광양의변화를보인다. Probe 방식 (TaqMan Probe) 5 말단은형광물질 (FAM 등 ) 로 3 말단은 quencher 물질 (TAMRA등) 로수식한 oligonucleotide를 PCR 반응액에첨가하는방법임. TaqMan probe는 annealing step에서 template DNA에특이적으로 Hybridize 하지만, probe상에 quencher에의해형광발색이억제된다. Extension 반응시 Taq DNA polymerase 가갖는 5-3 exonuclease 활성으로 template에 hybridize한 TaqMan probe가분해되어형광색소가 probe에서유리되면서 quencher에의한억제가해제되어형광을나타냄. 검출특이성이높음. Probe 설계를위한전용소프트웨어를사용또는설계가끝난 Probe를구입해서사용. 상동성이높은서열을구별하는경우, SNP typing과같은실험에적합. 가격이비싼편임. Cycling Probe 법

RNA와 DNA로이루어지는 chimera probe와 RNase H로구성된고감도의검출방법. Probe는 5 말단은형광물질로, 3 말단은 quencher 물질로표식되어있음. 이 Probe는일반적으로 quencher에의해형광을발하지못하지만, 증폭산물중의상보적인서열과 hybrid를형성한후 RNase H에의해 RNA잔기가절단되면강한형광을나타내게됨. 또 probe의 RNA부분이 mis-match되면 RNase H에의해절단되지않기때문에서열특이성이매우높은검출방법이며 SNP typing에최적임. C. Primer 디자인 Primer 디자인은 Real time PCR을성공시키기위한가장중요한요소로 PCR 증폭효율이나쁜 primer 로는고감도검출이불가능하고또 primer-dimer 등비특이적증폭이발생하기쉬운 primer로는정확한정량이어렵다. Primer 디자인전용소프트웨어를사용하여설계하거나설계가끝난것을구입해서사용할있다. Primer 디자인시고려사항 서열의상보성 Primer 내부나 primer간에 3 base 이상상보적이지않게한다. Primer 3 말단의상보성에는특별히주의한다 특이성 BLAST 검색으로 primer의특이성을확인한다 Tm값 Forward primer, reverse primer의 Tm값을비슷하게한다. Tm값계산은전용소프트웨어로실시. (Tm = 2(A+T)+4(G+C)) 증폭사이즈 80~150 bp가최적 Primer의 size 17~25 bp Primer 디자인은저희프리케어진과상의하세요!!

D. Realtime PCR 반응 기본적으로사용하는 Real Time PCR 시약의조건을준수한다. Denaturation: 주형이게놈 DNA일경우는 30초정도로함. (1분정도의열변성이필요한경우도있지만, 1분을넘는변성조건에서는결과가안정되지않을수있으므로주의가필요함.) PCR의변성단계 : Real Time PCR의 target 증폭 size는보통 300 bp 이하이므로, 5초정도로하면됨. Annealing 단계 : 반응특이성이낮은경우는온도를높이거나시간을짧게설정함. 증폭효율이나쁠경우는온도를내리거나시간을길게설정함. Extension (3 step PCR) : 신장시간을길게설정하면비특이적증폭산물이생기기쉬우므로주의가필요함. Cycle수 : Standard의경우처음에는 40 cycle에서시작하고, 필요에따라 cycle수를증감함. 관련제품 Product Name Brand Cat No SensiFAST SYBR Hi-Rox Kit Bioline BIO-92005 SensiFAST SYBR Lo-ROX Kit Bioline BIO-94005 SensiFAST SYBR No-ROX Kit Bioline BIO-98005 1 ml PrimeTime Gene Expression Master Mix IDT 1055770 E. DATA 분석 Ct값산출방법 Ct값산출방법에는반응을일으키는최소의역가 (Threshold) 와증폭곡선의교차점을 Ct값으로하는방법 (Crossing Point법 ) 외에, 증폭곡선의 2차도함수를구해그것이최대가되는점을 Ct값으로하는방법이있다 (2nd Derivative Maximum법 ). 정량 절대정량 : 표준샘플을이용해검량선을작성하여미지샘플의절대량을측정하는방법이다. *Standard curve 최소 5 개이상, Sample 이 standard curve 내에있어야한다.

상대정량 : 상대정량은유전자발현해석으로일반적으로이용되고있는유전자의발현량이미지샘플에대해 control sample에대해서얼마나증감하고있는지를분석하는방법이다. 상대정량실험에서는발현량을알고싶은목적유전자외에반드시 reference 유전자의측정도실시한다. Reference 유전자는샘플간의주형량표준화를위한것이며, 유전자발현해석실험에서는일반적으로 housekeeping 유전자가이용된다. 유전자 X: 측정하고자하는샘플 / 유전자 H: Housekeeping gene 발현량의차이를파악하기쉽도록 control 시료를 1이라고한경우의상대량을구한다. RNA 시료 A를 control시료로하고각시료의보정값을 RNA 시료 A의보정갑으로나누어상대량을구한다. [ 단, 서로다른유전자가동일시료내에서어떤중량비로발현하고있는지는정확하게구할수없음.]